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SDS-PAGE原理及配方

SDS-PAGE

1)根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度,再按照下面的表格配制SDS-PAGE的

分离胶(即下层胶):

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注:如果配制非变性胶,参考上述配方,不加10%SDS即可配制成非变性PAGE胶。

1)按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶):

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TBST缓冲液

每2L体积中含:

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1)抗体去除液

每50mL抗体去除液中含:

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SDS-PAGE电泳的基本原理:

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS(十二烷基硫酸钠),SDS会与变性的多肽,并使蛋白带负电荷,由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关,因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关,在达到饱和的状态下,每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数,若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图,可获得一条标准曲线,未知蛋白质在相同条件下进行电泳,根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关;

制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择tris-HCL系统,具体作用后面介绍;

TEMED与AP:促凝作用,加速聚丙烯酰胺的凝固;

AP中含有29的丙烯酰胺和1的甲叉基聚丙烯酰胺,能产生自由氧基,使丙烯酰胺聚合。

十二烷基硫酸钠(SDS):阳离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。