副溶血弧菌毒力基因和保守基因研究进展

副溶血弧菌毒力基因和保守基因研究进展

对副溶血弧菌的毒力基因及其保守基因的研究现状进行综述，可从分子水平对鉴定副溶血性弧菌和确定菌株的毒力提供参考。

副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus，VP）是一种嗜盐性革兰阴性菌，属于弧菌科中的弧菌属，是一种食源性致病菌，主要来源于虾、贝类等海产品。该菌可引起人腹泻、恶心、发烧等典型的胃肠炎反应及食物中毒。随着分子生物学技术的发展和VP全基因组序列测定的完成，使得人们对VP的毒力基因和保守基因序列有了更深入的了解。为了从分子水平对鉴定VP和确定菌株的毒力提供参考，对VP的毒力基因和保守基因研究现状进行综述。

1 VP的毒力基因

1.1 耐热直接溶血素基因(thermostable direct hemolysin, tdh) tdh编码TDH蛋白，TDH是VP重要的致病因子，分子量为42kDa，等电点为4-5，可表现出溶血活性、细胞毒性、心脏毒性以及致死性等生物学活性。Nishibuchi等[1]通过把tdh基因亚克隆于大肠埃希菌研究发现tdh基因位于1.3kb的HindⅢ片段上，经过对该片段的测序发现，该基因编码一条由165个氨基酸残基组成的成熟蛋白，蛋白序列前24个氨基酸是信号肽序列；又对表型变种和携带tdh基因的VP菌株的核酸序列变种之间的关系进行了审查，结果发现典型的KP阳性菌株携带有tdhl和tdh2 2个染色体基因拷贝，两者的同源性为97.2%，而呈现溶血弱阳性或阴性tdh株只携带1个染色体基因拷贝。将由核酸序列推测的氨基酸序列与tdh1缺失的溶血阳性的菌株经过Edman降解法后得到的蛋白序列比较发现tdh2对溶血现象起主要的作用。另外，从表型阴性株中还克隆到其他2个基因拷贝，这些株当中，除了染色体上有1个单拷贝tdh3外，质粒中也包含有1个基因拷贝tdh4。这2个基因都可以在大肠埃希菌中表达并产生具有溶血活性的TDH。tdh的表达受操纵子ToxRS的调节，该操纵子的过量表达可以使tdh1、tdh2、tdh3、tdh4的表达提高至原来的1.25倍、5.07倍、3.9倍、11.0倍，然而可能由于它们本身启动子基本表达水平上的不同，在VP-ToxR调控下的tdh1、tdh3、tdh4基因产生的TDH溶血素水平仍低于在没有VP-ToxRS的调控下的tdh2基因，因此ToxRS的表达对tdh2的影响更大[3]。Baba等[4]用HindⅢ消化副溶血弧菌AQ3860的染色体DNA发现1.0kb HindⅢ片段上还含有1种类似tdh的基因序列，即tdh5。tdhl与tdh2、tdh3、tdh4、tdh5相似率分别达97.2%, 96.7%, 96.7%和96.7%，因此tdh基因的保守序列可以用来作为检测VP的目的基因，但是由于它与其他可产生该毒素的非副溶血性弧菌具有很高的同源性，应用其进行PCR检测VP就存在一定的局限。

1.2 相对耐热直接溶血毒素基因(TDH related hemolysin, trh) 1987年Honda[5]发现了一种毒素具有与TDH相似的免疫原性，抗原性有部分交叉，因此命名为TDH相关溶血素-TRH。Shirai等[6]用trh探针和tdh探针检验了214株Vp临床分离的菌株，结果表明112株（5

2.3%）仅携带tdh基因、52株(24.3%)仅携带trh基因，24株（11.2%）同时携带tdh、trh基因；对环境分离株检测结果表明，大多数环境样品分离株都不携带tdh和trh基因。这些结论表明TRH是VP的另一个重要的毒力因子。TRH由trh基因编码，具有溶血作用和肠毒素作用，其分子量为48kDa，等电点为4.6，但TRH不耐热，在60℃以上10min即可灭活。编码TRH 、TDH这两种毒素的基因trh和tdh的核苷酸序列的同源性较高，trh与tdh1的同源性达68.4%，与tdh2的同源性达68.6%[7]，并且由于trh基因和tdh基因一样都不是单一基因，如以trh 作为检测VP的目的基因，易出现假阳性结果。

1.3 不耐热溶血素基因(thermolabile hemolysin, tlh) TLH是近年来研究发现的另一种溶血毒素，由tlh基因编码，tlh基因位于染色体上，长约1.3kb。Taniguchi等[8]由tlh基因的核苷酸序列研究发现前蛋白和成熟蛋白分别含有418个氨基酸和398个氨基酸，分子量分别为47.5kDa和45.3kDa。TLH是一种非典型的磷脂酶(phospholipase, PLase)，本身并没有直接溶

