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细菌鞭毛染色方法及其应用

作者单位:570311海口市,海南省临床微生物学检测与研究中心(省人民医院) 专题笔谈

细菌鞭毛染色方法及其应用谷海瀛

细菌鞭毛纤细,直径只有10~30nm,远低于光学显微镜的分辨率,只有采用特殊的染色方法才能在普通光学显微镜下观察其形态。由于细菌鞭毛染色在细菌鉴定中起着很重要的作用,故以下将对其方法及其应用进展作一论述。

一、细菌鞭毛染色方法

目前,细菌鞭毛染色方法根据染色剂的不同,可分为碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝B法、镀银染色法和荧光蛋白染色法6类,前5类方法的媒染剂成分中均含有单宁酸,染色原理通常是采用不稳定的胶体溶液做媒染剂,并使其沉淀于鞭毛上而使 鞭毛肿胀(tar and feather) ,鞭毛直径加粗,进一步染色后即可在油镜下观察。

1 碱性复红法和副品红法:1926年由Gray[1]首创碱性复红法,其媒染液成分包括20%丹宁酸水溶液

2 0ml,硫酸钾铝饱和水溶液5ml,饱和氯化汞水溶液2ml,3%碱性复红乙醇(95%)溶液0 4ml,临用前混合,且需过滤后方可使用。染片时,媒染剂染色约6min,具体时间尚需在试验中摸索确定,染色液是抗酸染色Zieh-l Neelsen石碳酸复红染液,染片时需要1小片吸水纸盖在涂片上,染色3min。由于该方法媒染剂混合物不稳定、操作复杂、经验性强。Leifson[2]于1930年建立了副品红法,并于1938年[3]和1951年[4]两次对该方法进行了改良,称为Leifson方法。染色试剂由3种溶液组成:A为1 5% NaCl水溶液,B为3%单宁酸水溶液,C为乙酸副品红0 9g,碱性副品红0 3g溶解于100ml95%乙醇溶液中。使用时把等体积A和B混合,然后再加2体积C与之相混。该试剂冷藏可保存1~2个月。

尽管Leifson方法的试剂可以冷藏保存1~2个月,比Gray法进步了,但Gray法、Leifson法仍存在试剂稳定性较差的问题;并且制备涂片程序亦繁琐,如细菌要接种营养琼脂斜面,制备涂片前要用蛋白胨水悬浮培养物斜面0 5h,然后用该菌悬液制涂片;缺乏对染色效果方法的评价。

1976年,Clark[5]在Leifson法的基础上,通过大量试验解决了3个重要问题:首先,制备涂片时可以直接从Columbia琼脂血平板上取菌制备;其二,可运用打分的方法进行染色效果评价;其三,首次证明了血平板培养和肉汤培养的细菌鞭毛染色效果无差别。未使用Leifson法中的副品红染色剂,而使用了Gray法中的碱性复红染色剂。具体配方:1 2%碱性复红,1 5%单宁酸和0 75%NaCl,95%乙醇溶解碱性复红后,过夜使用。用1mol/L NaOH溶液调pH 至5,染液需4 保存,稳定1个月。Clark虽然使用了3分制评分标准评价染色效果,但由于没有解决染色液的稳定性差的问题,仍不够完善。1981年Forbes[6]在前人的基础上对碱性复红法进一步改良其配方:0 4g碱性复红,0 2g单宁酸和0 5g硫酸氨铝,装于16mm 125mm的试管中,密闭保存。染色前,用2ml95%乙醇,0 5ml甘油,7 5ml Tris缓冲液混合物使其溶解,充分摇动3~5min,2500r/ min离心2min,室温反应30min后使用。试管中的混合液加入矿物油后,室温下能保存2周。Gray法、Leifson法及Clark法的染色时间均需要试验摸索, Clark改良法的时间为5~15min,Forbes法则只需1 min,但Forbes法对于肠杆菌科的染色效果不理想,除了变形杆菌,评分值都在3分以下。Forbes仍未解决染色试剂稳定性差的问题。

2 结晶紫法:又称Ryu法,1937年由Ryu[7]建立,1982年由Kodaka等[8]进行了改良。媒染剂:5%石碳酸10ml,2g单宁酸和10ml饱和硫酸钾铝。染色剂:饱和结晶紫乙醇溶液,即12g结晶紫溶于100 ml无水乙醇中。使用时把10份媒染剂与1份染色剂混合,染色5min。1989年,Heimbrook等[9]使用改良的Ryu染色试剂,采用湿片技术进行鞭毛染色,虽然可以观察到细菌鞭毛,但效果不好。Ryu染色方法优点是试剂比较稳定,目前Difc o公司已经研制出该方法的商品试剂盒,但染色效果亦不甚理想,至今

