微生物资源开发与利用实验指导(定)
微生物资源开发与利用
实验指导
适用于森林资源保护与游憩专业
北京林业大学森林保护学科
二零零二年8月
实验一培养基的配制及灭菌
培养基是人工配制的适于微生物生长、繁殖或保存的营养基质。培养基的种类繁多，但一般应具备以下几个条件：1.含有适宜的碳源、氮源、无机盐类、生长因素等营养成分；2.含有适量的水分；3.适宜的酸碱度。
根据培养基的成分来源不同可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基。环境微生物学中，常用废水或废水补加少量氮、磷等无机盐来培养微生物，可认为是天然培养基或半合成培养基。
根据培养基的物理性状可分为液体、固体和半固体培养基。液体培养基中加一定量的凝固剂（常加琼脂 1.5—2%）。溶化冷凝后即成固体培养基。半固体培养基含琼脂0.2—0.5%。某些工农业生产废渣及生活废渣可视为天然的固体培养基。
根据培养基的特殊用途可分为选择培养基、鉴别培养基等。选择培养基在环境微生物学中应用较广，它是根据待培养微生物的特殊营养要求或生物特征而设计的培养基，利用这种培养基可将所需要的微生物从环境混杂的微生物中分离出来。如以石油作碳源的培养基可以分离到降解石油的微生物；以纤维素为唯一碳源的培养基可以分离到纤维素分离菌。
本实验介绍培养基配制及灭菌的一般原则和方法步骤。
培养基配制的方法和步骤
1.称量：先按配方计算培养基各成分的需要量，称量时用1/100粗天平即可。在烧杯或搪瓷杯中先放少量水，依次加入培养基各组分，溶解后补足至所需的总水量。对于肉膏之类
粘、胶状物，可盛在小烧杯或表面皿内称量，以便用水移入培养基中。蛋白胨等极易吸潮物质，在盛取时应动作迅速。某些无机盐类如磷酸盐和镁盐相混合时易产生沉淀，必要时应分别灭菌后再混合。此外，生长因素及微量元素等成分因用量极少，可预先配成较浓的储备液，使用时按要求取一定量加入培养液中即可。
2.溶化：各成分必须溶解在培养液中。最好溶解一种组分后，再加第二种，有时需要加热使其溶解。如果配方中有淀粉，则应先将其用少量冷水调成糊状，再兑入其他已溶解的成分中，边加热边搅拌，至完全融化即溶液由混浊转为清亮后，补水至所需总量。
溶化琼脂时，应注意控制火力使不至溢出或烧焦，并要不断搅拌。因加热过程中水分损耗较多，最后应补足至原体积。
根据需要，有时需将溶化后的培养基用脱脂棉或纱布过滤，已使培养基清亮透明。
3.调pH值：以10% HCI或10% NaOH调节培养基至所需pH值。一般用广泛pH试纸矫正，必要时亦可用酸度计。调时需注意逐步滴加，勿使过酸或过碱而破坏培养基中某些组分。
4.分装：将矫正pH后的培养基按需要趁热分装于三角瓶或试管内，以免琼脂冷凝。分装时应注意勿使培养基粘附于管口与瓶口部位，以免沾染棉塞而滋生杂菌或影响接种操作。可以通过下边套有橡皮管及管夹的普通漏斗进行分装。
分装量视需要而定。一般分装入三角瓶以不超过其容积的一半为宜。分装试管时，斜面培养基以试管高度的1/5左右为宜，半固体培养基以试管高度的1/3左右为宜。
5.加棉塞：试管和三角瓶口需用棉花堵塞，主要目的是过滤除菌，避免污染。
做棉塞所用的棉花应是普通长纤维棉花，不要用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水变湿而滋长杂菌。棉塞制作方法有多种，主要的要求是不宜过松或过紧，应宜塞拔方便而又不易脱落为准。正确的棉塞其头部应较大，约有1/3在试管外，2/3在试管内（示范），试管以内部分不应有缝隙。
6.灭菌：在装培养基的三角瓶或试管的棉塞外面包一层牛皮纸，即可灭菌。应用铅笔注明培养基名称、配制日期等。
如制斜面培养基时，灭菌后趁热将试管斜放（示范），注意勿使培养基沾染棉塞。
如制平板培养基时，灭菌后待培养基温度降至50℃左右时以无菌操作将培养基倒入无菌培养皿内，每皿约15-20ml，平放冷凝即成平板培养基，简称平板。
若制半固体深层培养基，灭菌后垂直放置，冷凝即成。
二、灭菌与消毒
灭菌指杀死或消灭所有微生物体。消毒则是指破坏或消灭病原微生物，只能杀死微生物的营养细胞，而不能杀死全部芽孢。
灭菌与消毒的方法很多，可概分为物理和化学的两类。如湿热灭菌、间歇灭菌、煮沸消毒、干热灭菌、紫外线灭菌和化学灭菌与消毒等。实验室常用的方法介绍如下。
高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌是一种湿热灭菌法。在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时，湿热的穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触冷凝成水时，又可放出热量，使温度迅速升高，从而增加灭菌效力；另一方面，随着压力增高，达到饱和蒸汽时所具有的温度也高。这样，高压蒸汽灭菌时微生物体受热、湿及压力的作用而被杀死。
由于高压蒸汽灭菌具有灭菌效果好，适用面广的特点，因此，是实验室最常用的消毒灭菌方法。适于消毒在高温高压下不易分解变压的培养基。将配制好的培养基放入高压蒸汽灭菌锅中，使其压力增至15磅后/吋2(相当于121℃)。维持半小时。即可达到灭菌目的。
高压蒸汽灭菌器分为立式，卧式及手提式等几种。但原理都是相同的，使用时必须注意以下几点：
1.使用前必须首先注意将器内加入足够的水。
2.将需要灭菌的器物放在灭菌器中，将盖密闭，打开气门。
3.加热，待器内冷空气完全排除后（蒸汽从气门有力地冲出），才可关闭气门，因为空气本身有压力，如不完全赶出，则压力表上所指示的压力便不准确，达不到灭菌要求。
4.当压力上升到所需要的指标后，开始计算时间，灭菌过程中保持压力不变。
5.达到需要灭菌时间后，停止加热，使器内压力自然下降，如欲使压力下将快些，可将气门稍稍打开，使蒸汽徐徐放出（愈慢愈好），切勿将气门立即全部打开放气，不然因器内压力骤然降低，引起瓶内和管内的培养基沸腾外溢，沾污棉塞，不但增加以后操作的困难，而且培养基也易污染。
6.当内外压力相等（压力表指针降到0时），才能打开高压蒸汽灭菌器的盖。
7.千万注意，加热时必须有专人看管，不可疏忽，勿使压力过大。超出允许范围，以免发生危险。
三、几种常用培养基配方及制作法 1.牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g 蒸馏水 1000ml pH7.2—7.4，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。 2.高氏一号培养基
可溶性淀粉 20g KNO 3 1g NaCl 0.5g K 2HPO 4 0.5g MgSO 4·7H 2O 0.5g FeSO 4 0.01g 琼脂 15—20g 蒸馏水 1000ml 自然pH7.2-7.4,121℃高压蒸汽灭菌20分钟。 3.查氏培养基
NaNO 3 2g K 2HPO 4 1g KCL 0.5g MgSO 4·7H 2O 0.5g FeSO 4 0.01g 蔗糖 30g 琼脂 15-20g 蒸馏水 1000ml
自然pH,121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
4.马丁氏培养基
葡萄糖 10g 蛋白胨 5g KH 2PO 4 1g MgSO 4·7H 2O 0.5g 琼脂 15—20g 蒸馏水 1000ml 自然pH ，115℃高压蒸汽灭菌20分钟。 5.马铃薯培养基
马铃薯 200g 蔗糖或葡萄糖 20g 琼脂 15-20g 蒸馏水 1000ml
新鲜马铃薯去皮，切成薄片，称200g,加蒸馏水1000ml ，煮沸半小时，用纱布过滤，补足因蒸发而减少的水量，即制成20%马铃薯汁.