血活性。PLase分为PLaseA和PLaseB两种。PLaseA只能水解磷脂酰胆碱（PC）或溶血卵磷脂（LPC）中的一种，而PLaseB能水解PC和LPC。一种认为TLH可以将PC水解成LPC，然后再将LPC水解成甘油磷酰胆碱（GPC），而LPC才具有溶血活性，TLH应属于PlaseB。然而根据溶血活性，TLH又可归为plaseA或溶血磷脂酶。因此TLH在VP中的功能和致病性尚不十分清楚。由于tlh基因具有种属特异性，无论是临床分离株还是环境分离株都含有tlh基因[9]，因此对VP的检测具有很强的实用性。但是Robert pillot等[10]研究发现，副溶血弧菌与溶藻弧菌tlh 基因的同源性达60%~70%，因此仅靶定tlh基因并不能区分二者。1.4 尿素酶基因簇（Ure基因簇）Ure基因簇编码尿素酶，Ure基因簇包含有8个结构基因[11]，即UreD、A、B、C、E、F、G和UreR。UreR基因位于Ure上游5.2kb处，与其他7个基因方向相反。编码尿毒酶亚单位的UreA、UreB和UreC上游紧邻的是编码监护蛋白的UreD，下游则是编码吸收镍离子进入脱辅基酶蛋白的附属基因UreE、UreF和UreG。UreC 基因是尿素酶基因中最稳定的结构基因。尿素酶的分子量为275KDa，其等电点为5.2。组成尿素酶的3个亚单位的分子量分别为85KDa、59KDa、和33KDa。Cai Y等[12]通过对纯化的尿素酶研究发现其可以引起乳鼠肠液的积聚，表明尿素酶是细菌致病性的另一个重要的致病因子。Suthuenkul等[13]通过对临床分离株VP研究发现所有的尿素酶阳性菌都含有trh 基因，相反尿素酶阴性菌都不携带此基因。同时Iida等[7]通过基因组分析发现，Ure和trh 基因都位于小的复制子上，且两者的基因序列位于染色体DNA相邻的编码区，通过长距和精确PCR（LA-PCR）测得Ure和trh基因之间的距离小于8.5 kb。又通过PFGE对VP染色体DNA上Ure和trh之间的相对位置关系进行分析，表明Ure和trh在同一NotⅠ片段上，并且集中在染色体DNA的一小部分内，因此，Ure和trh基因在VP菌株中存在遗传学上的联系。但另有研究发现尿素酶或者尿素酶基因簇并不会抑制tdh和trh的表达。总之，尿素酶可以作为检测VP，尤其是KP阴性的一个生物学标志。

1.5 Ⅲ型分泌系统（type Ⅲsecretion system，TTSS ）基因簇细菌分泌系统的发现是近年来细菌致病机制研究的重要进展，其中的TTSS与革兰阴性病原菌毒力因子的分泌有关，在病原菌与宿主细胞接触后，这一系统得以启动，具有接触介导的特征。启动后细菌分泌与毒力有关的多种蛋白质，与相应的伴侣蛋白结合，从细菌的胞浆直接进入宿主细胞胞浆，发挥毒性作用。编码TTSS蛋白的基因通常位于细菌基因组上毒力岛和毒力质粒上，并成簇存在，约有20~30个，在不同的细菌上表现出种属特异性。Makino等[14]通过用全基因组鸟枪法对副溶血弧菌临床株RIMD2210633的测序研究中首次发现TTSS由位于染色体1和2上的TTSS1及TTSS2两个基因簇构成，分别与细菌对机体的细胞毒性和肠毒性有关，其中TTSS2基因簇位于致病岛上tdh的两个拷贝之间，且只在KP阳性的致病菌株中存在，而环境菌株中不存在。另外研究发现TTSS的致病机理是通过接触依赖性转运将底物蛋白转运到真核细胞内。

2. VP的保守基因

由于毒力基因只能鉴定致病性的VP,确定VP的毒力，用于鉴定VP则会出现假阴性结果。而细菌的保守基因具种特异性，可以用于细菌种的鉴定，选择合适的保守基因对快速筛选VP具有重要的意义。

2.1 gyrB基因gyrB基因存在于多数的细菌中，但不同种属的细菌则存在一个或多个位点的变异。Venkateswaran等[15]以VP的编码DNA促旋酶B亚单位的gyrB为靶基因设计寡核苷酸引物，扩增长度为285bp，特异性试验证明该引物对全部117株VP都存在285bp的特异性扩增片段，而90株其他弧菌和60株非弧菌都没有特异性扩增。因此，gyrB基因具有VP种特异性，而且该基因为单拷贝基因，具有设计PCR引物的保守区域。

2.2 pR72H基因pR72H基因的DNA序列是由一个非编码区和磷脂酰丝氨酸合

成酶基因组成，并且具有VP的高度保守序列。Lee[16]等克隆了93号VP染色体的0.76-Kb

的HindⅢDNA片段，此DNA片段被认为pR72H片段，尽管此片段的功能仍不是很清楚，但实验结果显示pR72H基因几乎存在于所有的VP中，可以用于VP的种特异性检测。随后又对pR72H基因进行了测序，并基于此序列设计引物VP33和VP32，对124株VP及50株非VP菌株进行了PCR检测，结果显示特异性可达100%[17]。

2.3 ORF8基因1996年在东南亚等一些地方发现了引起的腹泻的O3:K6血清

型的VP菌株[18]，尽管细菌的很多血清型都能引起感染，但研究认为O3:K6血清型是这些地区引起疾病的主要菌型。为了在分子水平表明导致其致病的原因，Nasu[19]等研究发现含有开放式阅读框ORF8的丝状噬菌体与VP-O3:K6有关。而Iida[20]等研究表明丝状噬菌体不仅与O3:K6血清型有关，而且还与最新出现的血清型VP有关，对55株菌株进行脉冲场凝胶电泳显示与O3:K6菌株密切相关的菌株96%以上是ORF8基因的阳性菌株。另外研究还表明对O3:K6血清型VP菌株的鉴定，ORF8基因是一个有用的遗传标记。尽管ORF8基因的功能需要进一步的研究，但结果显示其为VP的一个新的致病因素。

