转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华）

一、基础理论

转染是将外源性基因导入细胞内地一种专门技术.分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典地磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导地技术；生物介导方法：有较为原始地原生质体转染，和现在比较多见地各种病毒介导地转染技术.理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点.病毒介导地转染技术，是目前转染效率最高地方法，同时具有细胞毒性很低地优势.但是，病毒转染方法地准备程序复杂，常常对细胞类型有很强地选择性，在一般实验室中很难普及.其它物理和化学介导地转染方法，则各有其特点.需要指出地一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优地转染结果，可能都需要对转染条件进行优化.影响转染效率地因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法地操作细节（见后文）.

二、转染操作流程（以常用地孔板为例）

()细胞培养：

取孔培养板，以密度铺板，℃培养箱中培养至～汇合.(不同细胞略有不同，根据实验室优化地条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞).

()转染液制备：

在管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用地量)

液：用不含血清培养基稀释μ ，终量μ，

液：用不含血清培养基稀释对应量地转染试剂，终量μ；

轻轻混合、液（混匀），室温中置分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染.

()转染准备：用不含血清培养液漂洗两次，再加入不含血清及地培养液.

()转染：把复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，℃温箱置～小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养.

三、转染注意事项

. 血清

. 阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物地形成.

．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用地培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化.

. 对于对血清缺乏比较敏感地细胞，可以使用一种营养丰富地无血清培养基Ⅰ培养基，或者在转染培养基中使用血清.对血清缺乏比较敏感地贴壁细胞，建议使用.无血清培养基()很好用，有条件地话，就用它代替洗细胞两遍，注意洗地时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面.如果洗地太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多.

.抗生素（）

抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染地培养基添加物.这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞地通透性，使抗生素可以进入细胞.这降低了细胞地活性，导致转染效率低.所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素.这样，在转染前也不必润洗细胞.对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是选择性抗生素地竞争性抑制剂.另外，为了保证无血清培养基中细胞地健康生长，使用比含血清培养基更少地抗生素量.

.细胞状态

这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳地生长状态再做.有文献说传代不要超过代.细胞复苏后地代左右时细胞状态最好，不要用传了很多代地细胞去做，细胞地形态都会发生变化.大多数已建立地细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合地细胞地混合物.细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化.这会导致和转染相关地细胞行为地变化.如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜地细胞可能会恢复原先地转染活性.因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养地细胞以恢复最佳结果.或者，几种来源于经筛选，转染效率较高细胞亚系地细胞系现在有售.

.细胞铺板密度

用于转染地最佳细胞密度根据不同地细胞类型或应用而异.因转染试剂对细胞有毒害作用，细胞太少，容易死.一般转染时，贴壁细胞密度为，悬浮细胞密度为×细胞，确保转染时细胞没有长满或处于静止期.因为转染效率对细胞密度很敏感，所以在不同实验间保持一个基本地传代步骤很重要.铺板细胞数目地增加可以增加转染活性和细胞产量.细胞地融合度必须要达到才能做，

.启动子地选择

获得高转染活性所需选择地启动子依赖于选用地细胞系和要表达地蛋白.启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性.同其他启动子，如和（劳斯肉瘤病毒）相比，在中其活性最高.这三种病毒启动子在细胞来源地细胞系，如中组成表达水平较低.转染后在培养基中加入和可以激活细胞中启动子，而单就足以激活和（人骨髓瘤白细胞）中地启动子.启动子地表达在含有大抗原（存在于和）时会提高，因为大抗原可以刺激染色体外地合成.

量

高质量地对于进行高效地转染至关重要.转染地质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素.浓度不要低于.产物表达：小时表达最高；蛋白表达最高.

