水牛奶中β-乳球蛋白过敏原表位定位的初步研究
收稿日期：2007-07-27 * 通讯作者
基金项目：国家自然科学基金项目(30560096)；教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0540)作者简介：李欣(1980-)，女，博士研究生，研究方向为食品生物技术。
水牛奶中β-乳球蛋白过敏原表位定位的
初步研究
李 欣1,2，高金燕3， 陈红兵1,2,*
(1.南昌大学 食品科学教育部重点实验室，江西 南昌 330047；
2.南昌大学中德联合研究院，江西 南昌 330047；
3.南昌大学食品系，江西 南昌 330047)
摘 要：为绘制水牛奶中β-乳球蛋白的过敏原表位，本实验以兔抗水牛乳β-乳球蛋白的抗体IgG 为固相筛选分子，免疫筛选噬菌体随机七肽库，采用间接ELISA 和竞争抑制ELISA 鉴定阳性克隆。经四轮富集后，得到16个阳性克隆子，进行测序，得到5个不同的肽段。与已知的表位比对，初步确定了六个I g G 识别表位，分别为：第41～51位(VYVEELKPIPE)、第51～64位(EGDLEILLQKWENDE)、第81～96位(VFKIDALNE NKVLVLD)、第141～56位(KALPMHIRLSFNPTQL)、第127～136位 (LNENKVLVLD)和第145～159 位(MHIRLSFNPTQLEEQ)。关键词：水牛乳；β-乳球蛋白；筛选；表位定位；食物过敏
Primary Epitope Mapping of β-Lactoglobulin from Buffalo Milk
LI Xin 1,2，GAO Jin-yan 3，CHEN Hong-bing 1,2,*
(1.Key Laboratory of Food Science, Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang 330047, China；
2.Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China；
3.Department of Food Science, Nanchang University, Nanchang 330047, China)Abstract ：To map the mimotopes of β-lactoglobulin from water buffalo milk, the specific rabbit antibody against buffalo β-lactoglobulin were used to pan the specific phage from a heptapeptide phage display library. The positive clones were identified by indirect ELISA and competitive ELISA. After fourth round enrichment , sixteen positive clones were obtained and five different clones peptide sequence were deduced by DNA sequencing. Compared with the known IgG epitopes of β-lactoglobulin,six epitopes have been identified, which are located at fragment 41～51(VYVEELKPIPE), fragment 51～64(EGDLEILLQKWENDE),fragment81～96(VFKIDALNE NKVLVLD), fragment 141～156(KALPMHIRLSFNPTQL), fragment127～136(LNENKVLVLD) and fragment 145～159(MHIRLSFNPTQLEEQ respectively.
Key words ：buffalo milk ；β-lactoglobulin ；panning ；epitope mapping ；food allergy
