冬凌草甲素通过激活ATR通路诱导HEPG2细胞凋亡实验研究-周泽雄

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第18卷 第7期 2016 年 7 月

辽宁中医药大学学报

JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM

Vol. 18 No. 7 Jul .，2016

冬凌草甲素（Oridonion），别名冬凌草素、延命

草宁，是从唇形科（Labtea）香茶菜属（Rabdosia ）植物中分离出的一种贝壳杉烯二萜类天然有机化合物，占冬凌草成分的90%以上，是抗肿瘤活性成分。体外研究实验表明，冬凌草甲素对肺癌、前列腺癌、

乳腺癌、肝癌等[1-5]

多种癌症细胞有明显的抑制作用。其中对人肝癌细胞株HEPG 2抑制作用更为显著。本文进一步探讨冬凌草甲素诱导HEPG 2肝癌

细胞凋亡的作用机制，为临床用药提供理论依据。

1 材料1.1 材料

冬凌草甲素购自上海佰世凯化学科技有限公司（纯度98%），用DMSO 溶解（纯度≤0.1%）。胎牛血清（杭州四季青公司），甲基噻唑

冬凌草甲素通过激活ATR通路诱导HEPG 2细胞凋亡实验研究

周泽雄，曲珍仪，刘颖

（广东药学院，广东 广州 510006）

摘 要：

目的：探讨冬凌草甲素抑制HEGP 2肝癌细胞增殖及其机制研究 方法：MTT 法检测抑制率、结晶紫检测冬凌草甲素诱导HEPG 2肝癌细胞抑制增殖作用、Western blotting 检测不同浓度冬凌草甲素作用HEPG 2肝癌细胞后ATR、H 2AX、γ-H 2AX、P53等蛋白的变化。结果：MTT 法、结晶紫法显示冬凌草甲素对HEPG 2肝癌细胞能够明显抑制，且抑制作用在一定浓度范围内呈计量依赖性；Western blotting 结果显示冬凌草甲素在诱导细胞凋亡过程中ATR、P-P53、γ-H 2AX 表达水平及活性显著增强。结论：冬凌草甲素诱导HEPG 2肝癌细胞发生凋亡可能是通过引起H 2AX 蛋白磷酸化进一步激活ATR 信号通路引起细胞凋亡。

关键词：冬凌草甲素；肝癌；凋亡

中图分类号：R284 文献标志码：A 文章编号：1673-842X (2016) 07- 0019- 03

收稿日期：2015-12-11

作者简介：周泽雄（1989-），男，湖北咸宁人，硕士研究生，研究方向：中药安全性与有效性。通讯作者：刘颖（1974-），女，贵州贵阳人，副教授，博士，研究方向：常见疾病分子机制研究。

Oridonin Induced the HEPG 2 Cells Apoptosis by the

Activation of the ATR Pathway ZHOU Zexiong，QU Zhenyi，LIU Ying

（Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，Guangdong，China）

Abstract：Objective ：To research oridonin induce the HEPG 2 cells apoptosis and its the related mechanism. Methods ：Using MTT and crystal violet staining to study oridonin inhibited HEPG 2 cells proliferative，Western Blotting to detect the change of ATR，H 2AX，γ-H 2AX，P53 and so on protein after oridonin treated HEPG 2 cells. Results ：MTT method and crystal violet staining show that oridonin can significantly inhibited HEPG 2 cells，and the inhibition effect in certain concentrations with a dose-dependent manner. Western blotting showed that the ATR，P-P53，γ-H 2AX protein activity and express has significant enhanced during oridonin induced the HEPG 2 cells apoptosis. Conclusion ：Oridonin induced the HEPG 2 cells apoptosis may be cause by the phosphorylation of H 2AX protein further activate the ATR signaling pathways lead to cell death.

Keywords：oridonin；liver cancer；apoptosis

体现。本实验研究表明，川牛膝水煎液、20%乙醇洗脱部位组分和甾酮组分能够降低高脂血症大鼠血清TC、TG、LDL-C、ALT、AST 值，升高HDL-C 值；降低肝脏组织MDA 水平，升高SOD 水平；说明川牛膝对高脂血症以及肝脂肪变性有一定的防治作用，且其发挥作用的物质基础为20%乙醇洗脱部位组分和甾酮组分。◆

参考文献[ 1 ] 匡海学，程伟.中药性味的可拆分、可组合性研究[ J ] .世界科

学技术-中医药现代化，2009，11 ( 6 )：768-771.

[ 2]

匡海学，王艳宏，王秋红，等.基于中药性味可拆分性和可组合性的中药性味理论研究新模式[ J ] .世界科学技术－中医药现代化，2010，12 ( 6 )：1-5.

[ 3 ] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[ M ] .北京：化学工业出版社，2010：35-36.

[ 4 ] 周峻.探讨血脂的中医学特点及其与湿邪、痰、瘀的区别[ J ] . 中华中医药杂志，2014，29 ( 8 )：2419.[ 5 ]

杨昌宁.谈肝、脾乃生脂（浊）之源[ J ] .中国当代医药，2009，16 ( 5 )：56-57.

DOI：10.13194/j.issn.1673-842x.2016.07.006

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蓝MTT（Gibco公司），二甲亚砜（DMSO）Sigma 公司。H2AX（1∶1000；Cell Signaling），γ-H2AX （1∶1000；Cell Signaling），anti-phospho-p53（1∶1000；Cell Signaling），anti-p53（1∶1000）phospho-ATR（1∶500；Cell Signaling），ERK（1∶1000；Cell Signaling），phospho -CDC25C（ser216）（1∶1000；Cell Signaling），CDC25C（1∶1000；Cell Signaling），CHK1（1∶1000；Cell Signaling），P-CHK1（1∶1000；Cell Signaling），辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗（1∶1 000，Santa Cruz 公司），β-actin 抗体（1∶1000；Santa Cruz 公司），RNA酶、PI 染液（美国Sigma 公司），ECL显色液（美国Thermo公司），其他试剂均购自广州研顺生物技术有限公司。

1.2仪器

倒置显微镜DM IRB（Leica公司），酶联免疫检测仪（美国宝特公司），台式高速低温离心机5840R （德国Eppendorf公司），蛋白电泳及电转移装置（美国BIO-RAD公司），水平、垂直板电泳装置（美国BioRad公司），往复式摇床（美国Labnet公司），FACS Canto II 流式细胞仪（美国BD 公司），1300ⅡA2 生物安全柜（美国Thermo公司），HERAcell240i细胞培养箱（美国Thermo Forma公司）。