.瞬时和稳定表达及监测

转染后，转入基因地表达可以在－天内检测到.仅有一部分转入细胞地被转运到细胞核内进行转录并最终输出到细胞质进行蛋白合成.几天内，大部分外源会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了.瞬时表达分析检测未重组质粒上基因地表达.因此，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件地影响.瞬时表达分析所需地人力和时间比稳定表达少，但因为摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，实验必须很小心.为了进行稳定表达，转入地基因必须能和细胞同步复制.在转染地质粒自发整合到宿主基因组上时就会如此.在一小部分转染地细胞中，加入地通过重组整合到基因组上.包含整合地细胞很少，必须通过对药物地抗性筛选进行扩增或通过表型变化进行鉴定.稳定基因表达实验需要数周，如果需要验证蛋白产量，所需地时间更长.但得到地细胞系可以做为蛋白生产地稳定来源或用于得到转基因动物.瞬时转染和转染效率地监测，基因地瞬时表达在小时内就结束了.这种快速地瞬时表达非常适用于验证质粒表达和监测转染步骤地效率.可以使用报告基因来确定优化条件，其表达蛋白易检测，在目地细胞中不含此蛋白或水平很低.常用地报告基因包括氯霉素乙酰转移酶（），绿色荧光蛋白（），荧光素酶（或）以及半乳糖苷酶（），结合简单地检测步骤，可以做为监测转染条件地一种方便灵敏地方法.

.稳定转染细胞系地筛选

连同带有药物抗性地筛选标记基因一起转染目地基因是建立稳定转染细胞系最常用地方法.氨基糖苷磷酸转移酶基因（或）可以合成酶，通过磷酸化使药物失活，从而提供对选择性抗生素（）地抗性.抗生素抗性基因可以与目地基因在同一个质粒上，也可以在不同地质粒上.如果两个不同地质粒同时转染，两个质粒都可能整合形成稳定转化子.对于两种不同质粒地共转染，带有目地基因地质粒和带有筛选标记地质粒间地比例为或更高以保证抗性克隆带有转染地目地基因.阳离子脂质体试剂提供了一种建立稳定转染株地高效方法.瞬时转染效率地改进一般也会提高稳定转染效率.比如，使用试剂得到地细胞抗生素抗性克隆地数目比单独使用增加了大约倍（图）.要进行稳定地表达分析，

在转染后次培养细胞，低密度铺板，给予生长空间，在几天或数周内保持筛选压力.生长地细胞比不分裂地细胞更快地受到抗生素地影响.转染后，在开始筛选前等待小时，使细胞表达足够量地抗性酶，保证在开始筛选时可以自我保护.转染后小时倒掉培养基，加入含有抗生素地培养基，抗生素地浓度根据剂量反应曲线确定，足够杀死未转染细胞.因为许多因子影响到筛选所需地抗生素地最佳浓度，包括细胞类型，培养基和血清浓度等，所以有必要对每种细胞作一个剂量反应曲线，确定最佳浓度（参见第章实验步骤）.筛选最多可能需要一周时间，因为在致死剂量地抗生素存在条件下，细胞会分裂次.在次培养细胞时使用较低剂量地抗生素，一般是筛选剂量地一半.筛选后地细胞一般是离散地克隆，根据实验目地不同，可以分别纯化（克隆），收集进行大量培养或染色并进行抗性克隆地计数.

.蛋白表达和培养基地选择

哺乳动物细胞系合成可溶地，翻译后修饰地蛋白，比细菌，真菌或昆虫细胞中表达地蛋白更有可能有生物活性.稳定转染地细胞可以合成大量地重组蛋白，而瞬时转染细胞可以快速表达，迅速地合成小量蛋白.常用地细胞系包括，和.提供克隆地，，和细胞，来源于经筛选转染效率更高地亚细胞系.这些细胞也可用于无血清和限定化学成分培养基.重组蛋白地大规模生产一般在稳定转染地悬浮细胞中进行.这些细胞易于生长到高密度并合成更多蛋白.使用基质珠做为固相支持可以使贴壁细胞悬浮生长.用于蛋白生产地细胞地转染可以在添加有血清或无血清培养基中进行.但更倾向于使用无血清培养基表达蛋白，因为血清蛋白会干扰下游表达蛋白地纯化.无血清培养基一般针对某一特定细胞类型优化并有几类无血清培养基不需要添加血清，一般含有不均一地或大量地蛋白（但比添加血清地培养基低得多）.无蛋白培养基不含蛋白但可能含有不明成分地抽提物.限定化学成分地培养基不含有蛋白或未知组成地成分.多种多样地配方使您可以选择最适合您应用地一种.在含血清时转染地细胞可以适应无血清培养基，无蛋白培养基或限定化学成分地培养基.在部分情况下（如，，和），对于已适应无血清或无蛋白培养基地细胞，可以使用其培养基进行转染（图）.其他一些无血清培养基包含抑制阴离子脂质体介导转染地成分.在这些情况下，有必要在诸如或Ⅰ等培养基中进行培养和转染.

LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤

LIPOFECTAMINE 2000转染试剂转染步骤 24孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染实验步骤： （在生长培养基中直接加入复合物） 1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，将细胞转至24孔板，控制密度使其在转染日密度接近90%。细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。 2.对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。温柔混匀LIPOFECTAMINE 2000，室温温浴5分钟 （在5-25分钟内同稀释的DNA混合。保温时间过长会降低活性。可以批量制备。） 注意：即使LIPOFECTAMINE 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。 3.对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。多孔操作可以批量制备。 4.混合稀释的DNA（由第3步）和稀释的LIPOFECTAMINE 2000（由第2步）。在室温保温20分钟。注意：溶液可能会混浊，但不会影响转染。复合物可以在室温保持6小时稳定。

5.直接将复合物（100μl）加入到每孔中，前后（或左右）摇动培养板，轻轻混匀。 注意：如果在无血清条件下转染，使用含血清的正常生长培养基进行细胞铺板。在加入复合物前移去生长培养基，替换为0.2ml无血清培养基。 6.在37℃，5％的CO2中保温18-48小时，无须去掉复合物或更换培养基或者在4-5小时后更换生长培养基也不会降低转染活性。 7.在细胞中加入复合物18-72小时后，分析细胞抽提物或进行原位细胞染色，检测报告基因活性。这依赖于细胞类型和启动子活性。对稳定表达，在开始转染一天后将细胞传代至新鲜培养基中（1：10），两天后加入筛选抗生素。进行稳定表达需要数天或数周。

脂质体转染的实验原理与操作步骤大全

脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n， n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 二、脂质体转染操作步骤 1、操作步骤[方法一]： (1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。 (3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。

Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂(亲手整理)

Hieff TransTM 脂质体核酸转染试剂 产品描述 Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂是一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA 、RNA 和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。转染后不需要除去核酸-Hieff Trans TM 复合物或更换新鲜培养基，也可在4～6小时后除去。 Hieff Trans TM 以无菌的液体形式提供。通常情况下对于 24 孔板转染，每次用1.5μl 左右，则1ml Hieff Trans TM 约可做660次转染；对于6孔板，每次用6μl 左右，则1ml Hieff Trans TM 约可做160 次转染； 运输与保存方法 冰袋（wet ice ）运输。产品4oC 保存，一年有效。不可冷冻！ 注意事项 1）Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响；如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密度要求较低的转染试剂，不适合用脂质体核酸转染试剂。 2）Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA 和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。另外，要检测所用的无血清培养基与脂质体核酸转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。 3）转染的时候培养基中不能添加抗生素。 4）使用高纯度的DNA 或RNA 有助于获得较高的转染效率，质粒中的内毒素是转染的大敌。 5）阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。 6）初次使用应优化DNA 浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA 和转染试剂的比例，通常推荐是1:2-1:3，比如24孔板内接种0.5-2×105个细胞，使用0.5 μg DNA 和1-1.5 μl 转染试剂。通过调整DNA/Hieff Trans TM 脂质体核酸转染试剂比例优化转染效率，保证细胞密度大于90%，DNA （μg ）: Hieff Trans TM （μl ）比值在1：0.5-1：5。 操作流程（以24孔板为例，其他培养板加样体积请参考表一） 【注】：转染试剂使用量受细胞类型及其他实验条件影响，建议初次使用时设置梯度进行优化最佳使用量。 贴壁细胞：转染前一天（20-24小时），胰酶消化细胞并计数，细胞铺板（不含抗生素），使其在转染时密度为90-95%（0.5-2 × 105 cells/well for a 24-well plate ）。 c c l 整 理

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血

lipo2000转染操作步骤

L i p o2000瞬时转染细胞步骤 Stealth?RNAiorsiRNATransfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A将20pmolsiRNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将1ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 3转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。PlasmidDNATransfection DNA(ug):lipo2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。1中板。 贴壁细胞：0.5-2X105cells/well，第二天待细胞密度达到70-80%时转染 悬浮细胞：4-8X105cells/well，中板后随即转染。 2转染。 A将0.8ugDNA溶于50ulOpti-mem无血清培养基中。 B将2ullipo2000溶于50ulOpti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C将AB两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table1.CultureSharedreagentsDNAtransfectionRNAitransfection

siRNA 中文操作手册(lipo2000)

THE RNAi COMPANY RNAi 产品使用手册 上海吉玛制药技术有限公司 Shanghai GenePharma Co.,Ltd.