中图分类号： TS201.6 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2007)10-0360-04
牛乳β-乳球蛋白是乳清中的一种主要蛋白质，由162个氨基酸残基组成，分子量约为18.4kDa，是牛乳中的主要过敏原之一。β-乳球蛋白有五个异构体分别为：A 、B 、C 、D 和D r ，其中A 和B 比较常见。而水牛乳中也含有丰富的β-乳球蛋白，两者除第1和162位的氨基酸不同，其余氨基酸序列一致。水牛乳的β-乳球蛋白只有一个突变体，根据泳动速度和离心情况，与B 型相似。有研究表明，两者的存在着免疫交叉反应[2]。因此，水牛乳中的β-乳球蛋白的过敏问题也值得研究。本实验采用随机肽库筛选水牛乳中β-乳球蛋白
的模拟表位,与已知序列比对，对其IgG 结合表位进行初步定位，可以初步阐明水牛乳中β-乳球蛋白过敏原的物质基础。1材料与方法1.1
材料
噬菌体7肽库(Ph.D-7.TM Phage Display Peptide Library) New England Biolabs公司，库浓度为6.00×1012pfu/ml，受体菌为E.coli 2738，-96g III自动测序引物。主要试剂：H R P 抗M 13单抗(1:5000稀释工作浓
度) Amersham Biosciences公司；邻苯二胺 Sigma公司，溶于柠檬酸和磷酸氢二钠的底物缓冲液，底物浓度0.4mg/ml。离心机，Bio-Rad 凝胶呈像仪，Bio-Rad M680自动读板仪。抗水牛乳β-乳球蛋白兔IgG，本实验室采用免疫亲和层析方法制备，浓度为5.8mg/ml，纯度达电泳纯。水牛乳β-乳球蛋白是本实验室通过离子交换层析和凝胶层析方法制备，其浓度为43mg/ml，纯度高于商品化的β-乳球蛋白，即大于90%。
1.2方法
1.2.1噬菌体随机肽库的筛选
将纯化的多克隆抗体IgG用包被缓冲液(0.1mol/L NaHCO3，pH8.6)稀释至10μg/ml，每孔100μl包被96孔酶标板,4℃轻微震荡，孵育过夜。弃去包被液，每孔加满封阻液(0.1mol/L NaHCO3，5mg/ml BSA，0.02%的NaN3)，4℃封阻2h；用TBST(50mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，0.1% Tween-20)快速洗板六次，每孔加入2×1011个噬菌体，室温轻摇震荡60min；弃去未结合噬菌体液，用T B S T洗板10次，每孔加入甘氨酸洗脱液(0.2mol/L pH2.2 Glycine-HCl，1mg/ml BSA) 100μl，室温轻摇10m i n，洗脱特异性结合的噬菌体，收集洗脱液于微量离心管，加入中和缓冲液；留取5μl用于滴度测定，剩余洗脱物进行扩增，用于下一轮筛选。同样的方法进行第2、3、4轮筛选，洗脱液中的Tween-20浓度依次为0.25%、0.5%、0.5%。
1.2.2待测随机克隆的挑选
E.coli2738过夜培养物以1:100进行稀释加到试管中,第3和4轮的平板上挑取30个单菌落加到试管中，37℃摇培养4.5～5h培养物转入微量离心管中，离心30s。上清转入另一管中，再离心。用移液器将80%的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮液，进行E L I S A 检测及D N A序列测定。
1.2.3噬菌体滴度的测定
用L B培养基对洗脱液进行倍比稀释，分别取各稀释度的噬菌体加入到制备好的对数生长期的E.coli 2738菌液中，室温温育后加入到上层琼脂中混匀，均匀铺于平皿上，培养过夜。记录平皿上蓝斑个数。噬菌体滴度=平皿中蓝斑个数×稀释倍数，即每10μl的噬菌体形成单位。
1.2.4间接ELISA鉴定阳性克隆
用包被缓冲液稀释抗体(100μg/ml)，每孔100μl包被96孔酶标板，4℃过夜。弃包被液，每孔加满封阻液，4℃封阻2h。0.5%T B S T洗板3次，每孔一个克隆的上清液，37℃ 2h，洗板三次，加入1:5000稀释的HRP conjugate anti-M13抗体100μl/孔，室温孵育1h，洗板后加100μl/孔OPD底物显色液，室温作用10～20min 显色，2mol/L H2SO4终止反应，490nm处读数[3]。
1.2.5间接抑制ELISA方法