2.4 toxR基因toxR基因编码跨膜转录激活蛋白，在弧菌属中普遍存在，最先是在霍乱弧菌中发现，由它编码的跨膜转录调控蛋白TOXR参与调控霍乱弧菌的一些主要毒力基因和外膜蛋白的表达。随后toxR基因在VP等其他弧菌中发现。因此toxR基因在弧菌属中普遍存在，其可变区可作为检测弧菌不同种的靶位点，toxR基因中存在一个膜栓系区(membrane tether region)，该区的序列在弧菌各种之间呈现出巨大的差异性，是弧菌菌种鉴定的良好分子靶位点。Lin等[21]的研究发现，在副溶血弧菌中存在toxRS（toxR和toxS）基因，并与霍乱弧菌中toxR和toxS的序列相似性分别为52%和62%。并且在临床与环境中的副溶血弧菌都检测发现存在toxRS基因。在toxS存在的情况下，toxR能促进tdh2基因的表达。在tdh2上游144bp的DNA序列对tdh2基因的表达促进作用具有重要作用。在Lin的研究中，以AQ3815（KP阳性菌株）为研究对象，通过诱导toxR缺失突变株，发现toxR对tdh基因的促进表达作用随培养条件的不同而程度不同，用KP肉汤(2%peptone,0.5%NaCI,0.03M KH2PO4,PH6.2)促进作用最强，且对tdh基因的表达促进作用是在转录水平，而toxR对于AQ3815对兔的肠毒素作用是必须的。Kim等[22]建立了一种检测VP-toxR基因的PCR方法，可在种的水平上检测VP；Croci等[23]也证实该基因能特异检测VP。

3. 结语

到目前为止，VP的毒力基因和保守基因的研究已深入到分子领域，并且取得了一些成果，尤其在对溶血素基因的研究方面。然而其他一些毒力基因和保守基因的研究仍然不是很清楚，如pR72H基因和ORF8基因，尚有待于做进一步的研究。另外选择以毒力基因或保守基因作为鉴定VP的靶基因时，应该清楚的认识到检测存在的局限性。目前有多篇文献报道仅以毒力基因的存在与否来确定VP的检出与否，势必会造成假阴性结果。本文通过对VP 的毒力基因、保守基因的研究进展进行综述，为便于从分子水平对VP进行鉴定和确定毒力提供参考。

副溶血性弧菌标准的检验方法

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。 第一节副溶血性弧菌标准的检验方法 一、检验方法 （一）操作步骤 1. 分离培养：首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。 2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。 3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。 4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。 5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h 培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。 （二）检验程序 图6-1副溶血性弧菌检验程序 二、结果分析判定及注意事项 （一）样品处理 采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。 对采取的样品有时因受存放条件的影响（如低温冷冻或干燥时间过长等原因），使菌体处于受伤状态，故需对此类可疑食品或可疑中毒材料进行增菌培养，但应注意为有利于细菌恢复，不宜选用抑制性较强的培养基，否则影响细菌生长。 样品经增菌8~16h后，转种平板进行分离，挑选可疑菌落，接种于含有3.5％盐的三糖铁培养基，此时挑选数目不应少于5个，尤其夏季海产食品混放，相互污染严重，时有不同型别的大量细菌存在，以防漏检。 （二）形态与染色

副溶血弧菌与溶藻弧菌毒力基因分布与抗生素耐药性分析

目录 摘要.......................................................................................................................................... I ABSTRACT .......................................................................................................................... I II 目录........................................................................................................................................ V 第一章前言 (1) 1.1弧菌 (1) 1.2副溶血弧菌和溶藻弧菌 (2) 1.3 副溶血弧菌和溶藻弧菌的致病因子 (5) 1.4弧菌的耐药性 (8) 1.5弧菌的分型方法 (9) 1.6本论文立题依据及研究内容 (13) 第二章副溶血弧菌与溶藻弧菌毒力基因的分布调查 (14) 2.1实验材料 (14) 2.2实验方法 (16) 2.3实验结果与讨论 (18) 2.4本章小结 (25) 第三章副溶血弧菌O3、O4 型菌株的PFGE分型 (26) 3.1实验材料 (26) 3.2实验方法 (28) 3.3实验结果与讨论 (32) 3.4本章小结 (36) 第四章副溶血弧菌与溶藻弧菌的耐药性研究 (37) 4.1实验材料 (37) 4.2实验方法 (38) 4.3实验结果与讨论 (39) 4.4本章小结 (42)

副溶血性弧菌2

副溶血性弧菌 副溶血性弧菌是什么？ 副溶血性弧菌是我国沿海地区最为常见的食源性病原菌，广泛存在于近岸海水、海底沉积物和鱼贝类等海产品中，主要引起食物中毒。 危害是什么？ 副溶血性弧菌感染最常见的症状是急性胃肠炎，一般恢复较快，少数病人可发展至脱水、休克。 在我国的流行状况 副溶血性弧菌感染常见于沿海地区，随着国民经济的发展，交通运输便利，目前我国内陆省份各大城市也较常见，发病高峰期是夏秋季，主要集中在7－9月。 最常见的污染食品是什么？ 副溶血性弧菌感染引起的食物中毒主要的污染食品是海产品，包括鱼类、软体动物(如生蚝、墨鱼、八爪鱼)和贝壳类动物(如龙虾、虾、蟹)；除了海产品外，其他食物(如烧肉、卤肉和凉拌菜)也可引起副溶血性弧菌感染，这主要是因为交叉污染所致。我国不少地区还发现淡水鱼携带副溶血性弧菌。 最常见发生的地点是哪里？ 副溶血性弧菌引起的食物中毒常发生在沿海地区，特别是旅游景点，高发于接待旅行团团餐的大排档。 典型症状是什么？ 副溶血性弧菌感染平均潜伏期为15小时，最短1小时，最长4天。国内报告9～20小时者占81％，10小时内者占70％。副溶血性弧菌感染的典型症状是急性胃肠炎，如呕吐、腹痛、腹泻等。剧烈腹痛、脐部阵发性绞痛为主要特点，腹泻多呈水样便。病程常为2－3天，恢复较快，少数病人发展至脱水、休克。 是否有易感人群？ 人群普遍易感，男女老幼均可患病，但副溶血性弧菌引起的暴发多以青壮年为主。经常暴露于少量细菌者，感染后临床症状一般较轻，如渔民大多有生食或半生食某些海产品的习惯，暴露机会甚多，但发生食物中毒者并不多，即使发病，症状也较轻。但内陆人员到沿海地区时，饮食稍有不慎，屡见发生病情较重的食物中毒。 1 / 2