2 方法

2.1细胞培养

细胞系HEPG2肝癌细胞由广东药学院基础学院赠送。HEPG2细胞单层接种于含10%灭活的胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养液中，在37 ℃，5% CO2，饱和湿度下培养，2~3 d换1次液，取对数期细胞进行实验。

2.2MTT法检测细胞抑制率

取对数期生长的HEPG2细胞，调整细胞细胞浓度为5×105个/mL于96孔板中，每孔100 μL，培养12 h，加入不同浓度的冬凌草甲素（0~60 μmol/L），每个浓度设8个平行孔，作用24 h，，弃去各孔液体，加入体积分数为10%的MTT（浓度为5 mg/mL）溶液，100 μL/孔，培养箱中孵育4 h 左右，每孔加入终止液140 μL，于平板摇床中震荡30 min，酶标仪490 nm测其OD值，并计算不同浓度梯度冬凌草甲素对肝癌HEPG2细胞的抑制率，实验重复3次。抑制率（%）=[（A对照组-A实验组）/（A对照组-A空白组）]×100%。

2.3结晶紫法检测细胞增殖生长

取对数期生长的HEPG2细胞，调整细胞细胞浓度为5×105个/mL于6孔板中，每孔2 mL，培养12 h，弃除各孔液体，加入浓度为0、15、30、60 μmol/L的冬凌草甲素2 mL，作用24 h，弃除各孔液体，PBS洗3次，每次5 min，4%的多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，每次5 min，加0.5%的结晶紫染色15 min，PBS洗净结晶紫染液，待其干燥后拍照。

2.4蛋白印迹法（Western blotting）检测蛋白表达

用0、15、30、60 μmol/L冬凌草甲素处理HEPG2细胞18 h后，弃除每孔液体，PBS洗3次，每次5 min （此过程应置于冰上进行），每孔各加入100 μL的RIPA裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），于冰上裂解30 min。待其充分裂解后，各收集入1.5 mL的EP管中，进行13000 r/min，4 ℃，离心10 min，收集蛋白，紫

外分光光度计测量其595 nm下的吸光度，-80 ℃保存，根据标准曲线算出其上样蛋白体积，进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，采用NC膜进行转膜，膜用含5%的牛奶TBST溶液进行封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，次日TBST洗3次，每次10 min，相应二抗室温孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min，加发光剂ECL，暗室中压片显影和定影，，实验重复3次。

3 结果

3.1MTT法检测细胞存活率

MTT法检测结果显示：低浓度的冬凌草甲素对肝癌HEPG2细胞抑制作用较弱，高浓度的冬凌草甲素对肝癌HEPG2细胞抑制作用较强，最高可达到80%~90%左右。根据公式：抑制率（%）=[（A对照组-A实验组）/（A对照组-A空白组）]×100%，lgIC50=X m-I[P-（3-P m-P n）/4]；其中X m：lg最大剂量；I：lg最大剂量/相邻剂量，P：阳性反应率之和；P m：为最大阳性反应率；P n：最小阳性反应率；经过3次实验冬凌草甲素对HEPG2肝癌细胞的IC50：（31.92±1.8）μmol/L如图1

所示。

冬凌草甲素浓度（μmol/L）

图1 冬凌草甲素对HEPG增殖抑制作用

3.2结晶紫法检测细胞增殖生长

结果表明：冬凌草甲素药物浓度越高，细胞存活率越低，结晶紫染色越少，拍照后（图2），加入体积分数为35%的乙酸溶液，放于室温下1 h，使其充分吸收细胞中的结晶紫。收集已吸收的结晶紫，设定酶标仪的检测波长，于550 nm处测定每孔细胞的吸光度值（图3），吸光度越小表明细胞死亡率高，细胞存活率越低，冬凌草甲素药物浓度抑制作用越明

显。

空白对照 15 μmol/L

30 μmol/L 60 μmol/L

图2 冬凌草甲素作用于HEPG2细胞结晶紫染色情况

18卷辽宁中医药大学学报

冬凌草甲素药物浓度（μmol/L）

图3 冬凌草甲素结晶紫抑制作用

3.3蛋白印迹法检测蛋白表达

不同浓度下的冬凌草甲素作用HEPG2肝癌细胞24 h后，其蛋白印迹结果表明，随着药物浓度增加，P-ATR、γ-H2AX、P53、Phos-P53、P-CDC25C、P-CDC2、P-CHK1蛋白在细胞体内表达增加，CDC25C蛋白表达逐渐减少，CDC2、CHK1蛋白表达则无差别（如图4所示）。

0 μmol/L 15 μmol/L 30 μmol/L 60 μmol/L

图4 冬凌草甲素对HEPG2细胞相关蛋白的影响

4 讨论

细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，是机体维持自身稳定的一种基本机制，是有许多基因产物及细胞因子参与的一种有序性的细胞自我消亡形式，与细胞程序性死亡相区别。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。细胞凋亡的途径复杂，在不同环境、不同细胞或不同刺激的情况下，细胞凋亡的途径是不同的，而且细胞凋亡的信号途径具有多样性，这使得凋亡的发生及调控机制非常复杂。

哺乳细胞外界或者内部因素干扰DNA发生损伤，DNA损伤后启动激活细胞周期检查点启动修复机制。在DNA损伤早期感应因子有ATM、ATR、DNA-PK 3种蛋白，是DNA损伤通路的感受器，感受DNA结构异常结构的变化，启动信号向下路传递。DNA损伤早期发现ATM和ATR迅速募集到DNA损伤处，通过自生磷酸化使H2AX磷酸化成γ-H2AX焦点，γ-H2AX焦点是DNA损伤最有利的证据[6-8]。活化的ATM和ATR进一步将信号传递给下游，目前研究较多的是ATM-CHK2-CDC25和ATR-CHK1-CDC25两条信号通路来激活细胞周期阻滞。在上述两条信号通路中，当DNA损伤发生后，ATR和ATM迅速磷酸化成为P-ATR[9]和P-ATM激活下游的CHK1和CHK2，激活的CHK1和CHK2进一步磷酸化CDC25。哺乳动物CDC25至少有3种CDC25同源物，分别为CDC25A、CDC25B和CDC25C[10]。CDC25A 主要在G1/S 期转变中起作用，CDC25B 在S 期被激活，CDC25C在G2/M期被激活。

本文中Western Blotting蛋白印迹研究表明，随着冬凌草甲素浓度的增加，P-ATR、P-P53、γ-H2AX、P-CDC2、P-CHK1、P-CDC25C、P-53蛋白表达水平呈逐渐增加趋势，CDC25C、CDC2蛋白表达水平逐渐减少，CHK1蛋白表达水平保持不变，提示冬凌草甲素诱导肝癌细胞凋亡可能与ATR-CHK1-CDC25C信号通路的激活有关，可能会导致细胞发生周期阻滞、DNA损伤修复、细胞凋亡等一系列细胞性活动。进一步为研究冬凌草甲素抗肿瘤作用机制提供一定的试验依据。◆

参考文献

[ 1 ] CHEN JH，WANG SB，CHEN DY，et al. The inhibitory effect of oridonin on the growth of fifteen human cancer lines[ J ] .Chin J

Clni Oncol，2007，4 ( 1 )：403-406.