用包被缓冲液稀释抗体(100μg/ml)，每孔100μl包被96孔酶标板，4℃过夜。弃包被液，每孔加满封阻液，4℃封阻2h。0.5%T B S T洗板三次，每孔加50μl扩增的噬菌体和50μl 1mg/ml水牛乳β-乳球蛋白，37℃ 2h，洗板三次，加入1:5000稀释的HRP conjugate anti-M13 抗体100μl/孔，室温孵育1h，洗板后加100μl/孔OPD底物显色液，室温作用10～20min显色，2mol/L H2SO4终止反应，490nm处读数。
1.2.6D N A提取和序列测定
从1.2.3中挑到的噬菌斑进行扩增，得到的噬菌体上清用 PEG/NaCl进行沉淀。沉淀物重悬于100μl碘化物缓冲液中，加入250μl乙醇。室温温育10m i n。离心10m i n，弃上清；用70%的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。沉淀重悬于30μl TE[10mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，1m m o l/L E D T A]中，琼脂糖凝胶电泳鉴定。D N A序列的测定是自动双脱氧方法，由上海生工完成。公司提供的自动测序引物：-96 III 5'-OH CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'。
2结果与分析
2.1亲和淘选结果
从表1可知，第四轮筛选后的噬菌体产出率比第一轮高1000倍，说明经过四轮的筛选可以有效富集特异性噬菌体。
2.2间接ELISA和间接抑制ELISA进行阳性克隆子鉴定
按1.2.2步骤，从第三轮和第四轮分别挑选的30个克隆子，分别标为1～30号。将收集上清进行间接E L I S A，测定其吸光值，结果如图1和2所示。从图1和2分别筛选14和2个效价较高的克隆，其中第三轮的两个克隆分别标为6(3)和28(3)。将这16个克隆子进行扩增，再通过间接E L I S A和竞争抑制E L I S A，测定其吸光值，结果如图3和4所示。可知所得到的16个克隆子均被抑制，被确定为阳性。
2.3测序及表位初步定位结果
D N A测序结果表明，有5个不同的核苷酸序列，将其分别编号为I、I I、I I I、I V、V，对应的氨基酸表1 亲和淘选噬菌体随机肽库的回收率
Table 1 Recovery of washed phages by biopanning
淘选轮数投入量(pfu)产出量(pfu)回收率12×10113×104 1.5×10－7 22×10112×105 1.0×10－6 32×10116×106 3.0×10－5 42×10112×107 1.0×10－4
序列如表2所示。与β-乳球蛋白的氨基酸序列进行比对，得到的结果如表3所示。其中III 可在β-乳球蛋白中三个不同的位置找到同源性的氨基酸，分别标为III-1、III-2和III-3(下划线表示相同的氨基酸)。通过与β-
1.41.21.00.80.60.40.2
1357911131517192123252729A 490
不同的克隆子
图1 第三轮筛选的30个克隆子的ELISA 的吸光值
Fig.1 Absorbance of 30 samples from the third round at 490nm
by ELISA
0.500.450.400.350.300.250.200.150.100.050
1357911131517192123252729
A 490
不同的克隆子
图2 第四轮筛选的30个克隆子的ELISA 的吸光值Fig.2 Absorbance of 30 samples from the fourth round at
490nm by ELISA
1.81.61.41.21.00.80.60.40.20
3
5
7
9
11
15
17
19
28
28(3)
A 490
不同的克隆子
图3 19个扩增后克隆子的ELISA 的吸光值
Fig.3 Absorbance of 19 amplified samples at 490nm by ELISA
编号不同的克隆子7肽的核苷酸序列
对应的氨基酸序列I P3,8,15,26
TTG ACT CAG TTG GAT AAT CAT L T Q L D N H I I P4,6,9，10,12,16, 17,18,21