副溶血弧菌及其检测方法

副溶血弧菌及其检测方法 1.副溶血弧菌 副溶血性弧菌(又称嗜盐菌Vibrio Parahaemolyticus)是革兰氏阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌。本菌嗜盐畏酸，在无盐培养基上，不能生长，3%～6%食盐水繁殖迅速，每8～9分钟为1周期，低于0.5%或高于8%盐水中停止生长。在食醋中1～3分钟即死亡，加热56℃5～10分钟灭活，在1%盐酸中5分钟死亡。 副溶血性弧菌食物中毒也称嗜盐菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品或盐腌渍品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，其次为蛋品、肉类或蔬菜。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。主要病理变化为空肠及回肠有轻度糜烂，胃粘膜炎、内脏(肝、脾、肺)淤血等。 已知副溶血弧菌有13种O抗原及65种K抗原，据其发酵糖类的情况可分为5个类型。各种弧菌对人和动物均有较强的毒力，其致病物质主要有分子量42000的致热性溶血素(TDH)和分子量48000的TDH类似溶血毒(TRH)，具有溶血活性、肠毒素和致死作用。 2.副溶血弧菌的检测方法 （1）溶血性试验 我妻氏用高盐血琼脂培养基，在限定的条件下培养副溶血性弧菌时出现的溶血反应，称此溶血性能为“神奈川现象”。 此试验要求是用人或兔的新鲜红血球制备高盐血平板，经37℃、24h培养，如在单个菌落周围呈现透明溶血环或在菌落下面有明显溶血者，为“神奈川现象”阳性，若不出现透明溶血环或无明显溶血者，为“神奈川现象”阴性。 有致病性的副溶血性弧菌，多数为神奈川现象阳性，但亦有少数为阴性。 （2）血清学试验 副溶血性弧菌有三种抗原，即O抗原（菌体抗原），Ｋ抗原（荚膜抗原）及Ｈ抗原（鞭毛抗原），其中血清学分类上有意义的是前两者：O抗原有13种血清群，K抗原有65种血清型。 进行副溶血性弧菌血清学鉴定时，可用O抗原分群，将18-24h的培养物，用3％食盐水作成较浓的菌悬液，121℃高压1h或100℃煮沸后，用此菌悬液进行O抗血清玻片凝集

附录5 食品安全事故常见致病因子的临床表现

附录5 食品安全事故常见致病因子的临床表现、潜伏期及生物标本采集要求 一般为10~20 分钟 由腌制不当或变质蔬 菜引起的中毒一般为 1~3 小时，最长可达20 小时口唇、耳廓、舌及指(趾)甲、皮肤黏膜等出现不同程度发绀， 可伴有头晕、头痛、乏力、恶心、呕吐；中毒明显者可出现 心悸、胸闷、呼吸困难、视物模糊等症状；严重者可出现嗜 睡、血压下降、心律失常，甚至休克、昏迷、抽搐、呼吸衰 竭 亚硝酸盐 血液 必须立即采样，若现场不能检验，可带回实验室测定， 采样量约10ml，抗凝剂以肝素为佳，禁用草酸盐，应 冷藏保存，如长时间运输，可冷冻 呕吐物 胃内容物 采样量50g~100g，使用具塞玻璃瓶或聚乙烯瓶密闭盛 放应冷藏保存，保存和运输条件同上 尿液 采样量300ml~500ml，使用具塞玻璃瓶或聚乙烯瓶盛 放，保存和运输条件同上 1~6 小时 （平均2~4 小时）恶心，剧烈地反复呕吐，腹痛，腹泻 金黄色葡萄 球菌及其肠 毒素 粪便或肛拭子 新鲜粪5g，置于无菌、干燥、防漏的容器内。或采样 拭子沾满粪便插入Cary—Blair运送培养基1，冷藏运 送至实验室 呕吐物 采取呕吐物置无菌采样瓶或采样袋密封送检, 冷藏运 送至实验室 皮肤病变拭子 鼻拭子 采样拭子插入Cary—Blair运送培养基1内保存，冷藏 运送至实验室 0.5~5小时以恶心、呕吐为主，并有头晕、四肢无力蜡样芽孢杆 菌（呕吐型） 粪便或肛拭子 新鲜粪便5g，置于无菌、干燥、防漏的容器内。或用 采样拭子沾满粪便插入Cary—Blair运送培养基1内 保存，冷藏运送至实验室 4~24小时恶心、呕吐、轻微腹泻、头晕、全身无力，严重者出现黄疸、 肝肿大、皮下出血、血尿、少尿、意识不清、烦躁不安、惊 厥、抽搐、休克；一般无发热 椰毒假单胞 菌酵米面亚 种（米酵菌 粪便或肛拭子 新鲜粪便5g，置于无菌、干燥、防漏的容器内。或用 采样拭子沾满粪便插入Cary—Blair运送培养基1内 保存，冷藏运送至实验室