[ 2 ] LIU JJ，WU XY，PAN XL，et al. Anti-proliferation effect of oridonin on HL-60 cells and its mechanisms of action[ J ] .Chin

Med Sci，2004，19 ( 2 )：134-137.

[ 3 ] LIU JJ，HUANG RW，LIN DJ，et al. Anti-proliferation effects of oridonin on HPB-ALL cells and its mechanisms of action[ J ] .Am

J Hematol，2006，81 ( 2 )：86-94.

[ 4 ] IKezoe T，Chen SS，Tong XJ，et al. Oridonin induces growth inhibition and apoptosis of a variety of human cancers cells[ J ] .Int

J Oncol，2003，23 ( 4 )：1187-1193.

[ 5 ] ZHANG JF，LIU JJ，LIU PQ，et al. Oridonin inhibits cells growth by induction of apoptosis on human hepatocelluar carcinoma

BEL-7402 cells[ J ] .Hepatol Res，2006，35 ( 2 )：104-110.

[ 6 ] Akihisa T，Eiichiro M，XM S，et al. ATM is the Predominant Kinase Involved in the Phosphorylation of Histone H2AX after

Heating[ J ] .J Radiat Res，2010，51 ( 4 )：417-22.

[ 7 ] Mamouni K，Cristini A，Guirouilh-Barbat J，et al. RhoB promotes-H2AX dephosphorylation and DNA double-strand break repair[ J ] .

Mol Cell Biol，2014，34 ( 16 )：3144-55.

[ 8 ] Singh VV，Dutta D，Ansari MA，et al. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus induces the ATM and H2AX DNA damage

response early during de novo infection of primary endothelial

cells，which play roles in latency establishment[ J ] .J Virol. 2014，

88 ( 5 )：2821-2834.

[ 9 ] Abdel-Magid AF. Inhibitors of ATR kinase for treatment of cancer[ J ] .ACS Med Chem Lett，2013，4 ( 8 )：688-689.

[ 10 ] Boutros R，Christine Dozier，Bernard Ducommun. The when and where of Cdc25 phosphatases[ J ] . Curr Opin Cell Biol，2006，

18：185-191.

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细胞凋亡实验步骤及注意事项

细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞与坏死 细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡与坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体与生存中起着非常重要的作用。它就是细胞在一 定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,就是细胞遵循一定规律自己结束生命 的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学与生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网与细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。 在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。 相比之下,坏死就是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期 即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。 一些温与的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度与细胞本身对刺激的敏感 程度。 三尖杉酯碱(HT)就是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0、02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342与碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。 细胞膜就是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着

p38MAPK信号转导通路与细胞凋亡研究进展.

综述与进展 p38M APK信号转导通路与细胞凋亡研究进展 王誉霖1,张励才2 作者单位：1.安徽省宣城市人民医院麻醉科242000;2江苏徐州医学院作者简介： 王誉霖（1978，女,吉林市人，住院医师，硕士。研究方向：疼痛信号转导及调控。 主题词p38丝裂原活化蛋白激酶类；细胞凋亡;综述 中图分类号R345文献标识码A文章编号1674 8166（201012 1665 03 丝裂原活化蛋白激酶（mitog en2activated pr otein kinase,MA PK级联是细胞内广泛存在的丝/苏氨酸蛋白激酶超家族，是将细胞质的信号传递至细胞核并引起细胞核发生变化的重要物质。目前在人类已鉴定了4条MAPK途径:细胞外信号调节蛋白 激酶（ex tra cellular sig nal regulated protein kinase,ERK途径,C Jun 基末端激酶（c Jun N term inal kinase,JN K/应激活化蛋白（stress activated protein kinase,SAPK途 径,ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶1（big MAP MAP kinase,BM K1途径和p38M APK（p38mitogen activated protein kinases,p38MA PK 传导途径［1］。p38 信号途径是 MAPK家族中的重要组成部分，多种炎症因子和生长因子及应激反应可使p38MAPK的酪氨酸和苏氨酸双磷酸化，从而激活p38M APK,使它在炎症、细胞应激、凋亡、细胞周期和生长等多种生理和病理过程中起重要作用。因此,p38MAPK 通路参与了多种刺激引起的信号级联反应，表明它在引起多种细胞反应中起重要作用，并且,p38在细胞凋亡中也有着重要的调节效应。1 p38M APK信号转导通路 丝裂原活化蛋白激酶（m ito gen activated pr otein kinase,MA PK级联是细胞内重 要的信号转导系统之一。在哺乳动物细胞M APK通路主要有:细胞外信号调节激酶（extracellular signal r eg ulated kinase,ERK ffi路、p38MA PK 通路、c jun 氨基末端激酶（c jun N term inal kinase,JNK通路和ERK5 通路［1］。其中,p38MAPK 是M APK 家族中的重要成员。