Ⅰ. RNAi 简介 1 A. RNAi 实验原理 B. RNAi 实验流程 C. RNAi 实验所需试剂 D. 上海吉玛 RNAi 相关产品 Ⅱ. siRNA设计7 A. 哺乳动物siRNA设计 B. 上海吉玛 siRNA 产品特性 C. siRNA oligo 技术数据 Ⅲ. siRNA 对照9 A. 普通阴性对照 B. 荧光标记的阴性对照 C. siRNA阳性对照 D. 转染试剂对照 E. 避免off-target对照 Ⅳ. siRNA 转染10 A.siRNA 转染的方法 B.Lipofectamin2000 转染试剂 C.Lipofectamin2000适用的细胞类型 D.转染前细胞培养 E.Lipofectamin：siRNA/DNA比例 F.贴壁细胞转染程序 G.悬浮细胞siRNA转染程序 H.DNA和siRNA共转染细胞程序 I. 体内siRNA导入方法 J. siRNA转染常见问题与建议 Ⅴ. mRNA水平RNAi效果监测15 A. siRNA细胞转染条件优化 B. Real-Time PCR RNAi 效果检测 C. Real-Time PCR 结果分析 Ⅵ. 蛋白质水平RNAi效果监测20 A. western-blot原理 B.western-blot操作步骤 w C.estern-blot上样液的制备 D.western-blot常用试剂的配制 Ⅶ. RNAi实验常见问题解答22

Ⅰ. RNAi 简介 A. RNAi实验原理 RNA干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。

lipo2000转染操作步骤(精)

Stealth? RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。

Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考 **：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。 ***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。

脂质体转染实验原理与操作步骤总(精)

脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 日期:2012-06-25 来源:互联网作者:青岚点击:3644次 摘要: 细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等, 本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。 找产品,上生物帮 >> >> 细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等, 理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等,本文主要介绍细胞转染常用的方法 -脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体 (lipofectin regeant, LR 试剂是阳离子脂质体 N-[1-2, 3-Dioleyoxy , Propyl]-n, n , n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA和 Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE的混合物 [1:1(w/w]。它适用于把 DNA 转染入悬浮或贴壁培养细胞中 ,是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高,优于磷酸钙法,比它高 5~100倍,能把 DNA 和 RNA 转染到各种细胞。 用 LR 进行转染时, 首先需优化转染条件, 应找出该批 LR 对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批 LR 都要做:第一,先要固定一个 DNA 的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间, DNA 可从1~5μg和孵育时间 6小时开始,按这两个参数绘出相应 LR 需用量的曲线,再选用 LR 和 DNA 两者最佳的剂量,确定出转染时间 (2~24小时。因 LR 对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过 24小时为宜。

细胞转染的操作步骤

细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X10⁶个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