在马铃薯汁中加入琼脂, 煮沸溶化，加糖搅匀，补足水分，115℃高压蒸汽灭菌20分钟。
自然pH,加入蔗糖，用于培养霉菌；加入葡萄糖，用于培养酵母菌。 将pH 调至7.2-7.4，加入葡萄糖，用于培养放线菌及芽孢杆菌。 四、实验报告和思考题
1. 将琼脂培养基分装试管时应如何操作及其注意事项。
2. 高压蒸汽灭菌时应注意什么问题？为什么？
五、参考资料
王家玲环境微生物学实验高等教育出版社
实验二显微镜的使用、微生物的大小的测定
显微镜的种类很多，一般可分为光学显微镜与非光学显微镜两大类。光学显微镜按其性能不同又可分为明视野显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、紫外光显微镜、偏光显微镜和荧光显微镜等。非光学显微镜为电子显微镜。本实验学习明视野显微镜的使用方法，重点介绍油镜物镜的基本原理与操作步骤。
一、显微镜的使用
1. 光学显微镜的一般构造
光学显微镜的结构分为光学和机械两大部分。光学部分包括接物镜、接目镜、聚光器、虹彩光圈及反光镜；机械部分包括镜头转换器、粗调节器、细调节器、载物台（镜台）、镜筒、镜臂和镜座等。
接物镜：接物镜在成像中起最重要的作用。普通光学显微镜的接物镜有高倍镜、低倍镜及油镜三种。接物镜上刻有放大率如10×，45×，100×等符号。油镜头上刻有“OI”“HI”等字样，并有黑圈或红圈标志。
接目镜：接目镜的作用是把接物镜的实像再放大一次，并把物象映入观察者的眼中。一般有接目镜2—3个，其上刻有5×、6×、10×等符号以表示它的放大倍数，数字越大，放大率越高。
一般计算显微镜的放大倍数是：
接目镜的放大率×接物镜的放大率=显微镜的放大倍数
例如接目镜放大率为10，接物镜放大率为45，此时显微镜的放大倍数为450，其余类推。
反光镜：显微镜下方的圆镜，可向四面转动，用镜面收集光线，使光线射向聚光器，反射到接物镜中。反光镜有平、凹两面，凹面镜聚光力强，适合于光线弱时或无聚光器的显微镜，以及收集通过窗纱的光线或光源为日光灯、物体放大低于100倍时用；平面镜聚光力较弱，适合于光线较弱，如光源为显微镜灯时用。
聚光器：在载物台下方，能聚集光线，增强视野的亮度。聚光器有的可以升降，升高时增强反射光，下降时减弱反射光。聚光器内部附有虹彩光圈（也称光圈或光阑），可开大或缩小，以调节进入镜头的光线。光圈大小应适当，使物像能得到更清晰的效果。
2. 显微镜效能与油镜使用原理：
利用显微镜观察菌体时，总希望能看见最细小的部分，即分辨力（分辨本领）要高。分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力，主要是由接物镜来决定的。分辨力与接物镜的数值口径成反比，与镜检光波长度成正比：
分辨力=（1/2光波长度）/数值口径
数值口径（亦称开口率，numerical aperture,简写为N.A.）愈大，光波愈短，则所能辨晰的物体愈小。人们肉眼所能感受的光（即可见光）波长范围在400—700nm，平均光波长度为0.55μm 。如果放大率为90倍的油镜（N.A. =1.25）和放大率为9倍的接目镜时，其总放大率虽为810倍，但分辨力为0.55/2×1.25=0.22μm。即便用倍数更大的接目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出小于0.22μm的结构。
数值口径可由下式计算：
N.A. =n·sinɑ
ɑ为镜口角（最大入射角）的半数。N为介质折射率。镜口角(图2-1)的大小，决定于接物镜的透镜的直径和焦距，是显微镜光学质量的关键。介质的折射率。空气是1，水是1.33，香柏油是1.515。油镜头焦距短，镜口较大，又滴加香柏油作介质，因而其N.A.最高。
使用油镜必须加油的另一原因是避免散光现象。因为空气的折射率和玻璃的折射率（1.52）相差较大，当光线经载玻片，再经空气进入接物镜时，部分光线将因折射而散失，从而使视野得不到足够的照明；如果加香柏油，则因其折射率与玻璃折射率相近，可使视野光亮充足。
3. 显微镜的使用法
⑴打开镜箱，右手紧握镜臂，左手托住镜座，轻放桌上。
⑵检查各部件是否完好，镜身、镜头必须清洁。
⑶调解光线时不易用阳光，宜用散射光。将低倍接物镜对正下方，接物镜头离载物台约1cm，开放光圈，升高聚光器，调节反光镜，一般在光线较强的天然光源下，宜用平面反光镜；光线较弱的天然光源或人工光源，宜用凹面镜。镜检为染色的标本时，宜用较弱光线。
⑷将标本置载物台上，使之处于接物镜头的正下方。
⑸低倍镜观察：转动粗调节器实低倍接物镜头向下移动至距标本玻片约0.5cm处。再由目镜观测，同时转动粗调节器使镜筒慢慢升起直至看到物象时停止。再用细调节器微调至物象清晰。将合适的目的物用推动器移至视野中央，以备高倍镜观察。
⑹高倍镜观察：推动转换器将高倍接物镜头转至镜筒正下方，转换时应从侧面用眼观察，以防止接物镜头与载玻片相碰。然后从目镜中观察，调节光圈与聚光器使得到适宜照明，在转动细调节器（勿动粗调节器！）微调至物象清晰，再将需要放大观察的目的物移至视野正中央，以备油镜观察。
⑺油镜观察
用粗调节器将镜筒提起约 1.5-2cm，将油镜头转至镜筒下方。滴加一滴香柏油与载玻片要观察的部位上。
眼睛从侧面注视，用粗调节器缓缓降下镜筒，直至油镜头浸没于香柏油内，至几乎与载玻片相接触，但注意不能相碰，以免压迫载玻片并损伤油镜头。然后从目镜中观察，首先调节光圈与聚光器，使光亮适当加大，用粗调节器极其缓慢地提起镜筒至出现物象为止。再用细调节器微调至物象清晰。如果镜头已提升出香柏油面而尚未见物象时，因按上述过程重复操作。
油镜使用完毕，将镜筒提起，取下载玻片，用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再取另一张纸沾取少量二甲苯擦镜头，然后用干净擦镜纸擦去镜头上残留的二甲苯。注意二甲苯用量不宜过多，擦拭时间应短。
⑧. 显微镜使用完毕，将接物镜转成“八”字形，放平反光镜，降下聚光器再下旋镜筒，擦拭镜身灰尘后，归置镜箱中。
二. 微生物大小的测定
微生物大小可利用目镜测微尺来测量。目镜测微尺是一块可以置放在接目镜中隔板上的圆形玻片，中央刻有等分为50或100小格的标尺。目镜测微尺不是直接测量微生物，而是观测显微镜放大后的物象。因目镜测微尺每小格所表示的长度由使用的接目镜和接物镜的放大倍数及镜筒的长度而定，所以在使用前，需用镜（载物）台测微尺进行校正，以求得在特定的显微镜光学系统下目镜测微尺每小格所实际代表的长度。
镜台测微尺为一中央刻有精确刻度的载玻片，一般为1mm等分为100格，每格为10μm,专门用来校正目镜测微尺。
1. 方法和步骤
⑴用镜台测微尺校定目镜测微尺的长度
将目镜测微尺刻度朝下装入接目镜两透镜间的隔板上，将镜台测微尺置于载物台上，使刻度朝上并对准聚光器。
⑵先用低倍镜观察，调焦距，看清镜台测微尺后，转动接目镜使目镜测微尺与镜台测微尺平行对正。
⑶移动推进器，使二尺的一端重合，然后找出另一端第二条重合的线。如图中之AB与A’B’重合，另一端CD与C’D’重合。
⑷计算目镜测微尺每小格实际长度，记载。以图所示为例：
镜台测微尺格数×10
目镜测微尺每小格长度=——————————
目镜测微尺格数
5×10
=————=8.33μm
6
⑸同法:在高倍接物镜下找出二尺的重合线，计算目镜测微尺每小格长度，记载。
⑹在镜台测微尺上加香柏油一滴，同法求出使用油镜头时目镜测微尺的每小格长度，记载。
2. 实测微生物的大小：
⑴取下镜台测微尺，换上待测标本片。
⑵按常规操作观察标本片，如细菌菌体大小，在高倍接物镜下不易测量，则用油镜。不管用任何接物镜头其结果应为一致。
⑶先量出菌体的长和宽各占目镜测微尺的格数，然后换算成微米数。一般测量细菌的大小，在同一标本片上，需测定10-20个菌体，求出其平均值及变化范围。
三. 实验报告和思考题
1.如何正确使用油镜？
2.为什么要使用目镜测微尺测量菌体？为什么在实测菌体之前要先校正目镜测微尺？
四、参考资料
王家玲环境微生物学实验高等教育出版社
实验三细菌、放线菌、霉菌的菌落形态观察及常用细菌染色法
一、目的要求
1. 认识细菌、放线菌和霉菌的代表种类的菌落形态特征。
2. 学习常用细菌染色法。
二、基本原理
菌落形态是指某种微生物在一定的培养基上由单个菌体形成的群体形态。细菌、放线菌和霉菌，每一类微生物在一定培养条件下形成的菌落各具有某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物，方法简便快速，在科研和生产实践中常被采用。
三、实验材料
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
细黄链霉菌（5406放线菌，Streptomyces microflavus）
青霉属(Penicillium)
曲霉属(Aspergillus)
根霉属(Rhizopus)
显微镜、载玻片、盖玻片、解剖针、镊子、酒精灯、纱布、接种环、吸水纸、香柏油、二甲苯、蒸馏水、齐氏石炭酸复红染色液、吕氏碱性美兰染液、草酸铵结晶紫染液、鲁哥氏碘液和番红染色液。
四、实验步骤
1.认真观察各种菌的菌落形状、大小、颜色、质地等特征并作描述纪录。
2.制临时玻片，用显微镜对细菌、放线菌和霉菌进行观察，试比较它们的形态特征。
细菌、放线菌和霉菌的简介：
⑴细菌：菌落表面光滑，有粘稠性，颜色乳白色或浅黄色。细菌是一类单细胞微生物，
个体小，一般需要放大1000倍才能看到，基本形态有球状、杆状和螺旋状三种。球状的直径为0.5-2.0微米；杆菌和螺旋菌的宽度为0.5-1.0微米，长度因种类的不同有较大差异，一般为1-5微米。
有些杆菌在细胞内能形成圆形或椭圆形的无性休眠体结构，称为芽孢。芽孢的壁很厚，含水量少，化学物质不易渗透，对高温、光线、干燥和化学药品等有较强的抵抗力，因此，进行消毒灭菌时，湿热灭菌需提高到120℃以上，干热灭菌需140-160℃方能达到灭菌要求。
⑵放线菌：在琼脂培养基上，放线菌的菌落形态与细菌菌落有明显差异。其菌落大小介于霉菌和细菌之间。菌落表面多为紧密的绒状，坚实多皱，长孢子后呈粉末状。放线菌的细胞
细长，中间不分隔，称为菌丝，菌丝的宽度与细菌相近，在1微米左右，需放大1000倍才能看到。它的菌丝有两种，一种长在培养基内部和紧贴在培养基表面，称为基内菌丝，起吸收营养的作用；一种在培养基表面，向空气中伸出，称为气生菌丝。气生菌丝发育到一定阶段，顶端形成孢子丝，产生孢子。孢子丝的形态不同，有的是直的，有的是波浪似的，有的螺旋状，是区分放线菌种类的重要特征。
⑶霉菌：霉菌的菌体成丝状，称为丝状真菌，但霉菌的菌丝要比放线菌粗十倍到数十倍。霉菌的菌落比细菌、放线菌都大，呈绒状或疏松的棉絮状，并有各种颜色。生物进化上比较低等的霉菌，菌丝体不分隔，整个菌体就是一个大细胞；较高等的霉菌，菌丝有许多分隔，成为多细胞微生物。霉菌的菌丝也分为营养菌丝和气生菌丝，他们的作用也和放线菌一样，营养菌丝具吸收养料的功能，气生菌丝可分化出繁殖器官，产生孢子。孢子随风飞散，漂浮在大气中，遇到适宜的条件就萌发成新的菌丝体。他们对营养条件要求不严格，很容易在各种物质上生长，造成“发霉”的现象。
①青霉属（Penicillillum）青霉菌的菌丝体无色，有横隔，在琼脂培养基上形成的菌落密毡状或棉絮状，初期白色，后期呈蓝绿色，青霉菌的分生孢子梗呈扫帚状分支，顶端串生球形至椭圆形的分生孢子，菌落的蓝绿色即是分生孢子表现的颜色（显微镜示范片）。
②曲霉属（Aspergillus）曲霉的菌丝通常无色，有横隔，老熟时渐变浅黄至褐色。接触培养基的菌丝分化出厚壁的足细胞，并由此向上生长直立的分生孢子梗，其顶端膨大成半球形或椭圆形的顶囊，顶囊表面以辐射状长出一层或双层瓶状小梗，小梗顶端串生分生孢子。分生孢子呈球状或柱状（显微镜示范片）。
③根霉属（Rhizopus）菌丝不分隔，为多核的单细胞微生物。在培养基上生长时，由营养菌丝体产生匍匐枝向四周蔓延，匍匐枝的末端产生一丛假根，伸入培养基中吸收养料。从假根的相反方向长出直的孢子囊梗、端生膨大的孢子囊、囊内充满着球形的孢囊孢子。孢子囊成熟后破裂，释放出褐色的孢子（显微镜示范片）。
五、常用细菌染色法
细菌个体小,菌体透明,必须通过染色使其着色后,才能较好地在光学显微镜下观察其个体形态与部分结构.几种常用染色法介绍如下.