冬凌草甲素资料

我公司冬凌草相关产品市场分析 1冬凌草及有效成分介绍 冬凌草为唇形科香茶菜属碎米桠干燥地上部分，一般夏秋收割 多年生草本植物，霜降过后，与霜周身结薄如禅意的银白色冰凌，因此又称冰凌花，冰凌草。中药中用清热解毒，活血止疼 冬凌草中主要成分，冬凌草甲素、冬凌草乙素、冬凌草丙素、冬凌草丁素、迷迭香酸等 冬凌草甲素CAS ＃：28957-04-2分子式： C20-H28-O6纯度： >98% , HPLC最大吸收l max：237nm熔点 248-250°C 冬凌草甲素对热不稳定，极易分解，在生产储存过程中都会有含量下降的情况发生， 药理作用：冬凌草甲素对多种癌细胞具有很强的杀灭抑制作用，主要用于抗癌，抗菌、抗肿瘤、杀虫清热解毒、消炎止痛、健胃活血及等作用 2冬凌草产品分类 冬凌草目前有市场的成分为冬凌草甲素，根据用途客户等我们将产品分为3类 第一类：冬凌草甲素98%，研究方向抗M2型白血病注射剂，效果很好，因为水溶性问题，制剂紧张缓慢，现在在原基础上做分子修饰，增加水溶性。美白作用，客户提供。目前客户有国内制药公司、保健品公司、各种院校或研究机构、对照品公司、国外贸易公司 第二类：冬凌草甲素1%左右，客户主要用于做冬凌草片和冬凌草糖浆，根据我们了解，目前客户大多数采取自己买原料自己提取，原因：1药典有明确的工艺过程，难度不大，容易实现；2目前需求量不大，没有必要采购；3国家政策原因，外购风险大；4能满足自己生产规格产品价格贵，外购不划算 第三类：冬凌草比例提取物， 3具体工作 第一类产品，除了国内制药公司通过临床后有可能上量外，其余客户上规模采购的可能性不大，我们主要配合现在正在做临床研究的制药公司做好产品服务，有机会获得以后的长期订单；我们在冬凌草甲素98%目前占据了国内一半以上的产量，做好宣传，尽量拿掉中间环节，把利润最大化 第三类产品，这类产品市场采购量会很少，因为产品的功效能用到保健品或者化妆品方面的很少，可以用下脚料生产部分产品，低成本，真货，低价 重点是做好第二类产品的主动销售，按正常冬凌草片、冬凌草胶囊、复方冬凌草片都可以直接使用我们生产的冬凌草提取物1%左右产品，冬凌草糖浆具体使用规格有待考证 冬凌草片 0.25克重本品每片含冬凌草以冬凌草甲素计，不得少于0.40mg。实际根据药典工艺生产的话在1.5mg-16.5mg 不等 我们需要做的工作是说服客户使用我们的产品，针对设想和实际碰到的问题，一步一步化解我们的优势：1工艺先进，采用低温提取、萃取、浓缩技术，最大限度的保证冬凌草的原生品质和冬凌草甲素的有效含量；2价格优势，比市场上同品质同规格的产品有明显的价格优势，比厂家自己生产更具优势；3质量稳定，大批次规模化生产，有效保证产品的均一性；4专业服务，可以根据客户的特殊需求，定制专属于客户的优质产品，并且在客户生产、认证等过程中提供免费的咨询和技术相关服务；5采用我们工艺提取的冬凌草原料放置2年含量下降约10%，普通工艺提取的冬凌草原料含量下降约60%

高中生物细胞凋亡的知识点(一)

高中生物细胞凋亡的知识点(一) ［背景知识互动］ 1.人的自然寿命是多少岁？人的寿命的长短与什么有关？ 2.人体每天都有哪些细胞死亡？举例说明。 答案: 1.人的自然寿命是120岁。人的寿命与细胞衰老有直接关系。 2.人体每天死亡的细胞有小肠上皮细胞、皮肤细胞、血红细胞等。知识链接 人体的衰老与细胞的衰老有关。 人体内每天都有大量的细胞死亡。 ［典型例题探究］ 【例1】什么是细胞凋亡？ 解析：高等真核生物的大多数细胞，在丧失生理功能或严重受损时，激活固有的细胞自杀程序而自灭。这一过程称为细胞程序化死亡。细胞凋亡这个词指细胞程序化死亡所表现的生理变化和形态变化，其中包括细胞收缩、膜泡化、染色质浓缩和降解成小片段。 答案：细胞凋亡是指生物体生长发育过程中，由基因控制的，按照一定的程序发生的'细胞死亡，因而细胞凋亡又称为程序性死亡。规律发现 细胞凋亡中的细胞经常降解成为膜包裹的凋亡体，被巨噬细胞或邻近的细胞吞噬或消化，但不产生炎症反应。 【例2】细胞凋亡的大致过程可分为三个阶段，它们是：________、________、 ________。 解析：.细胞凋亡的过程的三个阶段为： 凋亡的起始：细胞皱缩，细胞连接消失，内质网膨胀，染色体固缩并沿着核膜分布，但细胞膜依然完整。 凋亡小体的形成：核膜破裂，染色体断裂为大小不等的片段，与一些细胞器聚集后被内折的细胞膜包围，在细胞表面形成了许多泡状和芽状的突起，这些突起叫做凋亡小体。 细胞的解体：凋亡小体逐渐与细胞分离，脱落至细胞间质，最终被周围的细胞吞噬并消化。 答案：凋亡的起始凋亡小体的形成细胞的解体注意对细胞凋亡过程的掌握。 1

细胞凋亡检测,细胞凋亡实验步骤,检测方法

细胞凋亡检测，细胞凋亡实验步骤，检测方法 一、定性和定量研究 只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜） 进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。 二、区分凋亡和坏死 可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测等。 不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等。 三、样品来源不同选择 组织：主要用形态学方法(HE染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。 四、细胞凋亡检测 1、早期检测: 1) PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测 2)细胞内氧化还原状态改变的检测 3)细胞色素C的定位检测 4) 线粒体膜电位变化的检测 2、晚期检测： 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在 180-200 bp 的DNA片段。 对于晚期检测通常有以下方法： 1) TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记) 2) LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 3) T elemerase Detection (端粒酶检测) 3、生化检测： 1）典型的生化特征：DNA 片段化 2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等 3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记） 4）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA 片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。 4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测) 当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，

急性髓系白血病治疗新突破：冬凌草甲素治疗白血病

急性髓系白血病治疗新突破：冬凌草甲素治疗白血病 中新网上海3月29日电(记者陈静)上海交通大学医学基因组学国家重点实验室、上海血液学研究所(以下简称上海血研所)在急性早幼粒细胞白血病应用全反式维甲酸和三氧化二砷联合靶向治疗获得了成功后，又致力于将分子靶向治疗的理念进一步拓展至其它类型白血病。 记者今日获悉，上海血研所与中科院上海生命科学研究院健康科学研究所(健康所)的研究人员用冬凌草甲素靶向治疗伴有t(8;21)(q22;q22)染色体易位的急性髓系白血病(AML)取得新的突破。 据介绍，伴t(8;21)的急性髓系白血病是AML中最常见的一种类型，占所有AML病例的12-20%，目前，主要以蒽环类和阿糖胞苷化疗药物为基础的联合方案进行治疗，但效果欠佳。患者中位生存期仅2年，5年生存率低于40%。 冬凌草甲素是从唇形科香茶菜属植物中分离出的一种贝壳 杉烯二萜类天然有机化合物。研究发现，冬凌草甲素可以选择性地杀伤t(8;21)白血病细胞，且上调细胞内活性氧水平。它可以与该类白血病特异的致癌蛋白AML1-ETO结合，使产生截短的AML1-ETO，后者扮演着肿瘤抑制因子的作用。此外，冬凌草甲素还可以抑制白血病起始细胞的活性，实验表明，在与其他白血病治疗药物联合使用后可显著延长携带