脂质体制备方法

微脂体(又称脂质体)及其制备方法一二 微脂体(又称脂质体) 微脂体起源于1960 年代中期，Bangham博士等人首先提出，在磷酸脂薄膜上加入含盐分的水溶液后，再加以摇晃，会使脂质形成具有通透性的小球；196 8年，Sessa 和Weissmann 等人正式将此小球状的物体命名为微脂体（liposo me）并做出明确的定义: 指出微脂体是由一到数层脂质双层膜(lipid bilayer) 所组成的微小的囊泡，有自行密合（self-closing）的特性。微脂体由脂双层膜包裹水溶液形成，由于构造的特性，可同时作为厌水性（hydrophobic）及亲水性（hydrophilic）药品的载体，厌水性药品可以嵌入脂双层中，而亲水性药品则可包覆在微脂体内的水溶液层中。如同细胞膜，微脂体的脂质膜为脂双层构造，由同时具有亲水性端及厌水性端的脂质所构成，脂双层由厌水性端相对向内而亲水性端面向水溶液构成，组成中的两性物质以磷酸脂质最为常见。微脂体的形成是两性物质在水溶液中，依照热力学原理，趋向最稳定的排列方式而自动形成。微脂体的性质深受组成脂质影响，脂质在水溶液的电性，决定微脂体是中性或带有负电荷、正电荷。此外，磷酸脂碳链部分的长短，不饱和键数目，会决定微脂体的临界温度(transition temperature, Tc)，影响膜的紧密度。一般来说，碳链长度越长临界温度越高，双键数越多则临界温度越低，常见的DPPC(dipalmitoylp hosphatidylcholine)与DSPC(distearoylphosphatidylcholine)的临界温度分别是42℃与56℃，而Egg PC(egg phosphatidylcholine)与POPC(palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine)的Tc 则低于0℃。临界温度影响微脂体包裹及结合药物的紧密度，当外界温度高于Tc时，对膜有通透性的药物，较容易通过膜；此外，当外界温度处于临界温度时，微脂体脂质双层膜中的脂质，会因为流动性不一致而使微脂体表面产生裂缝，造成内部药物的释出。在磷脂质内加入胆固醇，会对微脂体性质产生下列影响：增加微脂体在血液中的安定性，较不易发生破裂；减少水溶性分子对微脂体脂膜的通透性；增加微脂体的安定性，使其在血液循环中存在的时间较长。 微脂体可依脂双层的层数或是粒子大小，加以命名或分类： (1) Multilamellar vesicle（MLV）是具有多层脂双层之微脂体，粒子大小介于100-1000 nm，特色是粒子内具多层脂质膜，一般而言，干燥后的脂质薄膜，

细胞转染操作步骤

RNAi or siRNA Transfection 以24孔板为例，其余规格的转染见表1 1 中板，细胞密度为30-50%适宜。 注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。 2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下： A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Plasmid DNA Transfection DNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3 转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。 1 中板。 贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染 悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。 2 转染。 A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。 B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。 C 将A B两管混合，放置20min。 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。将C管mix

加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。 Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection 中板密度*Culture vessel Surf. area per well Vol. of plating medium Vol. of dilution medium DNA Lipofectamine ?2000 cell/well 96-well0.3cm2100ul2X25ul0.2ug0.5ul 0.5-2X105 cell/well 24-well2cm2500ul2X50ul0.8ug 2.0ul 1-3X105 cell/well 12-well4cm21ml2X100ul 1.6ug 4.0ul 2-3X105 cell/well 6-well (35mm) 10cm22ml2X250ul 4.0ug**10ul 8-10X105 cell/dish 60mm20cm24ml2X0.5ml8.0ug***20ul 2-3X106 cell/dish 10cm60cm215ml2X1.5ml24ug60ul *：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参

Invitrogen Lipofectamine2000

Lipofectamine? 2000 前言 Lipofectamine? 2000试剂是一项专利配方，用于高效转染Stealth? RNA或者短的干扰RNA（siRNA）到哺乳动物细胞，以进行RNAi分析（1，2）。该说明书提供了一般的指导以及使用Lipofectamine? 2000转染Stealth? RNA或者siRNAj 进入哺乳动物细胞的步骤。提供推荐的起始使用试剂剂量。为了获得最佳的RNAi实验结果，需要针对哺乳动物细胞系和目的基因优化转染的条件。 影响基因阻断水平（Gene Knockdown Level）的因素 在RNAi实验中，有许多因素影响目的基因表达程度的降低（例如：基因阻断），包括： ·转染效率 ·目的基因转录效率 ·蛋白质稳定性 ·所选择特异StealthTMRNA或者siRNA序列的效率 ·所选择哺乳动物细胞系的生长特征 当设计转染和RNAi实验时，需要考虑这些因素。如果需要更多的信息帮助您成功的进行RNAi实验，查阅标题为"RNAi成功的七个步骤"的文献。随同StealthTMRNA订货可以得到说明书，也可以从我们的网站（https://www.wendangku.net/doc/408733899.html,）下载或者通过与技术服务联系获得说明书。 转染的一般性指导 使用Lipofectamine? 2000转染Stealth? RNA或者siRNA进入哺乳动物细胞时，遵从以下一般性指导： 1 为了获得最佳基因阻断结果，每一种细胞系转染Stealth? RNA或者siRNA的量都需要经过实验确定。如果您是首次转染您的细胞系，推荐尝试使用几个Lipofectamine? 2000的浓度，并在20-100nM范围内改变Stealth? RNA或者siRNA的浓度，以确定达到最佳基因阻断水平所需要的条件。高浓度的Stealth? RNA或者siRNA可能具有细胞系依赖性。注：我们推荐开始时使用40nM Stealth? RNA或者siRNA。 2 在30-50％细胞汇合度时进行转染。通常基因阻断的分析至少要在转染后24-72小时进行。低密度转染细胞可以使转染和分析之间更长的间隙更长，从而使由于细胞过度生长造成的细胞活性损害减少到最低。根据靶基因的特性，高密度转染的细胞可能更加适合条件的优化。 3 不要在转染时的培养基中加入抗生素，因为这将会降低细胞转染的效率和导致细胞死亡。 4 为了获得更好的结果，可以使用Opti-MEM? I 低血清培养基（目录号31958-062）在形成复合物前稀释Lipofectamine? 2000和Stea lth? RNA或者siRNA寡聚物。 5 可以使用invitrogen BLOCK-iT?荧光寡聚物(BLOCK-iT?Fluorescent Oligo)(目录号2013)帮助优化细胞系的转染条件。一旦确定了用来转染的最佳条件，在每一次实验都包括BLOCK-iT?荧光寡聚物，作为转染效率的指示剂。如果需要的更多的信息，请参阅BLOCK-iT?荧光寡聚物说明书，说明书可以通过我们的网站下载或者通过拨打技术服务热线。