1.简单染色法
采用一种单色染料对细菌进行染色，适用于菌体一般形态的观察。简单染色法操作步骤如下：
⑴涂片：取干净载玻片一块，滴一小滴蒸馏水或生理盐水（菌悬液可不加水），用接种环以无菌操作挑取少许菌落（或菌液），与载玻片上水调匀涂成极薄菌膜。
⑵风干：使载玻片上的菌液在空气中自然干燥。
⑶固定：涂片面向上，用大拇指与食指夹住载玻片一端的侧面，使载玻片在酒精灯火焰上通过3-4次加热以固定细菌。注意不是用火烤。
⑷染色：在已固定的涂片上，滴加适当染色液，染色时间随不同染色液而异。如用齐氏石炭酸复红染色液，染色1-2分钟；如用吕氏碱性美兰染液，则染-3分钟。
⑸水洗：用细水流将涂片上染料洗去，水流勿过急过猛，应由玻片上端倾斜流洗至无
多余燃料时止，将涂片自然干燥或吹风至干。
⑹镜检。
2.格兰氏染色法
是细菌学中一个重要的鉴别染色法。根据细菌对此种染色法的反应不同，可将细菌区分为两大类，菌体呈紫色者为格兰氏阳性细菌，呈红色者为格兰仕阴性细菌。
格兰氏染色法是一种复染色法，应用结晶紫与番红两种不同性质的染料进行染色。染色成败的关键在于严格掌握酒精脱色程度，和应使用新鲜幼龄的菌体进行涂片。其操作步骤如下：
⑴涂片：将待检细菌按上述简单染色法涂片、风干、固定。固定时通过火焰2次即可。
⑵初染：加草酸铵结晶紫染液染色1分钟，水洗。
⑶碘液固定：滴加鲁哥氏碘液冲去残水，覆盖涂片1分钟，水洗。
⑷酒精脱色：用95%酒精滴洗涂片处，至流洗出的酒精不呈现紫色时，立即用水冲洗酒精。脱色时间约20秒钟，或视涂片厚薄而略有差异。
⑸复染：用番红（或称沙黄）染色液染色1-2分钟，水洗。风干后镜检。
六、实验报告与思考题
1.系统描述所观察的各种菌落的形态特征。
2.格兰氏染色的关键何在？为什么？
七、参考资料
王家玲环境微生物学实验高等教育出版社
附：常用染色剂的配制
1.齐氏（Ziehl）石炭酸复红染色液
溶液A 碱性复红（basic fuchsin） 0.3g
95%酒精 10ml
溶液B 石炭酸 5.0g
蒸馏水 95ml
将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使之溶解，配成溶液A.
将石炭酸溶解在蒸馏水中，配成溶液B
将溶液A与溶液B混合即成.通常将此混合液稀释5-10倍使用。因稀释液易变质失效，故一次不宜多配。
2.吕氏(Loeffler)碱性美兰染液
溶液A 美蓝（methylene blue，亦称亚甲蓝） 0.6g
95%酒精 30ml
溶液B KOH 0.01g
蒸馏水 100ml
分别配制溶液A和溶液B,配好后混合即可。
3.草酸铵结晶紫染液
溶液A 结晶紫（crystal violet） 2.0g
95%酒精 20ml
溶液B 草酸铵 [（NH4）C2O4?H2O] 0.8ml
蒸馏水 80ml
将A及B二溶液混合，静置48小时后使用。
4.鲁哥氏（Lugol）碘液
I2 1.0g
KI 2.0g
蒸馏水 300ml
先将KI溶解在少量蒸馏水中，再将I2溶解KI溶液中，然后加水至300ml即成。
5.番红染色液
番红（safranine O，亦名沙黄） 2.5g
95%酒精100ml
蒸馏水90ml
将上述配好的番红酒精溶液10ml与90ml蒸馏水混合即成。
实验四环境监测中的微生物学方法（一）
土壤中主要异养菌的分离与计数
土壤是微生物最适宜的生活环境。土壤微生物类群繁多，以化能异养型的细菌、放线菌和霉菌为主，它们是自然界生态系统中的重要成员，也是人类利用微生物资源的主要来源。
微生物分离培养的基本原理是，选用不同成分和酸碱度的培养基，在不同的温度和不同的通气条件下进行培养，使只有适合该条件的微生物得以生长。由于土壤中各种菌的数量高，常需进行一定量稀释，使微生物能在培养基上长成单个菌落，以达到分离的目的。
常用的分离方法有平板划线分离法及平板稀释分离法（又称倾注法）。平板稀释分离法又可分为混匀法与涂布法两种。它不仅可用于分离，而且可通过此法测定原样品中的微生物数量。混匀法是将1ml菌悬液加入无菌培养皿中，然后再倾注溶化了的培养基与菌液混匀，凝固
成平板后即可进行培养（详见实验六）。涂布法是先将溶化了的培养基，用无菌操作倒入无菌培养皿中制成平板，再将菌液涂布于平板表面进行培养。
本实验通过平板涂布法及平板划线法学习土壤中一般异养性细菌、放线菌和霉菌的分离及计数方法，并进行形态观察。
一、器材与用品
1.培养基（配方见实验一）
⑴牛肉膏蛋白胨培养基，分离细菌用。
⑵高氏一号培养基，分离放线菌用。临用时向溶化的培养基中加入10% 的酚数滴，然后倒平板。
⑶马丁氏培养基，分离霉菌用。每1000ml培养基中加入1% 孟加拉红（玫瑰红，rose bengal）溶液3.3ml。临用时每100ml培养基中加1% 链霉素液0.3ml，然后倒平板。
2.盛90ml无菌水的三角瓶，内装玻璃珠；盛9ml无菌水的试管；无菌培养皿；无菌1ml刻度吸管；无菌玻璃涂布棒等。
3.显微镜、扭力天平、无菌取土铲及无菌盛土器等。
4.乳酚油（乳酸石炭酸液）：配制方法如下：
乳酸（比重1.2） 20g
石炭酸 20g
甘油（比重1.25） 40g
蒸馏水 20ml
配制时先将石炭酸加热溶解，倒入水中，再慢慢加入乳酸和甘油。
二、方法和步骤
1.取土样:选定取样点，按对角交叉取样法五点取样。先除去表层2cm的土壤。在2-10cm处取土样。若取土铲未曾灭菌，则需再取样前插入土中数次。将五点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，装入无菌容器中。土样取回后应尽快投入实验。同时称取待测土样10-15g，记下准确重量，经105℃烘干8小时，置干燥器中冷却后称重。待干土至恒重时按下列公式计算土壤含水量的百分数，以便换算干土中的微生物数量。
湿土重- 干土重
土壤含水量 % =————————×100%
湿土重
2.制备土壤稀释液: 称新鲜土样10g，盛于有90ml无菌水的三角瓶内，充分振摇15分钟，此即为10-1浓度的稀释液。静置15秒钟后，用无菌吸管取10-1稀释液1ml加至9ml无菌水试管中，充分摇匀，此即为10-2浓度稀释液。另取无菌吸管，依次作10倍稀释，制成10-3、10-4……等一系列土壤稀释液，通常稀释至10-6浓度。
3.接种
⑴涂布接种法：用无菌吸管分别吸取适宜浓度的土壤稀释液0.1ml,接种于相应的培养基平板上。通常，细菌采用10-4、10-5、和10-6三种稀释度接种于肉膏蛋白胨培养基，放线菌采用10-3、10-4和10-5三种稀释度接种于高氏一号培养基，霉菌则采用10-2、10-3和10-4三种稀释度接种于马丁氏培养基。每一稀释度至少有三个平板重复（平行）。接种时每一稀释度用一支无菌试管，菌液注入平板后，应立即用无菌涂布棒将该液均匀地涂布于平板表面。注意勿刮破琼
脂。
⑵平板划线法：取不同培养基平板，做好标记。在火焰边，左手托住培养皿并稍微开启皿盖，右手执无菌接种环沾取浓土壤液一环在培养基表面轻轻划线，注意勿划破琼脂。划线方法很多，图5-2示两种常用划法。A图系将平板分作3-4区，先将浓菌液在第1区平行划线3-4条，转动培养皿约60-70o角；用在火上烧过并冷却的接种环通过第1区划线在第2区划平行线，同法在第3区和第4区划线。B图系将沾有浓菌液的接种环在平板上作连续划线。
4.培养: 将上述接种后的培养皿倒置，于28-30℃温箱中培养。
5.菌落观察与计数：需氧性细菌培养2-4天，霉菌4-7天，放线菌7-12天，观察结果。一般来说，细菌菌落较易自培养基上挑取；放线菌菌落较小，干燥、致密、坚实，不宜自培养基上挑取；霉菌菌落较大、疏松，常呈绒毛状或絮状。
涂布接种平板上菌落的计数方法，细菌和放线菌选取菌落数在30-300之间的培养皿，霉菌选菌落数在10-100的培养皿，按下式计算出每克干土中的菌数。
同一稀释度的菌落平均数×稀释倍数×10
每克干土中菌数=—————————————————
1-土壤含水量%
菌落在平板上生长可有不同情况，其计数方法可参考试验六。
6.菌体形态镜检：镜检可参考实验三。
三、实验报告
1.描述所见细菌、放线菌和霉菌菌落的主要特征并绘出其菌体形态。
思考题
为平板计数准确，需要掌握的关键性操作是什么？为什么？
五、参考资料
王家玲环境微生物学实验高等教育出版社
实验五环境监测中的微生物学方法（二）
空气中的微生物的计数
被微生物污染的空气是呼吸道传染病的主要传播途径。检验空气中细菌的常用方法有沉降法与滤过法两种，沉降法所测的细菌数量欠准确，但方法简便；滤过法虽比沉降法繁琐，但准确性较高，可用于测定空气致病菌或空气消毒效果评定。通过本实验了解一定环境空气中微生物的数量并学习检定和计数空气微生物的基本方法。
沉降法
空气中的细菌自然沉降于培养基的表面，经培养后计数其上生长的菌落数，按公式推算出1m3空气中的细菌总数。
1.器材与用品
⑴仪器：高压蒸汽灭菌器、干热灭菌器、恒温箱、4℃冰箱、培养皿、吸管等。
⑵灭菌培养基
①牛肉膏蛋白胨培养基（配方参阅实验一）。
②查氏培养基（配方参阅实验一）。
③高氏一号培养基（配方参阅实验一）。
2.方法与步骤
⑴将牛肉膏蛋白胨培养基、查氏培养基、高氏一号培养基溶化后，各倒8个培养皿。
⑵将上述三种培养皿各取四个。在室外打开皿盖，分别暴露于空气中5分钟、10分钟。另四个培养皿，在实验室空气中分别暴露5分钟、10分钟（不同时间各平行两皿）。
⑶盖上皿盖，将平板倒转，置于28℃温箱中，细菌培养48小时，霉菌与放线菌培养时间分别为4-6天，计算其菌落数，观察菌落形态、颜色等。
⑷计算1m3空气中微生物的数目
奥梅梁斯基曾建议：如面积为100cm2的平板培养基，暴露在空气中5分钟，与37℃培养4小时后所生长的菌落数，相当于10L空气中的细菌数。
N×100×100
X = ——————
πr2
X:每m2空气中的细菌数
N:平板暴露5分钟，与37℃培养24小时后生长的菌落数
r2:平皿底半径（cm）
二、滤过法
使一定体积的空气通过吸附剂，而后培养吸附剂中的细菌，计数出菌落数。
1.器材与用品
⑴仪器：盛50ml无菌水的三角瓶、蒸馏
水瓶，其余同沉降法。
⑵培养基：同沉降法。
2.方法与步骤
⑴先将仪器按图6-1装置。
⑵将下面的大玻璃瓶盛满4L水。
⑶旋开水龙头，使水缓缓流出。这时外界
的空气被吸入，经喇叭口进入盛有50ml无菌水
的三角瓶中。至4L水流完后，则4L体积空气中
的微生物被过滤在50ml水中。
⑷自三角瓶中吸1ml水放入培养皿中（重
复三遍），然后加入已溶化并冷却至45℃的牛
肉膏蛋白胨培养基中，摇匀。凝固后置28℃温
箱中培养48小时后计算结果。
⑸计算结果：按下式计算
每皿平均菌落数×50
菌数/L空气= ——————————
4
三、实验报告
菌落平均数
环境
细菌霉菌放线菌
室外
5min 10min
室内
5min 10min
四、思考题
比较上述两种空气菌数测定的结果，并分析其优缺点。
五、参考资料
王家玲环境微生物学实验高等教育出版社
实验六环境监测中的微生物学方法（三）
水中细菌总数的测定
细菌总数主要作为判定被检水样污染程度的标志。在水质卫生学检验中，细菌总数是指1ml水样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，于37℃经24小时培养后，所生长的细菌菌落的总数。