t(8;21)的AML白血病小鼠的生存期。上述研究结果提示冬凌草甲素对于伴t(8;21)的AML具有潜在的靶向治疗作用，有可能成为中草药现代化和转化医学研究的典范。 作用 [1]冬凌草性味苦、甘、微寒。冬凌草有良好清热毒、活血止痛、抑菌、抗肿瘤作用，主治咽喉肿痛、扁桃体炎、感冒头痛、气管炎、慢性肝炎、关节风湿痛、蛇虫咬伤。全株对食管癌、乳腺癌、直肠癌等有缓解作用”。冬凌草的煎剂和醇剂可有效地抑制甲型、乙型溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌等，从而提高肌体抵抗力，迅速降低因炎症引起的白血球增高。冬凌草与化疗、其它抗癌药物配合治疗癌症有明显地增效作用，这是一般抗癌药物所不及的。 据《现代中药学大辞典》记载，冬凌草的性味和功用为：苦、甘、微寒，清热、解毒、活血止痛，用于咽喉肿痛、扁桃体炎、蛇虫咬伤、风湿骨痛等。主要成分有挥发油和二萜类、冬凌夏草甲素、乙素、丙素、丁素、戊素、辛素以及α一香树脂醇，还有5个未知结构成分。还含有无机元素铁、锌、硒等。主要作用有：抗肿瘤、抗菌作用和解热降燥等功效。

常见的信号通路

1JAK-STAT信号通路 1)JAK与STAT蛋白 JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。(1)酪氨酸激酶相关受体（tyrosinekinaseassociatedreceptor） 许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT信号通路来传导信号，这包括白介素2?7（IL-2?7）、GM-CSF（粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子）、GH（生 长激素）、EGF（表皮生长因子）、PDGF（血小板衍生因子）以及IFN（干扰素）等等。这些细胞因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段具有酪氨酸激酶JAK 的结合位点。受体与配体结合后，通过与之相结合的JAK的活化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。 (2)酪氨酸激酶JAK（Januskinase） 很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体，它们统称为酪氨酸激酶受体（receptor tyrosinekinase,RTK），而JAK却是一类非跨膜型的酪氨酸激酶。JAK是英文Januskinase的缩写，Janus在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。之所以称为两面神激酶，是因为JAK既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸、JAK1个成员：4蛋白家族共包括JAK结构域的信号分子。SH2化多个含特定

JAK2、JAK3以及Tyk2，它们在结构上有7个JAK同源结构域（JAKhomologydomain,JH），其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、JH6和JH7是受体结合区域。 (3)转录因子STAT（signaltransducerandactivatoroftranscription）STAT被称为“信号转导子和转录激活子”。顾名思义，STAT在信号转导和转录激活上发挥了关键性的作用。目前已发现STAT家族的六个成员，即STAT1-STAT6。STAT蛋白在结构上可分为以下几个功能区段：N-端保守序列、DNA结合区、SH3结构域、SH2结构域及C-端的转录激活区。其中，序列上最保守和功能上最重要的区段是SH2结构域，它具有与酪氨酸激酶Src的SH2结构域完全相同的核心序列“GTFLLRFSS”。 2)JAK-STAT信号通路 与其它信号通路相比，JAK-STAT信号通路的传递过程相对简单。信号传 递过程如下：细胞因子与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化，这使得与受体偶联的JAK激酶相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK激活后催化受体上的酪氨酸残基发生磷酸化修饰，继而这些磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成“停泊位点”（dockingsite），同时含有SH2结构域的STAT蛋白被招募到这个“停泊位点”。最后，激酶JAK 催化结合在受体上的STAT蛋白发生磷酸化修饰，活化的STAT蛋白以二 聚体的形式进入细胞核内与靶基因结合，调控基因的转录。值得一提的是，一种JAK激酶可以参与多种细胞因子的信号转导过程，一种细胞因子的信号通路也可以激活多个JAK激酶，但细胞因子对激活的STAT分子却具有一定的选择性。例如IL-4激活STAT6，而IL-12 。STAT4却特异性激活

关于细胞凋亡与疾病

细胞凋亡与疾病 细胞凋亡指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡。细胞凋亡对胚胎发育及形态发生组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用[1]。自1972年Kerr提出细胞凋亡这一概念后，从20世纪80年代末期开始成为肿瘤病因学、病理学研究热点，近几年的研究在凋亡信号转导途径、细胞凋亡的生化反应机制及细胞凋亡的调控基因，细胞凋亡与疾病的关系等方面都取得了显著的进展[2]。文章就细胞凋亡与疾病的关系进行综述。 1、概述 早在1972年，Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有两种死亡形式：一种是早被熟知的细胞坏死(Necrosis)，另一种是细胞凋亡(Apoptosis)[3]。 1.1概念 凋亡(apoptosis)一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡(programmed cell death)。一般表现为单个细胞的死亡，且不伴有炎症反应。细胞凋亡又称程序性细胞死亡(PCD)，指的是细胞将自身裂解为许多膜小泡的一种精

确调节的细胞死亡过程，是有机体为保持自身组织稳定、调控自身细胞的增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞主动性死亡，一种正常的生理过程[4]。细胞凋亡参与调节机体细胞生长与更新间的平衡稳定，在机体发育过程中和成年机体新陈代谢中都起着重要作用。但近年来的研究表明，细胞凋亡还与多种疾病(如发育畸形、神经退化症、自身免疫性疾病、肿瘤、艾滋病等)的发生发展有关，从而使细胞凋亡研究成为生命科学研究的热点之一[5]。 2、细胞凋亡的形态学和生化特征 2.1 形态学特征 细胞凋亡时伴随着细胞膜表面、细胞质和核的一系列形态学改变，首先出现细胞体缩小、胞核固缩、胞浆密度增高，继而胞膜内陷将细胞自行分割为多个有膜包绕的凋亡小体(apoptotis bodies)。凋亡小体几乎立即被邻近的吞噬细胞所吞噬。吞噬细胞内的凋亡小体能停留数小时，可借助组织切片染色用光学显微镜观察[6]。在凋亡发生的全过程中，细胞膜一直保持完整。胞内容物不释放出来，所以不引起周围的炎症反应。同一组织中，不同细胞发生凋亡的过程并不同步[7]。 2.2生化特征 细胞凋亡时，早期Ca2+内流引起胞质中Ca2+浓度持续升高，激活了Ca2+依赖性核酸内切酶，于180碱基对处将DNA 切断，胞质内蛋白质发生交联，产生单个核小体和穴聚核小

