实验五 真核细胞RNA的提取

实验五真核细胞RNA的提取

一．原理

本方法利用盐酸胍抑制RNA酶，匀浆裂解细胞，采用有机溶剂抽提去除蛋白质。通过选择性沉淀RNA分子去除DNA。

二．方法

1.样品处理

⑴组织样品处理：取新鲜的组织样品称重后，剪碎成约1cm2的组织块直接加入匀浆液中进行RNA提取，或液氮中速冻-70℃保存。

⑵贴壁培养细胞处理：用PBS洗细胞一次，吸干溶液后将培养板快速移至液氮中冷冻后转到-70℃保存；或加入1ml匀浆至培养板中直接裂解细胞，然后将粘稠的裂解液进一步匀浆。

⑶悬浮培养细胞处理：离心收集细胞，用PHS悬浮漂洗再田心收集，若不立即提取RNA，则可经液氮速冻后转至一70℃贮存备用。

2．加l()倍体积盐酸胍匀浆液[至准备好的样品细胞中，高速匀浆1min。

3．匀浆液5000g，室温离心10min。

4．将上清移至一个干净离心管中，加入0.1体积的3mol／L乙酸钠（PH5.2），混匀，再加5体积预冷的乙醇，立即充分混匀，-20℃放置至少2小时。

5．5000g 0℃离心10分钟沉淀核酸，弃上清液，室温干燥。

6，每个提取RNA的组织或细胞样品中，加入l0～15min盐酸胍匀浆液Ⅱ，搅拌溶解。

7．加入2.5体积预冷的乙醇，立即充分混匀，-20℃至少放置2小时。

8．5000g 0℃离心10分钟沉淀核酸，去上清，室温挥发乙醇。

9．按每克组织细胞加5min的比例．分两次加入0.02mol／L EDTA(pH8.0) 先加1／2体积EDTA振荡l～2分钟，3000g离心2min．吸出上清．再加另一个1/2体积的EDTA振荡l一2分钟．合并两次核酸溶解液。．

10．用等体积氯仿—正丁醇(4：1)抽提核酸溶液，5000g室温离心l0min，5000g 室温离心10min。吸出上清至另一个干净离心管中。

11．加3倍体积lmol／L乙酸钠(PH7.0) 混匀，-20℃放置1h以上，此时RNA将选择地沉淀，而DNA仍为溶解状况。

12．5000g，0℃离心20min，沉于管底的是RNA。

13．吸去上清，用4℃预冷的lmol／L乙酸钠(pH7．0)漂洗RNA沉淀。然后20℃5000g，离心20分钟。回收RNA。

14．尽量去除上清液。按每g组织细胞1m的比例加入RNA溶解液(0.2％SDS，0.5％mol／L EDTA，pH8.0)。注意：若有SDS沉淀析出．滴加0.11mol／L NaOH 调溶液pH至7．5。

15．加入2倍体积冰预冷乙醇混匀，0℃放置至少2小时，5000g，4℃离心10分钟，RNA沉淀用70％乙醇漂洗，短暂离心后，弃上清，室温干燥蒸发乙醇。

O溶解RNA沉淀，加入3倍体积乙醇， 16．用适当小容积DEPC处理过的ddH

2

-70℃保存RNA备用。用时．加入0.1体积的3mol／L乙酸钠，混匀，12000g，4℃离心回收RNA。

三.试剂

1．盐酸胍匀浆液Ⅰ

成分：8mol／L盐酸胍(分子量为95.6)，O．1mol／L乙酸钠(pH5．2)，5mmol／L 2—巯基乙醇，0.5％十二烷基肌氨酸钠

配制方法：取191g盐酸胍．加8.35m1 3mol／L乙酸钠(pH5．2)和6．25ml 0．2mol ／L 2—琉基乙醇溶液中，再加水至237．5ml，混匀后加12．5ml 10％十二烷基肌氨酸钠,振荡混匀溶解。

2．盐酸胍匀浆液Ⅱ

成分：8mol／L盐酸胍(分子量力95.6),0.1mol／L乙酸钠(pH5．2),1mmol／L 2—琉基乙醇，20mmol／L EDTA(pH8.0)

配制方法：取191g盐酸胍，加日．35ml 3mol／I。乙酸钠(pH5．2)和1．25ml 0．2mol ／L 2—巯基乙醇溶液中，再加入10ml 0.5mol／L EDTA(pH8.0)。加水至250ml混匀。

3.乙醇

4.70％乙醇

5.氯仿—正丁醇(4：l，体积比)

6.4mol／L乙醇钠，pH

7.0

7.3mol／L乙醇钠，pH5.2

8.RNA溶解液

成分：O．2％SDS．0.05mol／L EDTA, pH8.0

四、说明

提取RNA时，要特别注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均应用0.1％的二乙基焦碳酸盐(diethyl pyrocarbonate，DEPC)处理。塑料器材均使用一次性用品，并高压灭菌处理，必要时，也可用0.1%DEPC处理。