一、器材与用品
1.仪器：高压蒸汽灭菌器、干热灭菌器、恒温箱、4℃冰箱、放大镜。试管、培养皿（直径9cm）、刻度试管等置于干热灭菌器中160℃灭菌2小时。
2.培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（配方参阅实验一）。
二、操作步骤
1. 水样的采取：供细菌学检验用的水样，必须按一般无菌操作的基本要求进行采样，并保证在运送、贮存过程中不受污染。为了要正确反映水质在采样时的真实情况，水样采取后应立即送检；一般从取样到检验不应超过4小时。条件不允许立即检验时，应存于冰箱，但也不应超过24小时，并应在检验单上注明。
⑴自来水：先将自来水龙头用火焰烧灼三分钟灭菌，然后再开放水龙头使水流5分钟，以排出管道内积存的死水，再用无菌容器接取水样，以待分析。如水样内含有余氯，则采样瓶未灭菌前先按每采500ml水样加3% 硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O）溶液1ml的量预先加入采样瓶内，用以采样后中和水样内的余氯，以防止其继续存在有杀菌作用。
⑵江水、河水、池水或湖水：可应用采样器，器内的采样瓶应先灭菌。采水样时，直接将水灌入已灭菌的采样瓶，不需再用样水洗采样瓶。采样后，采样瓶的水面与瓶塞底部间应留有一些空隙，以便在检验时可充分摇动混匀水样。
2.水中细菌总数的测定
⑴水样的稀释：根据水被污染程度的不同，可用无菌吸管作10倍系列稀释（稀释方法同实验四中的土壤液的稀释）。
⑵接种：以无菌操作方法用无菌吸管吸取原水样1ml或取2-3个适宜浓度稀释液1ml,注入灭菌培养皿中。倾注约15ml已溶化并冷却到45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即旋转培养皿，使水样与培养基充分混匀，每个稀释度平行三皿。另设三皿空白对照。
⑶培养：待冷却凝固后，翻转培养皿，使底面朝上，置于37℃恒温箱内培养24小时，进行菌落计数，即为1ml水中的细菌总数。
⑷菌落计数：先计算同一稀释度的平均菌落数，若其中一个培养皿有较大片状菌落生长时，则不予采用，而应以无片状菌落生长的培养皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到培养皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此培养皿计数乘2以代表全培养皿菌落数；然后再计算该稀释度的平均菌落数。
各种不同情况的计算方法：
①首先选择平均菌落数在30-300之间者进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则即以该平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表例次1）。
②若有两个稀释度，其平均菌落数均在30-300之间，则应按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2应报告两者的平均数，若大于2则报告其中较少的菌落总数（见表例次2及3）。
③若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表例次4）。
④若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告（见表例次5）。
⑤若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间则以最近300或30的平均菌落乘以稀释倍数报告（见表例次6）。
表计算菌落总数的方法举例
报告本次你所测水样中每毫升细菌总数。并说明该水样是否合乎饮用水标准。
四、思考题
用这种方法是否测得全部水中细菌？为什么？
五、参考资料
王家玲环境微生物学实验高等教育出版社
实验七酵母菌酵的加富培养与分离
酵母菌常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。大多数酵母菌营腐生生活，喜偏酸条件，最适pH为4.5-6。酵母菌生长迅速，易于分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快；利用酸性培养条件则可抑制细菌生长。因此，常用酸性液体培养基获得酵母的加富培养，然后在固体培养基上用划线法分离。
一、器材与用品
1. 甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮。
2. 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（配方见实验1）。
3. 乳酸马铃薯葡萄糖培养液，配方同上，但不加琼脂而加乳酸，按每1000ml培养液中含5ml乳酸量加入，再分装试管。
4. 0.1% 美蓝染色液。
5. 1ml刻度无菌吸管、无菌培养皿等。
二、方法和步骤
1.接种：取一小块果皮，不需冲洗，直接接入乳酸马铃薯葡萄糖培养液管中，置28-30℃,培养24小时可见培养也变混浊。
2.加富培养：用无菌吸管取上述培养后培养液0.1ml，注入另一管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置28-30℃再培养24小时或稍长（过长则霉菌长出）。
3.镜检：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.1% 美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并可根据菌体是否染上颜色来区别细胞的死活。因活酵母可使美蓝还原，故菌体不着色。
4.分离：马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板。用划线法分离上述加富培养体，培养后可获得单个菌落。挑选单个菌落反复再次划线分离纯化，即可获得纯培养。
三、实验报告
绘图并描述所得酵母的菌落和菌体形态。
四、思考题
为什么在进行加富培养时要用酸性的培养液，而进行划线分离培养时可以不用酸性培养基？
五、参考资料
王家玲环境微生物学实验高等教育出版社
实验八金属的微生物腐蚀
埋地金属管道和水下金属构筑物的腐蚀中，除了化学因子外，还可以由微生物引起。参与金属腐蚀的微生物主要有铁细菌和硫酸盐还原菌两大类。铁细菌的作用在于它在金属表面形成生物垢和大量沉积物。这些沉淀物在金属表面能产生氧差电池引起的电化学腐蚀，同时它还为硫酸盐还原菌创造厌氧条件，对金属腐蚀起了间接的加速作用。硫酸盐还原菌能将硫酸盐还原为硫化
物，通过消耗氢使金属表面阴极部位去极化，从而加速电化学腐蚀。因此，结合现场腐蚀特征观察，分析铁细菌和硫酸盐还原菌的数量，有助于确定腐蚀的原因和提出防护措施。本实验学习MPN法计数金属腐蚀中的微生物。
MPN(most probable number)法中译名为最可能数法或最近似值法。它是将不同稀释度的待测样品接种至液体培养基中培养。然后根据受检菌的特性选择方法以判断其生长，并经统计学处理进行计数。此种方法亦称稀释液体培养计数法或稀释频度法。
一、器材与用品
1. 铁细菌培养基
(NH
4)
2
SO
4
0.5g
NaNO3 0.5g
K2HPO4 0.5g
MgSO4·7H2O 0.5g
CaCl2?6H2O 0.2g
柠檬酸铁铵 10.0g
蒸馏水 1000ml
pH7.0,按每只试管（15×150mm）8ml分装27支，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
2. 硫酸盐还原菌培养基
乳酸钠（70%） 3.5g
NH4Cl 1.0g
K2HPO4 0.5g
MgSO4.7H2O 2.0g
Na2SO4 0.5g
CaCl2 0.1g
硫酸亚铁铵微量
蒸馏水 1000ml
pH7.0,培养基按每只试管（15×150mm）8-10ml分装18支，每支试管加入1枚3cm长小铁钉（先用95% 酒精浸泡处理10分钟）作还原剂。121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
3. 盛灭菌9ml自来水试管（15×150mm）10支。
4. 盛99ml灭菌水和加有20粒玻璃珠的300ml三角瓶1个。
5. 灭菌1ml吸管10支。
6. 取样工具：小铁铲、灭菌小铝盒、胶布。
二、方法和步骤
1. 现场观察：通常受微生物腐蚀的金属具有如下特征：腐蚀坑充满黑色腐蚀产物，加HCl 处理时可放出H2S；腐蚀产物下面的金属表面往往发亮；腐蚀坑的表面呈同心圆环状，纵剖面呈圆锥形等。
2. 样品采集：用取样小铁铲从发生腐蚀金属构件的腐蚀部位，采取腐蚀垢样10g左右，置于灭菌小铝盒中，用胶布封口备用。如不能立即进行微生物分析，需存放4℃冰箱，并于48小时内分析完。
3. 样品稀释液制备：称取1g经混合均匀的腐蚀垢样，放入盛有99ml无菌水的三角瓶中，充分振荡10分钟。然后按常规的1比9稀释法制成10-2至10-8浓度的样品悬液。
4. 接种培养：铁细菌取10-2至10-8稀释度，接入铁细菌试管培养液中，每一个稀释度设三个重复（平行），每管接种1ml，共21管。硫酸盐还原菌取10-2至10-6稀释度，接入硫酸盐还原菌培养液中，三个重复，共15管。接种后的试管，置于28—30℃条件下培养。
5. 结果
⑴观察成长与否：铁细菌于培养5—7天后观察培养液变浑浊，液面长有菌膜者为阳性；硫酸还原菌于10—14天后观察，培养液浑浊变黑者为阳性反应。纪录各管生长情况（+或-）。
①根据稀释系列液中生长情况确定数量指标。不论稀释度及重复次数如何，数量指标均为三位数字，其第一位数字必须是在稀释系列中所有重复都有菌生长的最高稀释度，如下例中的10-2。在此例中，其数量指标为542。如果其后的稀释度尚有生长，设此例中的10-5不是0而是2，则应将此数加入数量指标的最末位数字上，即为544。
②根据数量指标查MPN表（见本实验附注）查处最可能数，如此例数量指标542之最可能数值为25，在按下式计算结果：
最可能数×数量指标第一位数的稀释倍数
每克干样品中菌数 =————————————————————
干样%
三、实验报告
1.描述现场观察到的金属腐蚀特征。
2.记载铁细菌及硫酸还原细菌在试管中的生长情况。
3.查MPN法的三个重复最可能数表，计算并报告所测得两种菌菌数。
四、思考题
初步分析所检金属构件腐蚀的原因。
五、附注
MPN法测数统计表
王家玲环境微生物学实验高等教育出版社
实验九纤维素的分解
每年有大量纤维素物质作为废弃物进入环境。纤维素的分解是自然界碳素转化的重要环节。分解纤维素的微生物种类甚多，本实验主要培养观察在中温有氧与缺氧条件下分解纤维素的微生物以及滤纸纤维素被分解的现象。
一、器材与用品
1.赫氏噬纤维菌基础培养基
KH2PO4 1.0g CaCL2?6H2O 0.1g MgSO4?7H2O 0.3g NaCl 0.1g FeCl3 0.01g NaNO3 2.5g 蒸馏水 1000ml 琼脂 15-20g 调节pH7.0-7.2,121℃高压蒸汽灭菌30分钟，趁热制成平板。
2. 厌氧性分解纤维素细菌培养液