副溶血性弧菌血清型致病力及分子分型研究

副溶血性弧菌血清型致病力及分子分型研究 [摘要] 目的了解四川地区2009年副溶血弧菌食物中毒疫情分离株和监测食品样品分离菌株菌型分布、致病力及分子分型特征，为四川地区副溶血性弧菌疾病防治提供科学依据。方法采用血清玻片凝集试验对2009年从食物中毒疫情和常规监测食品中分离的副溶血孤菌菌株进行血清分型、应用PCR方法进行耐热直接溶血素基因(tdh)和耐热直接溶血素相关基因(trh)的检测、小鼠腹腔注射进行致病力实验和进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析等。结果40株菌分属于5个血清群，疫情分离株分属于O3和O4群，监测分离株主要为O1群占43.75%（7/16），其中2起疫情分离到多个血清型的菌株；所有菌株trh基因均为阴性，其中20株携带tdh毒力基因，携带tdh毒力基因和不携带tdh、tlh毒力基因的菌株均有致病力。40株菌通过PFGE分型，共得到29个带型，同一疫情分离株具有多个PFGE型别。. 结论四川省食品分离株和暴发疫情无太多联系，食品分离株血清型和PFGE型别呈多样性。对于从同一起暴发疫情中检出的不同血清型和不同PFGE型别的副溶血性弧菌需要确认各菌株与暴发的关系。 副溶血性弧菌作为一种常见食源性致病菌，其引起的食物中毒事件在全世界均有报道，但主要集中在东南亚各国和美国，而欧洲少有报道［1］。主要是由于这些国家和地区临海，海产品摄入量多，导致副溶血性弧菌感染高发。据报道,自1998年以来,我国微生物性食物中毒的病原分布发生了显著的变化，副溶血性弧菌引起的食物中毒已高居微生物性食物中毒的首位，主要发生在中国沿海区域。然而，随着人民群众生活水平的不断提高，食品流动频繁，内陆地区也经常见副溶血性弧菌引起的食物中毒疫情报道［2、3］。四川省近年来也陆续发生副溶血性弧菌引起的食物中毒疫情，本研究对四川省2009年发生的3起由副溶血性弧菌引起疫情的23株分离株和从省内各超市、农贸市场水产品样本中分离的17株副溶血性弧菌进行了血清学分型实验、毒力基因检测、脉冲场凝胶电泳分子分型，挑取部分临床来源和食品来源的菌株进行致病力实验、以了解四川地区副溶血性弧菌特征，为预防和控制由副溶血性弧菌引起的食源性疾病提供科学依据。 1 材料与方法 1.1菌株来源23株食物中毒副溶血弧菌由四川省攀枝花市疾病预防控制中心及四川省达州市疾病预防控制中心于2009年5—11月从3起食物中毒中分离获得；17株食品样本中副溶血弧菌从全省各地市售的水产食品中分离获得(表1)。 1.2 菌株血清分型副溶血弧菌11种0分型血清、9种K多价及65种K单价分型血清为日本Denka Seiken公司。 1.3 细菌基因组DNA的提取挑取菌株过夜培养物于100ul重蒸水中，100℃水浴10min，10000转离心10min，取上清夜作为DNA模板。 1.4．tdh和trh的检测tdh、trh引物参考文献[4]。tdh上游引物：5 一CCA CTA CCA CTC TCATAT GC一3 ；下游引物：5 GGT ACT AAA TGGCTG ACA TC 3 。trh 上游引物：5 一GGC TCAAAA TGG TTA AGC G一3 ；下游引物：5 一CAT TTCCGC TCT CAT ATG C．3 ，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应条件为：94℃5 rain；94℃30 S，58℃30 S，72℃60 s，35个循环；72℃4 rain。tdh、trh扩增产物预期长度分别为251 bp、250 bp。 1.5、致病力实验：将副溶血弧菌接种到普通营养肉汤，培养18—24 h，每株菌液接种4只健康小白鼠，雌雄各2只，每只小自鼠腹腔注射0.3 ml，对照组接种无菌3%NaCl碱胨水，72h内观察小鼠死亡情况，试验小鼠体重为18-22g。小鼠死亡后，解剖小鼠，取其脾脏横切面涂抹TCBS平板接种培养。 1.6 PFGE分子分型实验取新鲜琼脂培养物集菌均匀悬浊于1ml细胞悬液(100mM