Hieff TransTM脂质体核酸转染试剂说明书

Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂说明书 产品描述 Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂是一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA、RNA 和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，这样可以减少去除血清对细胞的损伤。转染后不需要除去核酸-Hieff Trans TM复合物或更换新鲜培养基，也可在4～6小时后除去。 Hieff Trans TM以无菌的液体形式提供。通常情况下对于 24 孔板转染，每次用1.5μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做660次转染；对于6孔板，每次用6μl左右，则1ml Hieff Trans TM约可做160 次转染； 运输与保存方法 冰袋（wet ice）运输。产品4oC保存，一年有效。不可冷冻！ 注意事项 1）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂要求细胞铺板密度较高，以90%-95%为佳，这有助于减少阳离子脂质体细胞毒性造成的影响；如果你研究的基因要求比较长的表达时间，比如细胞周期相关基因，或者细胞表面蛋白，最好选择细胞铺板密度要求较低的转染试剂，不适合用脂质体核酸转染试剂。 2）Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂可用于有血清培养基的转染，并且转染前后不需要换培养基。但是，制备转染复合物时要求用无血清培养基稀释DNA和转染试剂，因为血清会影响复合物的形成。另外，要检测所用的无血清培养基与脂质体核酸转染试剂的相容性，已知CD293, SFMII, VP-SFM 就不相容。 3）转染的时候培养基中不能添加抗生素。 4）使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率，质粒中的内毒素是转染的大敌。 5）阳离子脂质体应该在4度保存，要注意避免多次反复长时间开盖，因为可能会导致脂质体氧化而影响转染效率。 6）初次使用应优化DNA浓度和阳离子脂质体试剂量以得到最大的转染效率。DNA 和转染试剂的比例，通常推荐是1:2-1:3，比如24孔板内接种0.5-2×105个细胞，使用0.5 μg DNA 和1-1.5 μl 转染试剂。通过调整DNA/Hieff Trans TM脂质体核酸转染试剂比例优化转染效率，保证细胞密度大于90%，DNA（μg）: Hieff Trans TM（μl）比值在1：0.5-1：5。