蛋白胨 1.0g
Na(NH4)HPO4 2.0g
KH2PO4 1.0g
CaCl2·6H2O 0.3g
微生物实验指导书
实验一普通光学显微镜的使用及其对微生物一般形态的观察 一、实验目的 1．了解普通光学显微镜的构造及其各部分的作用。 2．掌握普通光学显微镜的正确使用和维护方法。 3．通过低倍镜、高倍镜观察藻类、酵母培养液和新鲜活性污泥中微生物的一般形态。 二、实验原理 普通光学显微镜由机械部分和光学部分组成。 图1-1 双目生物显微镜 1．机械部分： （1）镜筒：位于镜臂上端的空心圆筒，是光线的通道。镜筒的上端可插入目镜，下面与转换器相连。 （2）转换器：位于镜筒下端，是一个可以旋转的圆盘。有3~4个孔，用于安装不同放大倍数的物镜。 （3）载物台：载物台是放置标本的方块平台，中央有透光孔，载物台上面有玻片夹持器，侧面有移动手轮，可纵向和横向移动标本。 （4）调焦手轮：包括粗调手轮和微调手轮，可使载物台上下升降，调节物镜和标本之间的距离。 2．光学部分： （1）目镜：放在镜筒上，配有10倍（10×）、16倍（16×）两种。 （2）物镜：装在转换器的孔上，有低倍镜（4、10）、高倍镜（40）和油镜（100），是显微镜中最主要的部分。各种镜头上都刻有放大倍数和数值孔径（A N ）及所要求盖玻片厚度等主要参数。物镜的性能由数值孔径决定，并且还依赖于物镜的分辨率。 （3）聚光器：由聚光镜和孔径光阑组成。聚光镜的作用是把光线聚集在标本上，增强照明度。孔径光阑是用来调节对比度的，使物镜和聚光器的数值孔径相符合。当孔径光阑开启到物镜出瞳的70~80%时，就可以得到足够对比度的良好图象。如果开得太大，超过物镜的数值孔径，就会产生光斑；如果开得太小，则分辨率下降，降低物像的清晰度。 （4）电光源：在显微镜的下部，提供观察标本时所用光源。
微生物学实验指导
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、 大小的测定和计数 一、实验目的 １、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片,学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 ４、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法 二、实验器材 １、显微镜 ２、微生物标本装片 ３、目、物镜测微尺 ４、血球计数板 ５、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等 三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜,由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器;光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。 ２、操作 在目镜保持不变的情况下,使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下,特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序,因为低倍数物镜视野相对大,易发现目标及确定检查的位置。 四、微生物大小的测量原理和方法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺(图1-1）是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍｍ长度刻成5０等分，或把1０mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中 --
-- 间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺(图１-２）是中央部分刻有精确等分线的载 玻片,一般将lmm 等分为100格,每格长ｌ０μm （即0.0ｌmm), 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载 物台上,由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经 过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即物镜测微尺随着显 微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小,所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度,然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器,使两尺重叠,再使两尺的“０”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1－３)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μｍ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺５小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为ｌ0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/５=1０μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定 移去物镜测微尺,换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。 结果计算： 长μm=平均格数×校正值 宽μｍ＝平均格数×校正值 大小表示: 宽μm ×长μｍ 五、微生物细胞数量的测定原理和方法 1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图1-4），计数区 图1-1 目镜测微尺 图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正 图1-4 血球计数板
食品微生物学基础实验指导
食品微生物学基础实验指导（食品科学、食品安全专业使用） 食品微生物教研组
前言 微生物学实验是微生物学的重要组成部分，也是学习微生物学的一个重要环节。通过实验操作，可以加深和巩固对课堂讲授内容的理解。训练学生掌握最基本的操作技能；了解微生物学的基本知识；培养学生观察、思考、分析解决实际问题的能力；实事求是、严肃认真的科学态度和勤俭节约、爱护公物的良好作风。为了上好微生物学实验课，并保证安全，实验时要注意如下事项：1．为了保证实验室的整洁和实验的顺利进行，非必要的物品和书包，不得带入室内，实验时不得高声谈话和随意走动。 2．每次实验前要对实验内容进行充分预习，了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，并作合理安排。 3．实验中要认真观察，及时做好实验记录。对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。 4．实验操作应严格按操作规程进行，万一遇有带菌物品洒漏、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。 5．实验过程中，切勿使乙醚、丙酮、酒精等易燃药品接近火源，如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。 6．凡实验用过的菌种以及带有活菌的各种器皿，应先经高压灭菌后才能洗涤。制片上的活菌标本应先浸泡于3％来苏儿溶液或5％石炭酸溶液中，半小时以后再行洗刷。如系芽孢杆菌或有孢子的菌，则应适当延长浸泡时间。 7．实验中需进行培养的材料，应注明组别、名称及处理方法，实验完毕，应将仪器、用具等洗净，放好，做好桌面及地面的清洁工作。
实验一、显微镜油浸系物镜的使用与微生物形态观察 一、实验目的 掌握显微镜低倍镜和高倍镜的使用方法，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。 二、实验主要设备及材料 微生物标本装片，香柏油，二甲苯，光学显微镜，擦镜纸。 三、实验原理、方法和手段 油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n= 1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n=1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明度，更重要的是通过增加数值孔径达到提高分辨率的目的。可见光的波长平均为0.55μm。当使用数值孔径为0.65的高倍镜时，它能辨别两点之间的距离为0.42μm；而使用数值孔径为1.25的油镜时，能辨别两点之间的距离则为0.22μm。 光学显微镜的成像原理（倒立的虚像）介质为空气与介质为香柏油时光线通过的比较
微生物工程实验指导
微生物工程实验指导 适用生物技术专业 食品与生物工程学院 2008.1 实验一 发酵实验用玻璃器皿灭菌前的包扎方法 一、目的：学习发酵实验用玻璃器皿在灭菌前的包扎工作，并了解灭菌后的使用方法。 二、原理：为保持发酵实验用玻璃器皿灭菌后的无菌状态，需要对
它们灭菌前进行包扎，这些工作看起来简单，但如操作不当或不按操作规程去做，则会影响实验结果，甚至会导致实验的失败。 三、材料和设备 5ml吸管30只，9cm培养皿 10套，120*12mm试管 120只，250ml三角瓶30个，脱脂棉0.5斤，天然棉0.5斤，8层纱布30块，线绳。 四、方法 1、洗涤 1 新器皿应用2﹪盐酸浸泡数小时再洗涤。 2 琼脂块不能倒入下水道。 3 含菌培养基一般先煮再洗。 4 洗涤后玻璃器皿上水应均匀湿润而无条纹和水珠。 2、包扎 ① 平皿的包扎：10个一包。前9个方向一致，最后一个反放，用 纸卷成卷，也可放在特制铁桶中灭菌。 ② 吸管的包扎：在吸管尾部塞入少许脱脂棉，脱脂棉长约1cm， 距管口约0.5cm，以防止在使用时造成污染。脱脂棉松紧适当， 多余的棉花可用火焰烧掉。每支吸管用约6cm宽纸条，吸管头部 包衬双层纸，以30－45o卷起，吸管尾部用剩余纸条打成一结， 防止散开，标上容量。使用时，从吸管中间凝断包扎纸带，抽出 吸管。 ③ 试管的包扎：用天然棉做成棉塞，紧贴管臂，松紧适宜，棉 塞要实，2/3塞进管口。也可用硅胶塞。十只一把，外加牛皮 纸，扎好。脱脂棉易吸水，可能造成染菌。 ④三角摇瓶的包扎：用8层纱布（大小适宜），塞入瓶口2/3，瓶 外部分揪成一团，再用一层牛皮纸或两层报纸把纱布遮严（以免 打湿），包扎，用绳子系成活扣。使用时，去掉包扎纸，拿去纱 布，接种后，将纱布塞进瓶口，纱布四角拉下，用绳子系成活 扣。 五、作业 体会这样做有哪些好处？
微生物及生物工程实验室工作指南.