副溶血性弧菌实验活动风险评估报告

副溶血性弧菌实验活动风险评估报告 一、生物学特性 （一）种类和细菌分型 副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种嗜盐性细菌，属于弧菌属，为革兰阴性菌，主要的栖息地在海水中。 副溶血性弧菌有鞭毛（H）、荚膜多糖（K）和菌体（O）抗原，鞭毛（H）抗原为所有菌株共有，无助于分型。目前，已知至少有13种O抗原、65中K抗原，根据O抗原、K 抗原可以进行血清学分型。 （二）来源 1950年，日本大阪因食用遭肠炎弧菌污染的青鱼干而发生了一起集体食物中毒事件，造成272人中毒，其中20人死亡。1960年，日本东京及千叶县一带发生了多起因食用竹荚鱼而导致食物中毒的事件，检验后发现病原菌是肠炎弧菌，引起医学界的关注。对此，厚生省（今为厚生劳动省，是日本中央政府的卫生主管单位）将肠炎弧菌列为引起食物中毒的重要病原菌之一，并进行相关研究。1963年，日本国立预防卫生研究所（今为日本国立传染病的研究所）的福见秀雄和坂崎利一证明了此种细菌应属于弧菌属，将学名改定为Vibrio。 （三)传染性 传染源为病人，本病可长年发病，多在夏秋季6~10月，发生于沿海地区、海产品大量上市时，常造成集体发病，临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。集体发病时往往仅少数病情重者住院，而多数未住院者可能成为传染源，但由于病人仅在疾病初期排菌较多，其后排菌迅速减少，因此，不存在病人散步病菌而造成广泛流行的说法。另外，有肠道病史的居民或渔民带菌率偏高，也是传染源之一。 （四）传播途径 副溶血性弧菌分布极广，主要在海水和水产品中，我国华东地区沿岸的海水的副溶血性弧菌检出率为47.5%~66.5%，海产鱼虾的平均带菌率为45.6%~48.7%，夏季的指标可高达90%以上。 副溶血性弧菌食物中毒，是由进食含有该菌的食物所致。含有该菌的食物主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇。其次，为咸菜、熟肉类、禽肉、禽蛋类。中毒原因主要是烹调时未烧熟煮透或熟制品污染。若食品制作时，熟食被接触过生海产品的刀、砧板容器等污染，熟食保管不善，则一旦受到副溶血性弧菌污染，其增代时间仅10min，故易于大量繁殖，足以达到致病菌量。 （五）易感性 男女老幼均可患病，但以青壮年为多，病后免疫力不强，可重复感染。 （六）潜伏期 潜伏期5~72h，多数为10h左右，平均24h。进食被副溶血性弧菌污染的食物后10h 左右，会出现上腹部阵发性绞痛、腹泻。多数患者在腹泻后出现恶心、呕吐、腹泻多为水样便，重者为粘液便和黏血便。呕吐、腹泻重，失水过多者可出现虚脱并伴有血压下降。本病病程为1~6d不等，大部分病人发病后2~3d恢复正常，一般恢复较快，少数重病人由于休克、昏迷而死亡。

浅谈副溶血性弧菌

浅谈副溶血性弧菌 摘要：副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌，又称为嗜盐性细菌。该菌广泛存在于海水、海底沉积物以及鱼贝虾蟹等海产品中，其特点是必须在有盐份的环境中才能生长。由该菌引起的食物中毒案例在世界各地均有报道，受害最严重的国家和地区主要包括日本、韩国、香港、台湾和中国大陆。污染了大量副溶血性弧菌而又未经良好加工处理的海产品被人类食用后会引起急性胃肠炎或食物中毒。本文综述了副溶血性弧菌的生理学特性，来源，中毒特点，检测，预防措施等概况 关键词：副溶血性弧菌；食品中毒；食品安全 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性致病菌，又称为嗜盐性细菌。副溶血性弧菌广泛存在于海水、海底沉积物以及鱼贝虾蟹等海产品中，其特点是必须在有盐份的环境中才能生长。故其在含盐量高的培养基上(2%-5%)生长良好，但在无盐的培养基上则不能生长，因此被称为嗜盐性弧菌。由该菌引起的食物中毒案例在世界各地均有报道，受害最严重的国家和地区主要包括日本、韩国、香港、台湾和中国大陆。污染了大量该菌而又未经良好加工处理的海产品被人类食用后会引起急性胃肠炎或食物中毒。2010年爆发的对虾“偷死病”就是由副溶血性弧菌引起。 一、生物学特性 副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性，多形态弧状杆菌。其菌体呈弧状、杆状、或丝状，无芽孢且无荚膜。大多数菌体在液体培养基中有单端鞭毛、能运动。此菌具有细胞色素氧化酶，不分解蔗糖，但能在不产气及不产生硫化氢的情况下分解葡萄糖而产酸等生化特性。副溶血性弧菌为一嗜盐性细菌，必须在含盐0.5%-8%的环境中方可生长，尤以含盐量在2%-4%的情况下最佳。故其在无盐的培养基上不能生长，在含盐浓度过高(10%以上) 的培养基上也无法生长。副溶血性弧菌能够在温度为5-44℃范围内生长，但以30-35℃为最佳，当温度低于40℃时则停止生长，适宜生长的pH 为7.5-8.5，以pH7.7为最佳，在pH 低于6 的

副溶血性弧菌

本标准规定了食品中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的检验方法。 本标准适用于食品中副溶血性弧菌的检验。 2设备和材料设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 2.2冰箱：2 ℃～5 ℃、7 ℃～10 ℃。 2.3恒温水浴箱：36 ℃±1 ℃。 2.4均质器或无菌乳钵。 2.5天平：感量0.1 g。 2.6无菌试管：18 mm×180 mm、15 mm×100 mm。 2.7无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。 2.8无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL、1000 mL。 2.9无菌培养皿：直径90 mm。 2.10全自动微生物生化鉴定系统。 2.11无菌手术剪、镊子。 3培养基和试剂 3.13％氯化钠碱性蛋白胨水：见附录A中A.1。 3.2硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂：见附录A中A.2。 3.33％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂：见附录A中A.3。 3.43％氯化钠三糖铁琼脂：见附录A中A.4。 3.5嗜盐性试验培养基：见附录A中A.5。 3.63％氯化钠甘露醇试验培养基：见附录A中A.6。 3.73％氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.7。 3.83％氯化钠MR-VP培养基：见附录A中A.8。 3.93％氯化钠溶液：见附录A中A.9。 3.10我妻氏血琼脂：见附录A中A.10。 3.11氧化酶试剂：见附录A中A.11。 3.12革兰氏染色液：见附录A中A.12。 3.13ONPG试剂：见附录A中A.13。 3.14Voges-Proskauer（V-P）试剂：见附录A中A.14。 3.15弧菌显色培养基。 3.16生化鉴定试剂盒。 4检验程序 副溶血性弧菌检验程序见图1。