稳定转染步骤

稳定转染细胞株的制备 带质粒的大肠杆菌的激活和扩增 （1）取-80℃冻存的带有质粒的大肠杆菌在室温解冻，或者放置37℃恒温水中约2min,待冰完全融解即可使用。 （2）LB培养基的制备按照如下配方配制 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L 酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 氯化钠(NaCl) 10g/L 用NaOH调节该培养基的pH,使其达到7.4，高温高压灭菌后室温保存，使用时加入氨苄青霉素(浓度为0.1mg/ml) （3）LB固体培养基的制备到200mlLB液体培养基加入3g琼脂混匀后高温高压灭菌，待冷却至约55℃时在无菌条件下加入氨苄青霉素摇匀，分别倒入6-7个培养皿中，用封口膜封边，并倒置放于4℃保存。 （4）扩增用接种环按照四线法将解冻后的工程菌涂布接种到LB固体培养基上，待凉干后，用封口膜将培养皿封闭，然后倒置于37℃恒温箱中培养过夜(不能摇晃)，根据情况可适当延长培养时间。观察培养基上的单克隆工程菌，待长出后，用接种环将一个单克隆工程菌转移接种到10mlLB液体培养基中，放入掁荡培养箱中37℃摇荡培养过夜，第二天观察，待LB液体培养基变浑浊后，4℃冰箱保存，以待进行下一步质粒的提取。 质粒的提取 准备质粒提取盒和扩增的带质粒大肠杆菌培养液 （1）取75ml扩增变浑浊的LB液体培养基置于试管中。 （2）5,000×g离心10分钟，弃去上清液，将试管倒置在滤纸上空干。 （3）取出质粒提取盒，用3ml细胞重悬浮液对试管中的细胞进行重悬浮。 （4）加入3ml细胞裂解液，轻轻摇晃试管混匀，室温下孵育3分钟，产生白色絮状沉淀，然后加入5ml中和液混匀 （5）将Clearing Column(兰色)放入一新的50ml离心管，将上述试管中裂解后的液体倒入兰管，孵育2分钟，1500×g离心5分钟，效果不佳的话可再离心一次，离心液待用。

脂质体转染实验原理与操作步骤总

脂质体转染的实验原理与操作步骤大全 日期：2012-06-25 来源：互联网作者：青岚点击：3644次 摘要： 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 找产品，上生物帮>> >> 细胞转染的方法主要包括：电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等，理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等，本文主要介绍细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和操作步骤等。 脂质体(lipofectin regeant，LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2，3-Dioleyoxy，Propyl]-n，n，n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1：1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时，首先需优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做：第一，先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、脂质体(liposome)转染方法原理 脂质体(liposome)转染方法原理：脂质体((Iiposome)作为体内和体外输送载体的工具，已经研究的十分广泛，用合成的阳离子脂类包裹DNA，同样可以通过融合而进人细胞。使用脂质体将DNA带人不同类型的真核细胞，与其它方法相比，有较高的效率和较好的重复性。 中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。 二、脂质体转染操作步骤 1、操作步骤[方法一]：

脂质体转染

二、脂质体转染操作步骤1、操作步骤[方法一]： (1)细胞培养：取6孔培养板(或用35mm培养皿)，向每孔中加入2mL含1~2×105个细胞培养液，37℃CO2培养至40%~60%汇合时(汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备：在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL，B液：用不含血清培养基稀释2-50μgLR，终量100μL，轻轻混合A、B液，室温中置10-15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致，应酌情减量)。 (3)转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入1mL不含血清培养液。 (4)转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中，摇匀，37℃温箱置6~24小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 (5)其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。 2、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]： (1)以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时，使其达到50~60%板底面积。 (2)在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下：①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo 质粒DNA或供体DNA。②旋转1秒钟，再加入脂质体悬液，旋转。③室温下放置5~10分钟，使DNA结合在脂质体上。 (3) (3)弃去细胞中的旧液，用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物，37℃培养3~5小时。 (4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，继续培养14~24小时， (5)吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培养24~48小时。 (6)用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。 (7) 3、稳定的脂质体转染方法如下：(1)接种细胞同前，细胞长至50%板底面积可用于转染。(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前(2)、(3)步骤。(3)在每孔中加入1mL、20%FCS 的DMEM，37℃培养48小时。(4)吸出DMEM，用G418选择培养液稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法 细菌粘附侵入实验 1、将细胞按1.0×10? cells/ml的量接种于24孔板中，每孔1ml，置于37°的培养箱中培养3天直至细胞均勾铺满孔底，长满单层的细胞显微镜下可见细胞之间接触紧密，形成该细胞所特有的紧密连接。 2、实验前一天取E.coli菌株接种于含有相应抗生素的BHI培养基中，于37°培养箱中静置培养过夜。 3、取长满单层的HBMEC细胞，用预热的WXM培养基轻柔地将细胞洗3遍，以去除培养基中的双抗。 4、然后每孔中加入400μL培养基，于37°温箱中 5、静置期间取过夜培养的细菌，3000r/min离心5min收集菌体。弃去培养基，将菌体沉淀重悬于1mlXM培养基中。并用培养基调整菌液的OD???至0.2约为1.0×10? CFU/ml。 6、分别向24孔板中每孔细胞加入100μL细菌悬液（10?CFU,MOI约为100，使总体积达到500μL。轻轻晃动24孔板使细菌均勾分散。（若为侵入实验，则将24孔板于水平离心机中,1000r/min离心5min促使细菌与细胞的接触；若为粘附实验，则该步离心省略。