CAT AAG ATT GAG CAT ATA GCG H K I E H I A I I I P28TGG AGT TGG AAG CAG CTG GTG W S W K Q L V IV 6(3)TGG CCG AAG CTG GCG TCG CAT W P K L A S H V
28(3)
ATG CAT AAT CCT TTT CTG ACG
M H N P F L T
表2 噬菌体克隆插入的短肽序列
Table 2 Peptide sequences of phage clones
编号不同的克隆子对应的氨基酸序列β-乳球蛋白对应的肽段(位置)I 3,8,15,26L T Q L D N H MHIRLSFNPTQLEEQ(145～159)
IV 6(3)W P K L A S H VYVEELKPIPE(41～51)V 28(3)M H N P F L T KALPMHIRLSFNPTQL(141～156)I I I -128
W S W K Q L V
EGDLEILLQKWENDE(51～64)I I I -2VFKIDALNENKVLVLD(81～96)I I I -3
LNENKVLVLD(127～136)
表3 筛选的短肽序列与β-乳球蛋白的肽段的对比
Table 3 Comparison between amino acid of phage clones and β-lactoglobulin's peptide
乳球蛋白的氨基酸序列的比对，确定了六个IgG 识别表位，分别为：第41～51位(VYVEELKPIPE)、第51～64位(E G D L E I L L Q K W E N D E )、第81～96位(V F K I D A L N E N K V L V L D )、第141～156位
2.01.81.61.41.21.00.80.60.40.20
3
46891012151617182126286(3)
A 490
不同的样品
图4 19个扩增后克隆子的间接抑制ELISA 的吸光值Fig.4 Absorbance of 19 amplified samples at 490nm by
inhibition ELISA
对照组竞争抑制组
(KALPMHIRLSFNPTQL)第127～136位 (LNENKVLVLD)和第145～159位(MHIRLSFNPTQLEEQ)。
3讨 论
有文献报道，牛乳的β-乳球蛋白人的IgG识别表位有六个[4]。Jarvinen KM等[5]结合牛乳中的氨基酸序列，绘制出了人血清识别的Ig E和IgG结合线形表位，如下所示(粗体为I g E识别表位，下划线为I g G 识别表位)。
L I V T Q T M K G L D I Q K V A G T W Y
S L A M A A S D I S L L D A Q S A P L R
VYVEELKPTPEGDLEILLQK
W E N D E C A Q K K I I A E K T K I P A
V F K I D A L N E N K V L V L D T D Y K
K Y L L F C M E N S A E P E Q S L V C Q
C L V R T P E V
D D
E A L E K
F D K A L
KALPMHIRLSFNPTQLEEQC HI
与人的IgG识别表位相比，本研究的克隆子I中的2～4个氨基酸序列和β-乳球蛋白第154～156位的氨基酸序列一致；而克隆子III-3有四个氨基酸与第52～65位的氨基酸序列相同；另外与克隆子Ⅲ序列相似的三个氨基酸分别可在第91～95位和第31～135位找到。同时文献中Jarvinen KM等[6]在2002年用合成的九肽段确定了5个人的IgE识别位点，其中第127～136位和第141～150位与噬菌体七肽的三个氨基酸相似，而第47～56位中有两个氨基酸与IV一致。这说明IgE和IgG识别表位之间存在交叉。
Koko Mizumachi[7]等通过小鼠口服不同浓度的β-乳球蛋白，得到了第42～56位和第52～66位两个位点，IV和III-3分别有3和4个氨基酸与这两个肽段一致。Willimas SC[8]等用两只小鼠对其IgG进行了定位，本试验测序得到的氨基酸序列与其中的一个位点一致。