食物中的副溶血性弧菌

摘要 副溶血性弧菌是一种分布极为广泛的细菌，它往往通过污染食物感染人类，是常见的易引致人群腹泻的致病因子。副溶血性弧菌包含哪些类别？副溶血性弧菌感染对人体会有什么危害？人体对副溶血性弧菌的感染途径包括哪些？如何减轻副溶血性弧菌可能带来的风险？本文参考国内外相关研究，结合文献资料，汇总食物中的副溶血性弧菌相关内容，整理有关观点，提出对策建议。 副溶血性弧菌 1.认识副溶血性弧菌 2.副溶血性弧菌感染表现 3.副溶血性弧菌感染途径 4.相关标准 5.减轻风险的手段 6.参考文献. 《食品安全热点》关注国内外食品安全事件及食品 安全相关状况，及时归纳整理有关资讯，作出风险分析 与评估，提供客观和专业的观点，供关注者参考。 二○一三年第10期总第10期食物中的副溶血性弧菌

1.认识副溶血性弧菌副溶血性弧菌属弧菌科弧菌属，其嗜盐畏酸对热敏感且 不耐低温，在无盐培养基上不能生长，在1%－2%醋酸或 50%食醋中1分钟即死亡，在56℃条件下5分钟或90℃条 件下1分钟即可灭活；对常用化学消毒剂（如酒精、0.05% 苯酚、0.1%甲酚皂等）抵抗力很弱，1分钟可被杀灭。对高 浓度氯化钠抵抗力甚强；在自来水、井水、河水和池塘水中 可存活1天，在海水中可存活47天以上。 副溶血性弧菌分布极为广泛，其自然生存环境为近海岸 和海湾，常见于鱼类及贝类海产丰富的河口和近岸水域。有 研究发现，广州珠江河口地区水体中副溶血性弧菌检出率为 27.27%，海水、河涌水、养殖水检出率分别约30.00%、 28.61%、13.69%，6－8月水体中副溶血性弧菌检出率较高， 可达到52.16%。副溶血性弧菌主要富集于滤食性的软体贝 类，如牡蛎（生蚝）、蛤蚌和贻贝等，生食或未煮熟的海鲜 往往是副溶血弧菌感染人类的食物载体。 每年5月－11月是副溶血性弧菌感染的多发季节，高峰 集中在7月－9月。副溶血性弧菌感染发病呈世界性分布， 沿海地区发病率较高，日本和我国病例分布最广、发病率最 高。随着交通运输条件的改善和生活水平的提高，海鲜消费 由沿海延伸至内陆，近几年我国内陆地区副溶血性弧菌发病 率逐年升高，其已成为引发夏秋季感染性腹泻的常见、重要 病原菌。 2.副溶血性弧菌感染表现副溶血性弧菌感染潜伏期为4－30小时，通常是12－ 24小时；潜伏期长短与所摄入的细菌量密切相关，也与机 体免疫力、细菌毒力以及年龄等因素有关。 副溶血性弧菌感染发病多急骤，最先出现和最常见的症 状为腹痛和腹泻，其次为恶心、呕吐、畏寒和发热。腹痛多 表现为剧烈上腹绞痛，一般呈阵发性，位于上腹部和脐周， 部分伴压痛。腹泻每日3－20余次不等，大便性状多样，多 数为黄色水样或糊状，2%－16%的患者可出现血水样或粘液 血样便，若与痢疾杆菌混合感染者可出现里急后重。吐泻严 重患者常有失水现象。

副溶血性弧菌分离

副溶血性弧菌分离 准备材料 1. 3％氯化钠碱性蛋白陈水〔APW) （成分:蛋白胨10g，氯化钠30g，蒸馏水1000ml，PH 8.5士0.2） 2. 硫代硫酸盐柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂。 3. 3％氯化钠胰蛋白胨大豆〔TSA）琼脂（成分:胰蛋白胨15.0g，大豆蛋白胨5.0g，氯化钠30.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml，制法：将上述成分混合，加热并轻轻搅拌至溶解，121摄氏度高压灭菌15min，调节PH至7.3士0.2。） 4. 弧菌显色培养基 操作步骤 1.样品制备 1.1冷冻样品应在45 ℃以下不超过15 min或在2—5摄氏度不超过18小时解冻，若不能及时检验应放于--15摄氏度左右保存；非冷冻而易腐蚀的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置2-5摄氏度冰箱保存，在24h内检验。 1.2 鱼类和头足类动物取表面组织、肠或鳃。贝类取全部内容物，包括贝肉和体液；甲壳类取整个动物，或者动物的中心部分，包括肠和鳃，如为带壳贝类或甲壳类则应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按仁上述要求取相应部分。 1.3 以无菌操作取检样25g（ml），加人3 ％氯化钠碱性蛋白栋水225 ml ，用旋转刀片式均质器以8000r/min创min 均质1min，或拍击式均质器拍击2 min ，制备成1：10的均匀稀释液。如无均质器，则将样品放人无菌乳钵中磨碎，然后放在500 mL 的灭菌容器内，加225ml 3% 氯化钠碱性蛋白胨水，并充分振荡。 2 增菌 2.1 定性检测 将上述1:10稀释液于36 ℃士1 ℃培养8h ～18h 2.2 定量检测 2.2.1 用灭菌吸管吸取1:10稀释液1 mL ，注入含右9mL 3 ％氯化钠碱性蛋白胨水的试管内，振摇试管混匀，制备1：100 的稀释液 2.2.2 另取1mL 灭菌吸管，按上述操作依次制备10倍递增稀释液每递增稀释一次，换用一支lml 灭菌吸管. 2.2.3 根据对检样污染情况的估计,选择三个连续的适宜稀释度，每个稀释度接种三支含有9ml 3 ％氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1mL 。置36℃士1℃恒温箱内，培养8h--18h 3 分离 3.1 在所有显示生长的试管或增菌液中用接种环沾取一环，于TCBS 平板或弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板，于36 ℃士1 ℃培养18h--24h 5.3.2 典型的副溶血性弧菌在TCBSL呈圆形、半透明、表而光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2mm--3 mm 。从培养箱取出TCBS 平板后，应尽决（不超过1h）挑取菌落或标记要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在弧菌显色培养基上呈圆形、半透明、表面光滑的粉紫色菌落，直径2mm--3 mm. 4 纯培养 挑取三个或以上可疑菌落，划线 3 ％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36 ℃土l ℃培养18h--24h.

