文档库

最新最全的文档下载
当前位置:文档库 > 实验五 真核细胞RNA的提取

实验五 真核细胞RNA的提取

实验五真核细胞RNA的提取

一.原理

本方法利用盐酸胍抑制RNA酶,匀浆裂解细胞,采用有机溶剂抽提去除蛋白质。通过选择性沉淀RNA分子去除DNA。

二.方法

1.样品处理

⑴组织样品处理:取新鲜的组织样品称重后,剪碎成约1cm2的组织块直接加入匀浆液中进行RNA提取,或液氮中速冻-70℃保存。

⑵贴壁培养细胞处理:用PBS洗细胞一次,吸干溶液后将培养板快速移至液氮中冷冻后转到-70℃保存;或加入1ml匀浆至培养板中直接裂解细胞,然后将粘稠的裂解液进一步匀浆。

⑶悬浮培养细胞处理:离心收集细胞,用PHS悬浮漂洗再田心收集,若不立即提取RNA,则可经液氮速冻后转至一70℃贮存备用。

2.加l()倍体积盐酸胍匀浆液[至准备好的样品细胞中,高速匀浆1min。

3.匀浆液5000g,室温离心10min。

4.将上清移至一个干净离心管中,加入0.1体积的3mol/L乙酸钠(PH5.2),混匀,再加5体积预冷的乙醇,立即充分混匀,-20℃放置至少2小时。

5.5000g 0℃离心10分钟沉淀核酸,弃上清液,室温干燥。

6,每个提取RNA的组织或细胞样品中,加入l0~15min盐酸胍匀浆液Ⅱ,搅拌溶解。

7.加入2.5体积预冷的乙醇,立即充分混匀,-20℃至少放置2小时。

8.5000g 0℃离心10分钟沉淀核酸,去上清,室温挥发乙醇。

9.按每克组织细胞加5min的比例.分两次加入0.02mol/L EDTA(pH8.0) 先加1/2体积EDTA振荡l~2分钟,3000g离心2min.吸出上清.再加另一个1/2体积的EDTA振荡l一2分钟.合并两次核酸溶解液。.

10.用等体积氯仿—正丁醇(4:1)抽提核酸溶液,5000g室温离心l0min,5000g 室温离心10min。吸出上清至另一个干净离心管中。

11.加3倍体积lmol/L乙酸钠(PH7.0) 混匀,-20℃放置1h以上,此时RNA将选择地沉淀,而DNA仍为溶解状况。

12.5000g,0℃离心20min,沉于管底的是RNA。

13.吸去上清,用4℃预冷的lmol/L乙酸钠(pH7.0)漂洗RNA沉淀。然后20℃5000g,离心20分钟。回收RNA。

14.尽量去除上清液。按每g组织细胞1m的比例加入RNA溶解液(0.2%SDS,0.5%mol/L EDTA,pH8.0)。注意:若有SDS沉淀析出.滴加0.11mol/L NaOH 调溶液pH至7.5。

15.加入2倍体积冰预冷乙醇混匀,0℃放置至少2小时,5000g,4℃离心10分钟,RNA沉淀用70%乙醇漂洗,短暂离心后,弃上清,室温干燥蒸发乙醇。

O溶解RNA沉淀,加入3倍体积乙醇, 16.用适当小容积DEPC处理过的ddH

2

-70℃保存RNA备用。用时.加入0.1体积的3mol/L乙酸钠,混匀,12000g,4℃离心回收RNA。

三.试剂

1.盐酸胍匀浆液Ⅰ

免费下载Word文档免费下载: 实验五 真核细胞RNA的提取

(共2页)