尚无一篇文献对其方法进行评分评价,染色效果见图1。

3 维多利亚蓝B法:1990年由Inoue等[10]报道日本制药株式会社Shionogi Seiyaku研制出一种细菌鞭毛染色商品试剂盒。其试剂组成包括维多利亚蓝B、苯酚,单宁酸和硫酸钾铝,染色约需7min。该试剂保存期约为6个月,关于其染色效果虽然有过一篇文献评述,但却没有采用评分法进行评价,很难判断其染色效果。

4 镀银染色法:1958年Rhodes[11]根据Fontana 的螺旋体改良镀银染色法,建立了一种细菌鞭毛镀银染色法。试剂分为媒染剂和银染剂。媒染液: 10%单宁酸10ml加5ml饱和硫酸钾铝水溶液,再加1ml苯胺饱和水溶液形成沉淀,通过摇动又能重新溶解,加入5%FeCl3水溶液1ml形成黑色溶液,稳定10min后使用。银染液:配制5%AgNo3水溶液100ml取出10ml备用,再缓慢加入浓氨水(比重0 880)使形成的沉淀刚好重新溶解,最后把备用的10ml AgNo3溶液向其中逐滴加入,直到摇动后呈现轻微而稳定的薄雾状溶液为止,避光保存,可稳定数周。用媒染液染片3~5min,蒸馏水充分洗涤后,再把银染液滴加至涂片上。加热至接近沸腾,染色3~5min。由于Rhodes镀银染色法媒染液成分复杂、操作繁琐,所以1965年Blenden等[12]改良了细菌鞭毛镀银染色法的配方。试剂A:100ml蒸馏水中加入5g单宁酸,1 5g FeCl3,15%福尔马林2ml,1% NaOH溶液1ml。试剂B:使用2%AgNo3,其他同于Rhodes[11],但试剂不稳定,要求在4h内使用,并且要用氨水调pH至10。试剂A染片2~4min,试剂B 染色30s,不需加热。由于以上两种镀银染色方法都要使用营养琼脂斜面培养物,并且需用无菌蒸馏水悬浮菌液制片,未采用评分法评价镀银染色方法。因此1977年,West等[13]对镀银染色法进一步改良,制备涂片时直接使用血平板,评价染色效果首次使用5分制,通过该评价方法证明了加热银染液染片可以提高染色效果。试剂配方:媒染液为饱和硫酸钾铝水溶液25ml,10%单宁酸50ml,5%FeCl3水溶液5ml,

5 保存,染色液配制同Rhodes,但需避光5 保存。媒染液染片4min,银染液滴加至涂片上加热至微冒蒸汽,染色4min。同时West等还对使用不同培养基进行染色效果评价,包括半固体动力培养基、血琼脂平板、TSA(trypticase soy agar)斜面,其中半固体动力培养基和TSA斜面25 ,培养18~24h;血琼脂平板35~37 ,培养18~24h。评价结果血琼脂平板35~37 ,培养18~24h不适于细菌鞭毛染色,而半固体动力培养基和TSA斜面25 ,培养18~24h适合于细菌鞭毛染色,同时也证明了使用福尔马林处理标本制备涂片并不能有效阻止鞭毛脱落。由于镀银染色法媒染液不稳定,需避光5 保存,1992年Porter等[14]继续改良该方法,其试剂配方同West等的方法,只是媒染剂避光室温可保存数月,延长媒染剂染色时间为8min,染色液不需加热,只染30s,制备涂片程序略有不同。使用TSA平板,3

6 培养24h,但遗憾的是Porter等只使用1种细菌(奇异变形杆菌)进行研究。于是1994年Finegan等[15]进一步证实使用过期媒染剂进行镀银染色可以增强鞭毛染色效果,并使用4种细菌(绿脓假单胞、奇异变形杆菌、黏质沙雷菌、枯草芽孢杆菌),用trypticase soy肉汤及其琼脂平板,26 培养24h。试剂配方仍不变,媒染液放置1、2、4、8、16周后进行染色,媒染液染色8min,银染液染色30~60 s,不需加热。这4种细菌均染色成功,从而证明媒染液可至少放置16周。