微生物及生物工程实验室工作指南 Working Instructions for the Laboratories of Microbiology and Bioengineering 实验室危险品 Dangers in Laboratory 在实验室中工作有很多危险，首先是由于工作者需要接触危险的化学制剂或溶剂，包括：For the working in the laboratory there are many dangers. In one point because of working with dangerous chemicals or solutions, which are： ●易爆炸物质 Explosive (E) ●强氧化性物质 Oxidising (O) ●腐蚀性物质 Corrosive (C) ●放射性或强放射性物质 Flammable (F) or highly flammable (F+) 易挥发，易燃或极易燃的物质即使在低浓度也容易爆炸或燃烧 V olatile, inflammable or highly inflammable substances are also at low concentrations very explosive or deflagrative. 危险品还包括： Dangerous substances also can be: ●有害健康的物质，有毒物质，毒性极强物质 Harmful to health (Xn), toxic (T) or very toxic(T+) ●刺激性物质 Irritant (Xi) ●致癌物质，影响生育能力的物质以及可能引起基因突变的物质，或在特定条件下危害健 康 Carcinogenic, dangerous for fertility, mutatic for genotype or in an other case cronically harmful. 当这些物质泄漏后，它们可能 When the substance will be released in the environment, they can be: ●污染环境 Dangerous for the environment (N) 对于任何接触危险品的操作，必须遵守如下规定： For every activity with dangerous substances you have to observe this rules：
医学微生物学实验指导
医学微生物学实验指导 西安交通大学医学院 微生物学教研室
第一次实验课内容 实验内容1. 实验目的与要求 实验内容2. 实验室规则 实验内容3. 细菌形态学观察技术 实验内容4. 染色标本的制备—革蓝染色 实验目的与要求 医学微生物学实验课是该专业课程的重要组成部分，指导学生上好实验课是教学过程中的重要环节，学习实验课的目的是： 1. 使学生加深理解并巩固理论知识，学习和掌握有关的实验操作技术，为以后的医学专业课学习打好基础： 2. 在实验中，培养学生观察、思考和分析问题的能力，主动参与实验的动手能力及独立工作的能力。训练学生严格的科学作风、严肃白的科学态度和严密的工作方法。 3. 培养学生在集体工作环境中互帮互让，团结协作，共同完成好实验的精神品德。 为了达到上述目的，提高实验课的教学效果，特提出以下要求： 1. 实验课前做好预习，明确本次实验课的内容及其原理、方法及注意事项； 2. 实验中要仔细认真，注意分工与协作，操作实验要按操作步骤进行。学会正确操作手法、准确记录实验结果。示教实验要注意观察，并记录好相关内容； 3. 详细讨论实验结果，提倡同学之间互帮互学，并紧密联系理论课内容。要注意不论实验结果与理论符合与否，都有讨论的价值，并分析其原因，有可能的话还应重复实验； 4. 严格遵守实验室规则，在微生物学实验课上，要树立“有菌观点”，严格掌握和不断完善无菌操作技术。
实验室规则 一、进入实验室须穿工作服、戴工作帽。除必要的书籍文具外，其它个人物品一律不得带入实验室。 二、在实验室内，禁止饮食、吸烟及与学习无关的其它活动，不得大声喧哗或嘻戏。 三、未经老师许可，不得擅自搬动实验器材及示教物品，不准随意摆弄和旋转实验仪器上的开关及旋扭等。 四、按照实验要求，在老师的指导下，主动安排要进行的实验，认真进行实验操作，严格遵守无菌操作规程，争取顺利地完成实验。 五、实验中使用完毕的器材和试剂，必须放回规定的位置。废弃物必须按规定进行处理或归放于指定的容器内，不能随便乱丢乱放。 六、实验中万一有菌液打翻、有菌材料污染桌面或衣物、割破手指等意外情况，应及时报告老师进行处理，切勿自作主张不按规定处理。 七、爱护实验室内一切设备、挂图、仪器。注意节约使用消耗材料及药品试剂，注意用电安全及节约水电。 八、实验结束，要清理桌面，将实验器材放回原处。值日同学要搞好实验室的清洁卫生，保持室内整齐，离开实验室前要关好门窗、水、电，并将手洗干净。 九、未经许可，不得将实验室内任何物品带出实验室。
环境工程微生物学实验答案
1.使用油镜时，为什么要先用低倍镜观察 油镜指的是为了减少高倍镜的折光，在物镜和玻片之间滴上松节油等。所以油镜其实就是给高倍镜物镜和玻片之间加油。而所有高倍镜之前都先要用低倍镜观察，是因为低倍镜下好找目标。低倍镜放大10倍，高倍镜放大40倍，油镜放大100倍，先用低倍镜、高倍镜，既便于找到目标，又方便调焦距。 要使显微镜视野明亮，除采用光源外，还可以采取哪些措施？ 加大聚光器光圈，同样设置下低倍物镜比高倍物镜视野亮 把材料切薄一点透光较好 使用滤光片，增加反差和清晰度。 向上调节聚光器。 2.怎样区别活性污泥中的几种固着型纤毛虫 大多数情况下，会遇到钟虫、柄纤毛虫、累枝虫等。三种虫形态均类似钟的形状，钟虫每个都是独立的，相互之间没有连接；柄纤毛虫类似钟虫，量很大，只是在根部汇聚在一根柄上，可以理解成一根柄上分出很多个钟虫；而累枝虫就像是树，一根柄上分出很多个柄，然后很多个柄上又分出很多个“钟虫”。 用压滴法制作标本片时注意什么问题 4.涂片为什么要固定，固定时应注意什么问题 如果不固定的话你进行染色后水洗去多余染料的同时会将菌体一并冲走 注意的就是不要弄死细胞咯！不知道你用什么方法，如果是用火，那就是不要烧死它们，用载玻片背面靠近火源，过两次就好。Over 一般我都是用酒精灯的外焰烤的但是要注意温度。温度过高挥出现变形细胞。温度已载玻片接触手背，手背不觉得烫为宜。加热只水分蒸发完全后，再在酒精灯外焰上通过两到三次，就成了。 革兰氏染色法中若只做1~4步，不用番红染液复染，能否分辨出革兰氏染色结果？为 什么？
革兰氏染色在微生物学中有何实践意义？ 细菌大多可以按照革兰氏法划分，在杀菌方面自然管用， 还有实验方面， 比方说，实验需要G阳性细菌作为研究材料，如果最后需要杀死细菌获取什么代谢产物，已知是G 阳性细菌，那就有目的地杀除了，摒除了盲目手段。 6.培养基是根据什么原理配制成的？肉膏蛋白胨琼脂培养基中的不同成分各起什么作用 是按照微生物生长的营养需求及其相互比例配制的。牛肉膏和蛋白胨提供微生物生长所需的蛋白质、核酸和维生素、无机盐（微量元素），琼脂只为培养基提供半固体的支撑结构，不提供微生物生长的营养。 有时，也根据所培养的微生物的特殊需要配制培养基，如特别提供某种营养素，或专门缺乏某种营养素，使微生物得以鉴别、分离。 配制培养基的基本步骤有哪些?应注意什么问题 按配方计算培养基中各种成分的用量→称量，（一般动作要迅速一些，因为其中可能有些成分容易吸潮）→溶化（将称好的各种成分溶解在水中，如果是固体培养基，需要使用凝固剂，如琼脂等，熔化时，注意搅拌，防止糊底）→调pH→灭菌（高压蒸汽灭菌）→倒平板 分离活性污泥为什么要稀释？ 答：活性污泥中的微生物种类繁杂，数量庞大。如果不经稀释就直接做分离培养，则培 养基上的菌落会因为数量过多而互相连结，分不清楚了，就达不到分离目的。 用一根无菌移液管接种几种浓度的水样时，应从那个浓度开始，为什么？ 答：应该从低浓度开始。从低浓度开始到高浓度是不会改变高浓度水样的浓度，如果从 高浓度开始则会影响低浓度水样 要使斜面的线条致密，清晰，接种时应注意哪几点？ 不要在已划线的地方重复划线，不要太用力划破培养基
微生物学实验指导(10.10)
实验一显微镜的使用及细菌的革兰氏染色 一、实验目的和内容 （一）实验目的 1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油镜的使用方法。 2. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤 （二）实验内容 1．学习油浸系物镜的使用方法。 2．制作细菌染色装片。 3．进行革兰氏染色法操作。 4．用油镜观察大肠杆菌和苏云金杆菌染色装片。 二、实验原理 （一）油镜的基本原理 普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。油镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。油镜头上常刻有OI（Oil，Immersion）或HI（Homogeneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长。在低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numberal aperture）最大，而工作距离最短（图3-1）。 图1-1 显微镜物镜参数图 显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比.