细胞常见信号通路图片合集

目录 actin肌丝 (5) Wnt/LRP6 信号 (7) WNT信号转导 (7) West Nile 西尼罗河病毒 (8) Vitamin C 维生素C在大脑中的作用 (10) 视觉信号转导 (11) VEGF，低氧 (13) TSP-1诱导细胞凋亡 (15) Trka信号转导 (16) dbpb调节mRNA (17) CARM1甲基化 (19) CREB转录因子 (20) TPO信号通路 (21) Toll-Like 受体 (22) TNFR2 信号通路 (24) TNFR1信号通路 (25) IGF-1受体 (26) TNF/Stress相关信号 (27) 共刺激信号 (29) Th1/Th2 细胞分化 (30) TGF beta 信号转导 (32) 端粒、端粒酶与衰老 (33) TACI和BCMA调节B细胞免疫 (35) T辅助细胞的表面受体 (36) T细胞受体信号通路 (37) T细胞受体和CD3复合物 (38) Cardiolipin的合成 (40) Synaptic突触连接中的蛋白 (42) HSP在应激中的调节的作用 (43) Stat3 信号通路 (45) SREBP控制脂质合成 (46) 酪氨酸激酶的调节 (48) Sonic Hedgehog (SHH)受体ptc1调节细胞周期 (51) Sonic Hedgehog (Shh) 信号 (53) SODD/TNFR1信号 (56) AKT/mTOR在骨骼肌肥大中的作用 (58) G蛋白信号转导 (59) IL1受体信号转导 (60) acetyl从线粒体到胞浆过程 (62) 趋化因子chemokine在T细胞极化中的选择性表达 (63) SARS冠状病毒蛋白酶 (65) SARS冠状病毒蛋白酶 (67) Parkin在泛素-蛋白酶体中的作用 (69)

细胞凋亡及周期阻滞基本信号通路

CELL DEATH AND CELL-CYCLE CHECKPOINT DURING DNA DAMAGE 细胞死亡及周期阻滞基本信号通路 有哪些因素可引起DNA损伤？DNA损伤的结局如何？ （课件） (一)DNA损伤的原因 环境因素，化学因素，生物因素例如： UV ,离子辐射，基因毒性化学试剂引起ssDNA/dsDNA 损伤，DNA两条链交联或链内交联。正常细胞线粒体的一些代谢物（ROS）活泼氧类过多引起损伤。 (二) DNA损伤结局： 急性效应：干扰核酸代谢，触发细胞周期阻滞或死亡 长期效应：不可逆转突变导致肿瘤 细胞周期阻滞，衰老，肿瘤/癌症，有丝分裂危象 (一)DNA损伤的原因 1.DNA分子的自发性损伤 (1)DNA复制中的错误。 (2)DNA的自发性化学变化 a.碱基的异构互变性损伤 b.碱基的脱氨基作用 c.脱嘌呤与脱嘧啶 d.碱基修饰与链断裂 2.物理因素引起的DNA损伤 (1)紫外线引起的DNA损伤 (2)电离辐射引起的DNA损伤 a.碱基变化 b.脱氧核糖变化 c.DNA链断裂 d.交联 3.化学因素引起的DNA损伤 (1)烷化剂对DNA的损伤 a.碱基烷基化 b.碱基脱落 c.断链 d.交联 (2)碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤 DNA损伤的后果 1.点突变(point mutation)指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤(A与G之间的相互替代)、嘧啶替代嘧啶(C与T之间的替代)称为转换(transition)；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换(transvertion)。 2.缺失(deletion)指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。 3.插入(insertion)指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动(reading frame shift)，使其后所译读的 氨基酸序列全部混乱，称为移码突变(frame shift mutaion)。 4.倒位或转位(transposition)指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。 5.双链断裂已如前述，对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。 （2）THE CONSEQUENCES OF DNA INJURY

《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程

流式检测细胞凋亡 Annexin V 检测细胞凋亡 (2) 实验原理 (2) 实验用品 (2) 操作步骤 (3) Annexin V Blocking (5) 凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7) 实验原理 (7) 实验用品 (8) 操作步骤 (9) BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12) 实验原理 (12) BrdU Flow Kits 试剂盒 (12) 结果分析 (17) 流式仪器设置指南 (18) 线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22) 实验原理 (22) 实验用品 (22) 样本制备 (23) 结果分析 (24) 注意事项 (24) Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26) 实验原理 (26) 实验步骤 (27) 结果分析 (28)

Annexin V 检测细胞凋亡 实验原理 Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-) 与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。 实验用品 1. 一次性12×75mm Falcon试管。 2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。 3 3. 微量加样器和加样头。