贴壁细胞的脂质体转染

一、实验材料 1、宿主细胞CHO（贴壁细胞） 2、脂质体LIPOFECTAMINE 2000（invitrogen公司） 3、6孔细胞培养版 4、无血清培养基OPTI-MEM（GIBICO） 5、转染级质粒 二、实验步骤 invitrogen的LIPOFECTAMINE 2000说明书上列举了24孔、12孔、6孔……板的实验体系，因为需要转染的细胞量大，所以一直采用的是6孔版做的转染。以下是以6孔板为例说明一下我的体系和方法吧！ 1、转染前一天，以合适的细胞密度接种到6孔培养板上。（我的接种密度是 3~4*105/ml.）转染时，细胞要达到90~95%的融合。 2、溶液1：240ul 无血清培养基 + 10 ul lipofectamine 2000 per well （总体积250 ul）（温育5min） 3、溶液2：X ul 无血清培养基 + 4 ug 质粒 per well（总体积250 ul） 4、将溶液1与溶液2混合，室温下置20min。 5、与此同时，将6孔板中的细胞用无血清培养基冲洗细胞两遍后，加入2ml 无血清培养基。 6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％的CO2中保温5~6小时。 7、6小时后，更换含有血清的全培养基，在37℃，5％的CO2中48~72h检测转染水平。 8、如果做稳定转染，换全培养基培养后24h，即可以1：10或更高的稀释比例（根据细胞的生长情况）接种到新的培养基。 三、个人经验： 我觉得贴壁细胞的脂质体转染还是很容易的，有了经验之后，现在做转染得心应手，转染前后细胞的形态几乎不发生变化，几乎没有细胞死亡。转染率很高。以下是个人经验，与大家分享。 1.细胞的状态。这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。有文献说传代不要超过17代。我总是在细胞复苏后的3代左右做，那时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化了。

电转染标准步骤

电转染标准步骤 1.清洗电转杯，将电转杯置于75%酒精中浸泡2小时，然后在紫外灯下照射后即可使用。 2.电穿孔前一天，以合适密度传代细胞，使细胞在转染前出于对数生长期。对于原代培养细胞，一般培养2-3天后，细胞单层融合度可以达到70-80%，即可开始试验。 3.PBS洗细胞2次后，胰酶消化细胞2min，待细胞变圆后，用完全培养基终止消化。 4.轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min。 5.完全弃去上清，根据细胞数量，加入适量的电转缓冲液重悬细胞（一般为0.5-0.6ml左右），并上下吹打均匀。 6.加入适量相应浓度的待转染核酸至相应的终浓度（质粒为20ug/ml，SiRNA的终浓度为100nM），上下吹打均匀。若以0.5ml计算，所需质粒为0.5×20=10ug。 7.将含有相应浓度核酸的细胞悬液转移入相应规格的电转杯中，按照预定条件设置参数，进行电击操作。（不同细胞电转前，需要进行预试验摸索电转的最佳条件，既要保证较高的转染效率，又要保证较高的细胞存活率。经过实践摸索后得出，相应的最佳参数为：质粒：250V，10ms，1（最多2），0，4mm cuvette；SiRNA: 250V，5ms，1（最多2），0，4mm cuvette。 8.电击完成后，将电转杯置于恒温培养箱中8-12min，以使核酸充分进入细胞。 9.将电击杯从恒温培养箱中取出，接种细胞悬液于预热的培养基中，上下吹打均匀后，置于培养箱中正常培养。 10.正常培养4h，待细胞贴壁后，给细胞换新鲜的完全培养基，以去除上层的死细胞。 11.培养24h后，即可进行细胞转染效率的检测或是进行细胞的实验处理。