2002年谷海瀛[16]发明了一种新的细菌鞭毛镀银染色法。该法将媒染剂分为A、B两种。A液为酸化FeCl3溶液,B液为15%单宁酸,含甲醛1ml,用时A、B液等量混合,轻微加热,染片40s,再用银染液涂片加热至微冒蒸汽,染色10s。通过对19个属,34个种,228株细菌进行鞭毛染色,应用West等的染色效果评价方法进行评价。血琼脂平板培养平均每株菌获得4 7分,肉汤培养平均每株菌获得4 6分,其中100株非发酵菌在血平板培养获得满分5分。重要的是这种方法不仅染色效果好(图2),而且解决了试剂稳定性差的问题,此种试剂常温下至少可保存1年。

5 荧光蛋白染色法:2000年,Grossart等[16]报道了一种荧光蛋白染色法该方法是在玻片上加10 l活细菌液体培养物,再加0 5 l荧光染色剂(nanoOrange),然后加30%聚乙烯吡咯烷酮10~20 l,盖上盖玻片,10~15min后使用放大倍数 1250,激发波长490nm,发射波长520nm的落射荧光显微镜(epifluores cence microscopy)观察。研究中共检测了37株细菌,其中有动力的6株细菌未观察到鞭毛。这种新方法不适合于在临床微生物实验室常规开展,因为结果观察时必须借助特定的设备,细菌培养必须使用液体培养基,其可靠性还有待进

一步验证。

综上所述,无论是碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝B法,还是传统镀银染色法都无法克服试剂不稳定这一最大的缺点。结晶紫法虽然试剂比较稳定,但染色效果却不理想。谷海瀛[17]发明的细菌鞭毛镀银染色法操作简便、快速、试剂稳定、重复性好,可以作为实验室常规鞭毛染色方法推广应用。

二、细菌鞭毛染色应用意义

细菌鞭毛是细菌的运动器官,幽门螺杆菌能够从强酸性的胃内腔穿过胃上皮细胞上的黏液层到达胃上皮细胞的中性环境,这就是鞭毛运动作用的很好例证。

细菌分类学常将细菌的动力测定作为鉴定细菌的重要试验,动力试验常用悬滴法、压滴法和半固体培养基法。但对于弱动力菌株悬滴法和压滴法的观察结果常为阴性,而使用半固体培养法可以得到阳性结果,谷海瀛[18]发现,使用MTT半固体培养基更容易观察菌株的弱动力,但至少要培养72h才能观察到。Rhodes等[11]已论述每株细菌每一菌体细胞上的鞭毛数量是不恒定的,同一株菌可以观察到甚至5种以上不同鞭毛数的菌体细胞,例如大肠埃希菌在鞭毛涂片染色后,可以发现菌体鞭毛数量1~ 10根,由于菌体细胞的鞭毛数量的多样化,可以看到多种鞭毛分布的菌体细胞(图3),这种现象可能是与鞭毛基因表达有关,也可能与鞭毛脱落有关。

通过鞭毛染色,可以观察到鞭毛形态、数量和鞭毛在菌体分布的位置,鞭毛数量和在菌体上的分布位置是鉴定细菌的重要依据之一,根据鞭毛的这些特征,可将有动力细菌分为单端极鞭毛菌、单端丛鞭毛菌、周鞭毛菌、侧鞭毛菌。

单端极鞭毛(monotrichous):在菌体的一端只有1根鞭毛,例如绿脓假单胞,但这个概念可能要改变,敏捷食酸菌(acidovorax facillis,曾称敏捷假单胞)、德氏食酸菌(acidovorax delafieldii,曾称德氏假单胞)、缺陷短波单胞菌(brevundimonas diminuta,曾称微小假单胞)、泡囊短波单胞(brevundimonas vesicularis,曾称泡囊假单胞)、栖稻假单胞(pseudomonas oryzihabitans)、腐败希瓦菌(she wanella putrefaciens,曾称腐败假单胞)。这些菌曾均被描述为单端极鞭毛菌[19,20]现在证明这些菌均为一端有1 ~2根鞭毛[21,22],现可以重新定义这是单端双毛菌(bitrichous)。

丛鞭毛(lophotrichous flagella或multitrichous fla gella)菌体细胞的一端或两端鞭毛数大于2,例如恶臭假单胞菌(图4)。