细胞凋亡的信号通路

山东农业大学学报(自然科学版),2015,46(4):514-518VOL.46N0.42015 Journal of Shandong Agricultural University(Natural Science Edition)doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2015.04.007 细胞凋亡的信号通路 谢昆,李兴权 红河学院生命科学与技术学院,云南蒙自661199 摘要:细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种方式，与自噬和坏死有明显的区别。细胞凋亡的信号途径比较复杂，在凋亡诱导因子的刺激下经历不同的信号途径。本文就细胞凋亡的三条信号通路——线粒体途径、内质网途径和死亡受体途径做一综述，以便为人们进一步了解细胞凋亡发生的机制，从而对癌症及其他一些相关疾病的治疗奠定基础。关键词:细胞凋亡;信号通路;线粒体途径;内质网途径;死亡受体途径 中图法分类号:R329.2+8文献标识码:A文章编号:1000-2324(2015)04-0514-05 The Signal Pathway of Apoptosis XIE Kun,LI Xing-quan Department of Life Science and Technology/Honghe University,Mengzi661199,China Abstract:Apoptosis is a process of programmed cell death which distinguishes from autophagy and necrosis.The signal pathways of apoptosis are complex and different under apoptosis induced factor stimulating.Three kinds of signal pathways of apoptosis including Mitochondrial pathway,Endoplasmic Reticulum pathway and Death Receptor pathway were summarized in this review in order to make people further comprehend the mechanism of apoptosis，so that it should make a basis for us all to treat cancer and other related diseases. Keywords:Apoptosis;signal pathway;Mitochondrial pathway;Endoplasmic Reticulum pathway;Death Receptor pathway 细胞凋亡是细胞程序性死亡（Program cell death，PCD）中特有的一种细胞死亡方式，是细胞在一系列内源性基因调控下发生的自然或生理性死亡过程。Kerr等1972年最早提出了凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）的概念[1]，随后Paweletz等对其进行了详细的描述[2,3]。在形态学上，凋亡表现为核浓缩、细胞质密度增高、染色质凝聚、核膜破裂、核内DNA断裂、细胞集聚成团、形成凋亡小体(Apoptosome)等特征，这些凋亡小体最终被巨噬细胞清除，但不会引起周围细胞的炎症反应，另外，凋亡发生在单个细胞之间[4,5]。坏死，通常是由相邻的多个细胞之间发生细胞肿胀，细胞核溶解，细胞膜破裂，细胞质流入到细胞间质中，并伴发一系列的炎症反应，从而与凋亡表现为本质性区别[6,7]。 目前认为，凋亡发生的途径分为三种。第一种是线粒体途径，也称为内源性途径，该途径包括两类，第一类需要通过激活Caspase通路促进凋亡，在一序列凋亡诱导因素刺激下，线粒体中的Cyt C（细胞色素C）释放至细胞质中，从而与Apaf-1(Apoptosis protease activating factor1，凋亡蛋白酶活化因子1)结合形成多聚体，形成的多聚体再进一步与凋亡起始分子Caspase-9结合形成凋亡小体，凋亡小体激活Caspase-9，从而激活下游的凋亡执行分子Caspase-3，Caspase-6和Caspase-7等诱导细胞凋亡的级联反应；第二类是不依赖于Caspase途径的，通过线粒体释放AIF（Apoptosis induce factor，凋亡诱导因子）直接诱导凋亡的发生。但是在细胞内，直接检测AIF比较困难，而且AIF的变化不一定能代表凋亡发生的程度，因为引起凋亡发生的途径不一。第二种是死亡受体途径（也称为外源性途径），经由死亡受体（如TNF，Fas等）与FADD的结合而激活Caspase-8和caspase-10，进一步激活凋亡执行者caspase-3,6,7，从而促进凋亡的发生；第三条途径是内质网途径，内质网应激（蛋白质错误折叠或未折叠、内质网胁迫）会导致细胞内钙超载或钙离子稳态失衡一方面激活caspase-12，caspase-12进一步激活caspase-9而促进凋亡的发生，另一方面诱导Bcl-2(B细胞淋巴瘤蛋白)家族中促凋亡蛋白Bax和Bak的激活诱导凋亡[8]。 1凋亡的线粒体途径 在哺乳动物中，由于凋亡的激活需要线粒体中细胞色素C（CytC）的释放，因此CytC由线粒体膜间隙释放到细胞质中的多少可以作为判断凋亡发生强弱的指标之一。有研究认为，CytC的释放是通过Bcl-2家族调控线粒体膜透化（Mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP），科学 收稿日期:2013-03-07修回日期:2014-09-11 基金项目:云南省科技厅应用基础研究面上项目(2010ZC151) 作者简介:谢昆(1975-),男,云南富民人,博士研究生,研究方向为动物生物化学与分子生物学.E-mail:xk_biology2@https://www.wendangku.net/doc/418669840.html, 数字优先出版:2015-06-03https://www.wendangku.net/doc/418669840.html,

(完整word版)细胞凋亡过程

细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭，不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号转导也不相同，客观上说对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的，比较清楚的通路主要有：1）细胞凋亡的膜受体通路：各种外界因素是细胞凋亡的启动剂，它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡，我们以Fas -FasL为例：Fas是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，它与FasL结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。它的活化包括一系列步骤：首先配体诱导受体三聚体化，然后在细胞膜上形成凋亡诱导复合物，这个复合物中包括带有死亡结构域的Fas相关蛋白FADD。Fas又称CD95，是由325个氨基酸组成的受体分子，Fas一旦和配体FasL结合，可通过Fas分子启动致死性信号转导，最终引起细胞一系列特征性变化，使细胞死亡。Fas作为一种普遍表达的受体分子，可出现于多种细胞表面，但FasL的表达却有其特点，通常只出现于活化的T细胞和NK细胞，因而已被活化的杀伤性免疫细胞，往往能够最有效地以凋亡途径置靶细胞于死地。Fas分子胞内段带有特殊的死亡结构域（DD,death domain）。三聚化的Fas和FasL结合后，使三个Fas分子的死亡结构域相聚成簇，吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD。FADD是死亡信号转录中的一个连接蛋白，它由两部分组成：C端（DD结构域）和N端（DED）部分。DD结构域负责和Fas分子胞内段上的DD结构域结合，该蛋白再以DED连接另一个带有DED的后续成分，由此引起N段DED随即与无活性的半胱氨酸蛋白酶8（caspase8）酶原发生同嗜性交联，聚合多个caspase8的分子，caspase8分子遂由单链酶原转成有活性的双链蛋白，进而引起随后的级联反应，即Caspases，后者作为酶原而被激活，引起下面的级联反应。细胞发生凋亡。因而TNF诱导的细胞凋亡途径与此类似2）细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途径线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心。实验表明了细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体，caspase-9被激活，被激活的caspase-9能激活其它的caspase如caspase-3等，从而诱导细胞凋亡。此外，线粒体还释放凋亡诱导因子，如AIF，参与激活caspase。可见，细胞凋亡小体的相关组份存在于正常细胞的不同部位。促凋亡因子能诱导细胞色素C 释放和凋亡小体的形成。很显然，细胞色素C从线粒体释放的调节是细胞凋亡分子机理研究的关键问题。多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途经。有人认为受体介导的凋亡途经也有细胞色素C从线粒体的释放。如对Fas应答的细胞中，一类细胞（type1）中含有足够的胱解酶8 （caspase8）可被死亡受体活化从而导致细胞凋亡。在这类细胞中高表达Bcl-2并不能抑制Fas诱导的细胞凋亡。在另一类细胞（type2）如肝细胞中，Fas受体介导的胱解酶8活化不能达到很高的水平。因此这类细胞中的凋亡信号需要借助凋亡的线粒体途经来放大，而Bid -- 一种仅含有BH3结构域的Bcl-2家族蛋白是将凋亡信号从胱解酶8向线粒体传递的信使。尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程，到目前为止，至少已有14种Caspase被发现，Caspase分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶，根据功能可把Caspase基本分为二类：一类参与细胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二类参与细胞凋亡，包括caspase2,3,6,7,8,9.10。Caspase家族一般具有以下特征：1)C端同源区存在半胱氨酸激活位点，此激活位点结构域为QACR/QG。2)通常以酶原的形式存在，相对分子质量29000-49000(29-49KD），在受到激活后其内部保守的天冬氨酸残基经水解形成大（P20）小（P10）两个亚单位，并进而形成两两组成的有活性的四聚体，其中，每个P20/P10异二聚体可来源于同一前体分子也可来源于两个不同的前体分子。3)末端具有一个小的或大的原结构域。参与诱导凋亡的Caspase分成两大类：启动酶（inititaor）和效应酶（effector）它们分别在死亡信号转导的上游和下游发挥作用。