副溶血性弧菌PFGE操作方法

副溶PFGE程序

2．纯水脱色4-5小时。3．凝胶成像系统拍照。

试剂储存液的配制 1、1M Tris-HCl，pH8.0 121.1g Tris base溶于650-700ml的纯水中，加入80ml 6N HCl，在室温下调pH至8.0，加水终体积至1000ml，高压灭菌。 或者157.6g Tris-HCl溶于800ml纯水中，在室温下调pH至8.0，加水终体积至1000ml，高压灭菌。 2、10N NaOH 400g NaOH小心溶于800ml纯水中，冷却至室温，加灭菌的纯水使终体积至1000ml。 3、0.5M EDTA，pH8.0 186.1g Na2EDTA-2HO2溶于800ml纯水中，加入50ml 10N NaOH调pH至8.0，加水终体积至1000ml，分成数份，高压灭菌。 4、20% Sodium Dodecyl Sulfate（SD S）－十二烷基磺酸钠：用于E.coli O157:H7，Salmonella和Shigella sonnei，PFGE 将20克SDS小心加入装有80ml灭菌纯水的容器中，在35-45℃轻轻混匀溶解，定容至100ml。 5、10%Sarcosyl－十二烷基肌氨酸钠 10g Sarcosyl溶于80ml的纯水中，水浴40-50℃助溶，定容至100ml，不用高压。 6、20mg/ml蛋白酶K储存液 100mg Proteinase K粉末溶于5ml灭菌纯水中，混匀，分装在1.5ml离心管中，每管500-600 ul，-20℃保存备用。 7、10×Tris-Borate EDTA Buffer（TBE），pH8.3 0.9M Tris base（108g） 0.9M Boric Acid（55g） 0.02M EDTA，pH8.0（40ml，0.5M） 溶于1000ml灭菌的纯水中，高压灭菌 或者5×TBE： 0.9M Tris base（54g） 0.9M Boric Acid（27.5g） 0.02M EDTA，pH8.0（20ml，0.5M） 溶于1000ml灭菌的纯水中，高压灭菌

副溶血弧菌

副溶血弧菌 形态染色 1、为革兰氏阴性无芽胞杆菌，易呈多形态，有棒状、弧状、卵圆状、球状、丝状等，排列不规则，多数散在，偶而有成对排列 2、一般大小为0.3~0.7ｕm×1~2ｕm，单端一根鞭毛，有动力，运动活泼，两端浓染，在固体培养条件下能生长周鞭毛。 3、和其他弧菌的异同： （同）副溶血性性弧菌和霍乱弧菌、创伤弧菌等细菌，都是弧菌科弧菌属的成员。 （异）副溶血性性弧菌的长度约是0.3×2μm，其细菌本体不像典型弧菌的弯曲状，反而是笔直的棒状（类似杆菌）。 培养特性 1、在无盐的条件下不生长，在含2％~3％氯化钠的培养基中生长最旺盛，氯化钠溶液浓度到达10％以上时不繁殖。 2、需氧性强，常在液体表面形成菌膜 3、液体培养条件下菌体多生长为单鞭毛，运行活泼。 4、在固体培养基上，菌落常为隆起，圆形，稍混浊不透明，表面光滑，湿润，不产生色素。 5、嗜盐：VP 在含氯化钠5 –(20-30－最适) g／L的培养基上 生长，无盐和110g ／L以上不生长。

6、生长温度和PH：最适为37℃，4 ℃不生长,最适pH为7.4-8.0 7、需氧性:需氧性很强，厌氧条件下生长缓慢 8、肉汤液体培养基中养基:多数菌株呈现混浊，表面形成菌膜，R 型菌发生沉淀； 培养基形状 固体SS琼脂上菌落光滑湿润，无色透明，具有辛辣刺鼻的特殊气味，菌落完整， 较扁平，如蜡滴，常与培养基紧粘而不易刮离。 氯化钠血琼脂上可见溶血环 人血琼脂平板上为绿色溶血环 氯化钠蔗糖琼脂上菌落呈绿色。 硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS)琼脂典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落，用接种环轻触，有类似口香糖的质感，直径2mm~3mm。