周鞭毛:鞭毛多少有些均匀分布于菌体细胞表面外周,由于文献没有定义鞭毛数,可以提出新的定义,如果菌体细胞鞭毛数多于3,且几乎均匀分布于该细胞表面,即为周鞭毛,例如肠杆菌科细菌。

侧鞭毛:分为单侧鞭毛(lateral flagellum)和多侧鞭毛(lateral fla gella),单侧鞭毛就是菌体细胞侧边长有1根鞭毛,谷海瀛[17]首次发现非O1型霍乱弧菌有单侧鞭毛。国内外文献提到的侧鞭毛(lateral fla gella)系指多侧鞭毛,即菌体细胞侧边分布的多根鞭毛,形态上侧鞭毛和周鞭毛难以区分。9版伯杰手册[23]在革兰阴性需氧杆菌、微需氧杆菌和球菌Group4的章节中,将Subgroup4a80个菌属进行列表,把有鞭毛的细菌分为两类,即单端鞭毛菌和侧鞭毛菌。例如,产碱杆菌属和土壤杆菌属等在此列表中为侧鞭毛,但在该手册的菌属特征描述中却为周鞭毛,Tison[24]也认为一些弧菌在固体培养基上能够爬动(swar m),鞭毛染色为周鞭毛,这是周鞭毛和侧鞭毛在概念上的混淆。为了区别这两个概念,本研究将侧鞭毛定义为在液体培养时染色表现为单端鞭毛(图5),而在固体培养上可表现为周鞭毛,这种双相性的周鞭毛应称为侧鞭毛,例如副溶血弧菌在液体培养时,为单端极鞭毛,固体培养时可见周鞭毛(图6),曾被认为是周鞭毛实际应为侧鞭毛。Shimada等[25]发现嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌22 固体培养可以显示周鞭毛,但肉汤培养却是单端极鞭毛。Inoue等[26]发现类志贺邻单胞菌25 固体培养可以显示周鞭毛,但肉汤培养却单端丛鞭毛,谷海瀛[17]也证实这些发现,根据上述侧鞭毛定义,这些周鞭毛均应是侧鞭毛。Kirov等[27]的研究也证实了这一观点。

通常细菌培养温度和鞭毛生长温度是一致的,但也有例外。鞭毛生长温度应该根据测定细菌动力的最适温度来确定,有些细菌需要在室温下(20~ 25 )培养进行鞭毛染色,例如耶尔森菌属。有文献描述李斯特菌的动力温度是20~22 ,这也是鞭毛的生长温度。谷海瀛[18]发现,单核李斯特菌在35 培养,进行鞭毛染色,效果也很好。

细菌鞭毛的主要生理作用是动力,在液体培养中表现为 泳动 (swimming motility),而在固体培养基表面表现为 爬动 (swarming motility),有些细菌

图1 奇异变形杆菌R yu s染色(结晶紫);图2 奇异变形杆菌谷氏鞭毛染色 1000;图3 大肠埃希菌谷氏鞭毛染色 1000;图4恶臭假单胞菌谷氏鞭毛染色 1000;图5 副溶血弧菌(生长在鞭毛肉汤培养基中)谷氏鞭毛染色 1000;图6副溶血弧菌谷氏鞭毛染色 1000

图1~6 两种鞭毛染色方法的比较

如变形杆菌就可以爬动,侧鞭毛菌也有这种特性,这对于鉴定细菌很有帮助。

在检测某些细菌的鞭毛抗原时,如果该菌株有动力,用血琼脂平板培养的细菌鞭毛染色未见鞭毛或者发现鞭毛脱落,再使用血平板培养的菌落做血清凝集试验,出现阴性结果,这种情况下应该使用肉汤培养物做血清凝集试验,亦可用诱导方法恢复。

利用细菌鞭毛染色技术,可以将有动力的细菌进行归类,特别是在细菌鉴定中具有否定作用。例如,某一菌株经鞭毛染色确定为单端极鞭毛菌,尽管这株菌氧化酶试验阴性,发酵葡萄糖,但也绝不能把它归为肠杆菌科细菌进行鉴定。又如某一非发酵菌株,产生水溶性荧光色素,鞭毛染色为丛鞭毛,但它绝不是绿脓假单胞菌。因此,为了更准确地鉴定细菌,细菌鞭毛染色方法应该作为常规技术在临床实验室广泛应用。

细菌鞭毛染色方法及其应用

参考文献

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(收稿日期:2004-06-03)

(本文编辑:毛家都)

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