冬凌草甲素对哮喘小鼠气道炎症及气道重塑的影响

目录 1.论文：冬凌草甲素对哮喘小鼠气道炎症及气道重塑的影响 中英缩略词对照表 (1) 中文摘要 (2) 英文摘要 (4) 前言 (6) 材料与方法 (9) 结果 (22) 讨论 (36) 结论 (40) 参考文献 (41) 附图 (45) 2.综述 (49) 3.致谢 (57) 4.作者简介 (58)

中英文缩略词表 缩略词英文全称中文全称 AB-PAS alcian blue/periodic acid schiff 阿利辛蓝-过碘酸雪夫 BALF bronchoalveolar lavage fluid 支气管肺泡灌洗液 DEPC diethyl sulfoxide焦碳酸二乙酯DAB diaminobenzidine二氨基联苯胺DMSO dimethyl sulfoxide二甲亚砜DEX dexamethasone地塞米松EOS eosinophil嗜酸粒细胞 ELISA enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附实验 HE hematoxylin and eosin苏木素-伊红IHC immunohistochemistry免疫组织化学染色IL interleukin白细胞介素OVA ovalbumin鸡卵清白蛋白RT-PCR real-time PCR实时荧光定量PCR Th1T-helper cell1辅助性T细胞1型Th2T-helper cell2辅助性T细胞2型Treg regulatory T cell调节性T淋巴细胞Th17T-helper cell17辅助性T细胞17 TGF-β1Transforming growth factor beta1转化生长因子β1 1

KEGG上的信号通路图怎么看

KEGG上的信号通路图怎么看？ 提示：请点击标题下方蓝色“实验万事屋”，添加关注后，发“嗯”可以查看我们之前的文章。未经允许，其他公众号不得转载哦！ 想要把自己研究的分子扯上明星分子或者明星通路？那是不难，难的是具体到底要怎么去扯，芯片结果啊，生信结果啊，都会给你提示，但真的要具体扯上去，还得看懂那些七七八八的信号通路图。 KEGG Pathway上有着大量的信号通路图，画得一个复杂啊！巨坑爹有没有？曾经有师弟说我之前曾经把Wnt通路描述错了，他师兄告诉他，应该是GSK-3β磷酸化抑制β-Catenin降解，并促进它入核的。在这里，我们只能默默地祝福这位师兄了…… 那我们就用Wnt通路来做例子吧。先上KEGG下载一个Wnt的信号通路图，如下： 绝壁是很高大上的不是么？这要咋看呢？其实这张图上把三个Wnt通路都画上去了，也就是Wnt/β-Catenin（经典Wnt通路），Wnt/PCP（平面的细胞极性途径）和Wnt/Ca2+（Wnt/钙离子）三条信号通路组成，我们就删减一下，就光看经典的Wnt通路，就变成了下面这个模样：

感觉还是很高大上有木有？那就再删减一下，把它变成经典Wnt信号通路的骨架会是什么样呢？就是这样： 简洁明快了吧，但要怎么来看懂这样的图呢？我们来看一下KEGG Pathway的具体图例：

把这些图例用来解释经典Wnt信号通路骨架图，就变成了： 看懂了么？那给你从左到右解释一下： 1）Wnt激活膜上受体，将信号传递到第二信使Dvl，活化的Dvl抑制由Axin、APC 和GSK-3β组成的复合物的活性,使β-catenin不能被GSK-3β磷酸化。 2）磷酸化的β-catenin才可通过泛素化(ubiquitination)而被胞浆内的蛋白酶体所降解，由于非磷酸化的β-catenin不能被蛋白酶体降解，从而导致β-catenin在胞浆内积聚，并移向核内。

细胞凋亡信号转导途径及调控的研究进展

细胞凋亡信号转导途径及其调控的研究 进展 学科：基础兽医学 专业：药理毒理学 姓名：ma cai hui 学号：13203023

细胞凋亡信号转导途径及其调控的研究进展 摘要目的：为了研究抗肿瘤药物促使细胞凋亡的作用机理，探讨细胞凋亡的信号转导途径以及相关基因对其的调控。方法：查阅近年的国内外相关文献，归纳整理细胞凋亡的信号转导途径和相关的调控基因。结果：介绍了细胞凋亡存在三条主要通路：线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路，各通路间互相联系，共同调节细胞凋亡。以及调控凋亡的主要基因，Bcl-2、p53、c-myc、P16、Rb。结论：研究抗肿瘤药物的作用机理应从以上三条凋亡途径和相关调控基因出发。 关键词细胞凋亡；信号转导途径；基因调控；caspase Progress study on signal transmission pathways and regulation of cell apoptosis Wang Saiqi School of Pharmaceutical Sciences, Zhengzhou University, Zhengzhou, 450001 Key words : cell apoptosis; signal transmission pathways; gene regulation; caspase Abstract Aim : To check the mechanism of apoptosis induced by anticarcinogen and research the cell apoptosis signal transmission pathways and related genes on its regulation. Methods: Signal transmission pathways and related genes were concluded by referring to related papers at home and abroad in recent years. Results: Three main signal transmission pathways, death receptor-mediated pathways, mitochondrial pathway, endoplasmic reticulum pathway and several main regulator genes,Bcl-2,p53, c-myc,P16,Rb were introduced. Conclusions: Research on the mechanism of anticarcinogen should start from the said signal transmission pathways and genes. 1 细胞凋亡概述 细胞凋亡，又名细胞程序性死亡，是诱导性的细胞自杀过程，它使生物体可以有序地清除受损伤或无用的细胞。自从1927年John Kerr第一次提出凋亡这一概念后，人们发现它在多细胞生物的基本生命活动中起着十分重要的作用。它对于