从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积。影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。 当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n＝1.0）与玻璃（n＝1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n＝1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明废，更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率，因而可以使物像明亮清晰。 （二）革兰氏染色 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法，其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
发酵工程实验报告集
生物技术大实验 实验报告集 班级生物技术1212学号 1220212206 姓名宋扬 使用时间2015.12.14至2015.12.19 组别一 苏州科技学院化学与生物工程学院
实验室学生守则 一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员 的指导。 二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、 准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。 三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。凡不按教师的指导擅自操 作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。 四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。未经允许不得随便挪 动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室 外。 五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和 吃东西。 六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管 理人员报告。 七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、 水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。 苏州科技学院化学与生物工程学院
实验报告
菌体量随着时间增加而增长，而辅酶Q10 含量也随着菌体量的增长而变大。后期因为菌体量的减少，也开始降低。下罐。 还原糖浓度（柱状图） 还原糖浓度不断下降，在24小时开始每隔一段时间补充葡萄糖，使葡萄糖含量维持在 一开始溶氧在100%，随着菌体生长发酵，开始下降，控制在30%左右，随着菌体增加，降为 粘，影响氧气传递。 前期消耗氮源，产氨，pH上升，随着菌体生长繁殖，消耗碳源，产酸， 源，使pH维持在6.8左右。当pH过低时，通过补加氨水，使pH维持稳定。
微生物学实验报告
微生物学实验报告 (格式标准) (生命科学专业) 教师:黎勇 目录索引 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 3 实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5 实验三常用培养基的配制7 实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8 实验五、微生物大小的测定与显微计数10 实验六环境中微生物的检测与分离纯化11 实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12 实验八(综合实验)化能异养微生物的分离与纯化13 课程名称: 微生物学实验班级:化生系生命科学本科 实验日期: 指导教师:黎勇 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术;观察细菌的基本形态;学习观察细菌的运动性的基本方法。 〔基本原理〕 1、 N·A=n·sinα 2、 D=λ/2N、A 3、目镜可提高放大倍数,但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大瞧不清,未分辨物放得再大也瞧不清。 4、用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时,可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。 〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸;细菌、放线菌等固定装片;培养18小时左右的B、subtilis、 S、arueus 菌斜面培养物;无菌水、生理盐水。 〔方法步骤〕: (一) 油镜的使用 镜检装片在中倍(或高倍镜)下找到目的物,并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置,虹彩光圈开到最大,镜头转开成八字形在玻片的镜检部位(光斑处)滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台(缩短镜头与装片距离,镜头浸入油中,至油圈不扩大为止镜头几与装片接触) 粗调器徐徐下降载物台(密切注视视野,当捕捉到物像时,立即用细调器校正) 仔细观察并绘图 取出装片,清洗油镜:擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留(用手指辅助,迅速拭擦一、二次) 用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯(2-3次)。 (二) 细菌的简单染色法:涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察 (三) 细菌运动性的观察取洁净盖玻片,四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察 〔结果分析〕 1、画一圆圈表示视野,选取所观察的微生物绘图,注意特殊结构、形状与排列。(描绘时按视野实际大小5－10倍绘制)
微生物学实验技术指导书
实验须知 普通微生物学实验课的目的是，训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基础知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验；培养学生观察、思考、分析问题、解决问题和提出问题的能力；养成实事求是、严谨认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；树立勤俭节约、爱护公物的作风。 为了上好微生物学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项： 1.每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。 2.认真、及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。 3.实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4.实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导老师，及时处理，切勿隐瞒。 5.实验过程中，切勿使乙醇、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火器。 6.使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。 7.每次实验完毕后，必须把所有仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石碳酸液覆盖0.5小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前需浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。 8.每次实验需进行培养的材料，应标明姓名、组别及处理方法，放于教师指定的仪器内培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。 9.每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告表中，力求简明准确，认真回答思考题，并及时汇交教师批阅。 10.实验结束后，整理桌面，物归原处，留人打扫室内卫生。 11.离实验室前，将手洗净，注意关闭火、煤气、灯、水管等。
微生物工程综合实训报告格式
辽东学院 《微生物工程》实训报告 专业： 班级： 姓名： 学号： 实训地点：农学院生物技术实验室 指导教师： 实训时间：2010 年7 月 5 日~ 7 月12 日
一、实训目的和要求 1.熟悉红曲霉菌种的分离纯化方法。 2.掌握观察霉菌形态的基本方法，观察红曲霉的形态特征，判断所分离的红曲霉是否纯种。 3.了解红曲霉菌扩大培养的方法，为较大规模固体发酵准备菌种。 4.了解浅盘固体发酵的大致过程，在实验室中小规模制备红曲。 二、实训准备 1.（1）样品：红方。 （2）培养基：固体PDA培养基：土豆２００g、蒸馏水１０００ml、葡萄糖20g、琼脂粉15～20g、PH 5.0～6.0。 （3）器材：水浴锅、培养箱、灭菌锅、培养皿、移液管、试管等。 2.（1）器材：培养箱、灭菌锅、显微镜、载玻片、盖玻片等。 （2）乳酸石碳酸棉兰染色液：石碳酸10g，溶于蒸馏水中（可适当加热），加入乳酸10ml，甘油20ml,再加入棉兰0.02g,溶解即成。 3.（1）样品材料：米、醋酸。 （2）器材：.电饭锅、高压蒸汽灭菌锅、培养箱等。 4.（1）样品材料：优质籼米、醋酸。 （2）电饭锅、纱布、浅盘等。 三、实训内容(步骤及程序) 实训一：红曲霉发酵 1.原理：红曲霉广泛分布与自然界，因此可以从自然界中分离纯化得到。鉴于我国劳动人民很早就开始利用红曲，他们将红曲霉制成了各种各样的发酵食品，因此，要得到红曲霉菌种，最简单的办法是直接从这些发酵食品中去分离。培养红曲霉多用麦芽汁琼脂培养基，红曲霉在该培养基上生长良好，菌落较大，培养初期菌落为白色，老熟后变成淡红色、紫红色、橙红色、烟灰色等，因种而异。菌落有呈绒毯状的，也有呈皮膜状的，红曲霉在马铃薯培养基上呈现局限性生长，某些种能在马铃薯培养基上形成疮疤状菌落。红曲霉生产的是水溶性红色色素，能分泌到培养基中，使培养物着色。 2．配制培养基 （1）PDA培养基：土豆２００g、蒸馏水１０００ml、葡萄糖20g、PH 3.5～4.0、分装5ml/管、每管加95%的乙醇两滴。 （2）固体PDA培养基：土豆２００g、蒸馏水１０００ml、葡萄糖20g、琼脂粉15～20g、PH 5.0～6.0。 3．灭菌：培养基、空培养皿、空试管、无菌水、枪头、纱布等。 4．红曲霉的分离纯化 （1）红曲米或红方5g、无菌过滤，加入1000ml无菌水（分装于几个锥形瓶中，每个瓶所装溶液不超过容积的2/3），振荡摇匀。 （2）60℃水浴，杀死，不耐热的细菌及酵母菌。 （3）稀释涂平板分离。
水处理微生物学实验指导书
水处理微生物学实验指导书 班级 姓名 学号 市政与环境工程学院 年月
目录 实验一显微镜、测微尺的使用及生物相的观察实验二革兰氏染色技术 实验三培养基的配制和灭菌 实验四水中细菌总数的测定
实验一显微镜、测微尺的使用及生物相的观察 一、实验目的与要求 （1）了解普通光学显微镜的构造与功能，学习与掌握显微镜观察微生物的方法。 （2）观察细菌、放线菌和蓝细菌的个体形态，学会绘制微生物的形态结构图。 二、显微镜的基本结构和功能 普通光学显微镜是一种精密的光学仪器。以往最简单的显微镜仅由几块透镜组成，而当前使用的显微镜由一套透镜组成。普通光学显微镜通常能将物体放大1500—2000倍。 （一）显微镜的构造 普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一为机械装置，一为光学系统，这两部分很好的配合，才能发挥显微镜的作用。 1、显微镜的机械装置 显微镜的机械装置包括镜座、镜筒、物镜转换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺旋等部件。 （1）镜座镜座是显微镜的基本支架，它由底座和镜臂两部分组成。在它上面连接有载物台和镜筒，它是用来安装光学放大系统部件的基础。 （2）镜筒镜筒上接接目镜，下接转换器，形成接目镜与接物镜（装在转换器下）间的暗室。 从物镜的后缘到镜筒尾端的距离称为机械筒长。因为物镜的放大率是对一定的镜筒长度而言的。镜筒长度的变化，不仅放大倍率随之变化，而且成像质量也受到影响。因此，使用显微镜时，不能任意改变镜筒长度。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm，此数字标在物镜的外壳上。 （3）物镜转换器物镜转换器上可安装3—4个接物镜，一般是三个接物镜（低倍、高倍、油镜）。Nikon显微镜装有四个物镜。转动转换器，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。 （4）载物台载物台中央有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。 （5）推动器是移动标本的机械装置，它是由一横一纵两个推进齿轴的金属架构成的，好的显微镜在纵横架杆上刻有刻度标尺，构成很精密的平面座标系。如果我们须重复观察已检查标本的某一部分，在第一次检查时，可记下纵横标尺的数值，以后按数值移动推动器，就可以找到原来标本的位置。（6）粗动螺旋粗动螺旋是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件，老式显微镜粗螺旋向前扭，
微生物学实验指导
农业微生物学实验指导 北京农学院食品科学系 授课教师刘一倩 高秀芝 2006年3月
实验1显微镜的使用及细菌形态的观察 1目的要求 (1)了解普通光学显微镜的构造，各部分的功能和使用方法。 (2)学习并掌握油镜的原理和使用方法，熟悉几种常见微生物的基本形态。 2普通光学显微镜的构造与油镜的工作原理 2.1普通光学显微镜的构造 显微镜的构造可分为机械装置和光学系统两大部分。机械装置包括镜座、镜筒、镜臂、物镜转换器、载物台、推进器、粗调螺旋、微调螺旋、光圈等部件；光学系统由接目镜、接物镜、聚光器、反光镜等组成(图1-1)。 (1)镜座 镜座是显微镜底座，用以支撑 全镜，呈长方形。其上装有电源开关、照明 光源、保险丝、光源滑动变阻器等。 (2)镜筒 镜筒上连接目镜、下连接转换 器，光线从筒中通过。 安装目镜的镜筒分为 可调式的单筒和固定式的双筒两种。从镜筒 上缘到物镜转换器螺旋口之间的距离称为筒 长。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm ， 此数字标在物镜的外壳上。 (3)镜臂 连接镜筒和镜座。有的镜臂是 固定的，有的可向后方倾斜，其作用是支撑 镜筒、载物台、聚光器和调焦装置等。 (4)物镜转换器 转换器上可安装3～5 个物镜，一般是3个物镜(低倍镜、高倍镜、 油镜)。转动转换器时，可以按需要调换各种 物镜，将之推到使用位置上。 图1-1 光学显微镜构造示意图 (5)载物台 载物台呈长方形，中央有一 孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推 进器。 (6)推进器 推进器由一横一纵两个推进 齿轴和齿条构成，转动其上螺旋，可使标本片 向前、后、左、右移动。研究型显微镜的纵横架杆上刻有刻度标尺，构成精密的平面坐标系。如需要重复观察已检查标本的某一物像时，可在第一次检查时记下纵横标尺的数值，下次按数值移动推进器，就可以找到原来标本的位置。 1.物镜转换器； 2.物镜； 3.游标卡尺； 4.载物台； 5.聚光器； 6.虹彩光圈； 7.光源； 8.镜座； 9.电源开关；10.光源滑动变阻器；11.粗调螺旋；12.微调螺旋；13.镜臂；14.镜筒；15.目镜；16.标本移动螺旋 (7)粗调螺旋 粗调螺旋用于粗放调节物镜和标本的距离。老式单目镜显微镜的粗调螺旋向前扭动，镜头下降接近标本。新式双目镜显微镜(如Motic 显微镜)镜检时，双手向后扭动使载物台上升，让标本接近物镜，反之则下降，标本远离物镜。使用显微镜观查标本时，主要使用粗调螺旋调节。 (8)微调螺旋 用粗调螺旋只能粗放地调节焦距，难于观察到清晰的物像，因而需要用微调螺旋做进一步调节。其每转一周，镜筒移动0.1 mm 。新式研究型显微镜粗、微螺旋为共轴式。原则上，微调螺旋每次旋转不超过一周。 (9)光圈 在聚光器下方，可任意开闭，用来调节射入聚光器光线强弱。
微生物学实验报告
微生物学实验报告 （格式标准参考） (生命科学专业，生物技术专业) 教师：黎勇
目录索引 实验一油镜的使用和细菌的简单染色法 (3) 实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 (4) 实验三常用培养基的配制 (6) 实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别 (7) 实验五、微生物大小的测定与显微计数 (9) 实验六环境中微生物的检测和分离纯化 (10) 实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应 (12) 实验八（综合实验）化能异养微生物的分离与纯化 (13) 课程名称：微生物学实验班级：化生系生命科学本科
实验日期：指导教师：黎勇 实验一油镜的使用和细菌的简单染色法 〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术；观察细菌的基本形态；学习观察细菌的运动性的基本方法。 〔基本原理〕 1.N·A=n·sinα 2.D=λ/2N.A 3.目镜可提高放大倍数，但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大看不清，未分辨物放得再大也看不清。 4.用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时，可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。 〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸；细菌、放线菌等固定装片；培养18小时左右的B.subtilis. S.arueus菌斜面培养物；无菌水、生理盐水。 〔方法步骤〕： （一）油镜的使用 镜检装片在中倍（或高倍镜）下找到目的物，并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置，虹彩光圈开到最大，镜头转开成八字形在玻片的镜检部位（光斑处）滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台（缩短镜头与装片距离，镜头浸入油中，至油圈不扩大为止镜头几与装片接触）粗调器徐徐下降载物台（密切注视视野，当捕捉到物像时，立即用细调器校正）仔细观察并绘图取出装片，清洗油镜：擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留（用手指辅助，迅速拭擦一、二次）用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯（2-3次）。 （二）细菌的简单染色法：涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察（三）细菌运动性的观察取洁净盖玻片，四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察 〔结果分析〕 1、画一圆圈表示视野，选取所观察的微生物绘图，注意特殊结构、形状和排列。（描绘时按视野实际大小5－10倍绘制） 菌名：大肠杆菌菌名：金黄色葡萄球菌 放大倍数：100×10（×5）放大倍数：100×10（×5） 特殊结构：无特殊结构：无 视野观察下微生物的形态 2、油镜使用时为什么必须干燥装片？
微生物工程实验指导2009
微生物工程实验指导 河北农业大学生命科学学院制药工程系2007 年10 月 实验一细菌生长曲线的测定
一、实验目的 了解细菌生长曲线特点及测定原理；学习用 比浊法测定细菌的生长曲线。 二、原理将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。 测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD 值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD 值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。 三、实验材料 1. 菌种 大肠杆菌（E.coli ） o 严去甘 2. 培养基 肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g,蛋白胨10g, NaCI 5g，琼脂15-20g，水 1000mL，调pH 7.0-7.2。 3. 仪器和器具 721 分光光度计，比色杯，恒温摇床，无菌吸管，试管，三角瓶。 四、流程 种子液f 标记f 接种f 培养f 测定 五、实验方法 1. 种子液制备 取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入肉膏蛋白胨培养液中，静止培养18h作种子培养液。
微生物资源开发与利用实验指导(定)
微生物资源开发与利用 实验指导 适用于森林资源保护与游憩专业 北京林业大学森林保护学科 二零零二年8月 实验一培养基的配制及灭菌 培养基是人工配制的适于微生物生长、繁殖或保存的营养基质。培养基的种类繁多，但一般应具备以下几个条件：1.含有适宜的碳源、氮源、无机盐类、生长因素等营养成分；2.含有适量的水分；3.适宜的酸碱度。 根据培养基的成分来源不同可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基。环境微生物学中，常用废水或废水补加少量氮、磷等无机盐来培养微生物，可认为是天然培养基或半合成培养基。 根据培养基的物理性状可分为液体、固体和半固体培养基。液体培养基中加一定量的凝固剂（常加琼脂 1.5—2%）。溶化冷凝后即成固体培养基。半固体培养基含琼脂0.2—0.5%。某些工农业生产废渣及生活废渣可视为天然的固体培养基。 根据培养基的特殊用途可分为选择培养基、鉴别培养基等。选择培养基在环境微生物学中应用较广，它是根据待培养微生物的特殊营养要求或生物特征而设计的培养基，利用这种培养基可将所需要的微生物从环境混杂的微生物中分离出来。如以石油作碳源的培养基可以分离到降解石油的微生物；以纤维素为唯一碳源的培养基可以分离到纤维素分离菌。 本实验介绍培养基配制及灭菌的一般原则和方法步骤。 培养基配制的方法和步骤 1.称量：先按配方计算培养基各成分的需要量，称量时用1/100粗天平即可。在烧杯或搪瓷杯中先放少量水，依次加入培养基各组分，溶解后补足至所需的总水量。对于肉膏之类
粘、胶状物，可盛在小烧杯或表面皿内称量，以便用水移入培养基中。蛋白胨等极易吸潮物质，在盛取时应动作迅速。某些无机盐类如磷酸盐和镁盐相混合时易产生沉淀，必要时应分别灭菌后再混合。此外，生长因素及微量元素等成分因用量极少，可预先配成较浓的储备液，使用时按要求取一定量加入培养液中即可。 2.溶化：各成分必须溶解在培养液中。最好溶解一种组分后，再加第二种，有时需要加热使其溶解。如果配方中有淀粉，则应先将其用少量冷水调成糊状，再兑入其他已溶解的成分中，边加热边搅拌，至完全融化即溶液由混浊转为清亮后，补水至所需总量。 溶化琼脂时，应注意控制火力使不至溢出或烧焦，并要不断搅拌。因加热过程中水分损耗较多，最后应补足至原体积。 根据需要，有时需将溶化后的培养基用脱脂棉或纱布过滤，已使培养基清亮透明。 3.调pH值：以10% HCI或10% NaOH调节培养基至所需pH值。一般用广泛pH试纸矫正，必要时亦可用酸度计。调时需注意逐步滴加，勿使过酸或过碱而破坏培养基中某些组分。 4.分装：将矫正pH后的培养基按需要趁热分装于三角瓶或试管内，以免琼脂冷凝。分装时应注意勿使培养基粘附于管口与瓶口部位，以免沾染棉塞而滋生杂菌或影响接种操作。可以通过下边套有橡皮管及管夹的普通漏斗进行分装。 分装量视需要而定。一般分装入三角瓶以不超过其容积的一半为宜。分装试管时，斜面培养基以试管高度的1/5左右为宜，半固体培养基以试管高度的1/3左右为宜。 5.加棉塞：试管和三角瓶口需用棉花堵塞，主要目的是过滤除菌，避免污染。 做棉塞所用的棉花应是普通长纤维棉花，不要用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水变湿而滋长杂菌。棉塞制作方法有多种，主要的要求是不宜过松或过紧，应宜塞拔方便而又不易脱落为准。正确的棉塞其头部应较大，约有1/3在试管外，2/3在试管内（示范），试管以内部分不应有缝隙。 6.灭菌：在装培养基的三角瓶或试管的棉塞外面包一层牛皮纸，即可灭菌。应用铅笔注明培养基名称、配制日期等。 如制斜面培养基时，灭菌后趁热将试管斜放（示范），注意勿使培养基沾染棉塞。 如制平板培养基时，灭菌后待培养基温度降至50℃左右时以无菌操作将培养基倒入无菌培养皿内，每皿约15-20ml，平放冷凝即成平板培养基，简称平板。 若制半固体深层培养基，灭菌后垂直放置，冷凝即成。 二、灭菌与消毒 灭菌指杀死或消灭所有微生物体。消毒则是指破坏或消灭病原微生物，只能杀死微生物的营养细胞，而不能杀死全部芽孢。 灭菌与消毒的方法很多，可概分为物理和化学的两类。如湿热灭菌、间歇灭菌、煮沸消毒、干热灭菌、紫外线灭菌和化学灭菌与消毒等。实验室常用的方法介绍如下。 高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌是一种湿热灭菌法。在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时，湿热的穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触冷凝成水时，又可放出热量，使温度迅速升高，从而增加灭菌效力；另一方面，随着压力增高，达到饱和蒸汽时所具有的温度也高。这样，高压蒸汽灭菌时微生物体受热、湿及压力的作用而被杀死。 由于高压蒸汽灭菌具有灭菌效果好，适用面广的特点，因此，是实验室最常用的消毒灭菌方法。适于消毒在高温高压下不易分解变压的培养基。将配制好的培养基放入高压蒸汽灭菌锅中，使其压力增至15磅后/吋2(相当于121℃)。维持半小时。即可达到灭菌目的。 高压蒸汽灭菌器分为立式，卧式及手提式等几种。但原理都是相同的，使用时必须注意以下几点： 1.使用前必须首先注意将器内加入足够的水。 2.将需要灭菌的器物放在灭菌器中，将盖密闭，打开气门。 3.加热，待器内冷空气完全排除后（蒸汽从气门有力地冲出），才可关闭气门，因为空气本身有压力，如不完全赶出，则压力表上所指示的压力便不准确，达不到灭菌要求。 4.当压力上升到所需要的指标后，开始计算时间，灭菌过程中保持压力不变。 5.达到需要灭菌时间后，停止加热，使器内压力自然下降，如欲使压力下将快些，可将气门稍稍打开，使蒸汽徐徐放出（愈慢愈好），切勿将气门立即全部打开放气，不然因器内压力骤然降低，引起瓶内和管内的培养基沸腾外溢，沾污棉塞，不但增加以后操作的困难，而且培养基也易污染。