Willimas S C[8]等采用了6只兔子对β-乳球蛋白进行IgG表位定位，每只兔子约有6～7个IgG识别表位，其中第41～50位、第120～135位和第144～152位为主要的识别表位，本实验也得到了这三个I g G识别表位。Venien A[9]等将β-乳球蛋白用胰蛋白酶进行酶解，采用兔单抗对其酶解片段的表位进行分析：确定了片段第21～40位，第41～60位，第61～70位，第149～162位四个识别位点，其中41～60和149～162可被更多的单抗识别，这两个表位在本实验中也被筛选到。
由于Duchateau J[10]等曾提到IgG更倾向识别构象型表位，Venien A[9]等制备兔单克隆抗体，也探讨了IgG 识别β-乳球蛋白的构象型表位，所以在本试验中克隆子Ⅴ(MHNPFLT)虽然没有连续三个氨基酸与β-乳球蛋白相似，但第141～156位中含有不连续的氨基酸与其7个氨基酸对应，推测由于空间构象的折叠使之形成连续，从而与抗体结合。
本实验初步定位了水牛乳β-乳球蛋白的6个IgG识别表位，但根据每5～7个氨基酸可构成一个线形表位，水牛乳β-乳球蛋白应该有至少20个IgG识别表位，所以进一步的工作仍值得探索。
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20
40 60
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关于食品过敏原的探讨
关于食品过敏原的探讨 摘要：本文讨论的是关于食品过敏原在国内外的关注情况、与之相关的检测、标识和立法，对今后提高食品过敏原控制的研讨。 关键词：食品过敏原、标识 目前，食品安全问题是全球关注的热点问题之一，关于食品过敏原的问题也越来越多的得到各国的注意，相关的立法和研究在不断发展。食品过敏原（Food Allergen）问题属于食品安全性的范畴，又涉及到临床医学等的领域。对食品过敏原问题的在不同国家、不同地区各不相同的理解和关注程度。国外发达国家已经有着诸多的报道和研究，甚至有较具体的立法对食品生产和经销者进行监管，而我国对食品过敏原的研究和关注较少，而消费者对由此引发的过敏反应也没有引起足够的关注。随着国家对食品安全工作的深入开展，食品过敏原的问题将逐渐得到重视。 在过去的几十年中，食品过敏的发病率日益增加，给临床和食品工业造成了的压力，也引起了消费者的一度恐慌，增加了民众对食品的不安全感。调查显示全世界范围内有１％～２％的成年人对食品过敏，而低于三岁的儿童中有８％以上对食品过敏。社会生活的变迁，引导着人们生活习惯不断发生改变，饮食业跨越地区和国家的界限快速发展，转基因食品的大量涌现，过敏症状亦趋于多样复杂和严重化。食品过敏原的安全性问题要求食品的生产者、管理者以及消费者充分认识到这一点，共同把可能存在的任何风险降至最低限。 1 关于食品过敏原的介绍 目前大约有160多种食品含有可以导致过敏反应的食品过敏原，常见的食品有：奶（牛奶、山羊奶等），树果（杏仁、胡桃、山核桃、榛子和腰果等），菜籽（葵花籽、芝麻等），豆类（花生、大豆、豌豆、蚕豆等），蛋类，巧克力，香辛料，鲜果，海产品（虾、贝壳类）等。一般来说，食品过敏原为分子量介于10000～70000之间的蛋白或糖蛋白，占食品总蛋白的极小一部分，分别属于不同的蛋白家族。但是微量的食品过敏原蛋白即可引起严重的过敏反应。据专家报道， 产生的临床症状包括皮肤反应（荨麻疹、血管性水肿、湿疹），呼吸症状（哮喘、鼻炎），肠胃症状（呕吐、腹泻、肠胃痉挛），系统反应（心血管症状），肌肉和骨骼等不同形式的临床症状，有时可能产生过敏性休克（Anaphylactic Shock），甚至危及生命。当摄入了有关的食物，其中的食品过敏原可能导致一系列的过敏反应。过敏反应通常会在一个小时内出现，症状明显，有时表现得会较激烈，包括诸如呕吐，腹泻，呼吸困难，嘴唇、舌头或咽喉肿胀，血压骤降等。而因食品产生的敏感或不适反应却可能在几小时内，甚至几天后才会发生，主要的症状有：湿疹，胃肠不适综合症，偏头痛，麻疹，鼻炎，全身乏力，哮喘，关节炎，疼痛，儿童多动症等。 2 国内外对食品过敏原的标识管理和控制 关注食品过敏原可以先关注食品标签，对于流通领域的食品消费者可以通过仔细阅读产品标签获得产品信息，了解产品的配料、生产过程，控制误食引起的食品过敏情况。目前，欧盟二十国，美国、澳大利亚、日本等发达国家已经对食品过敏原立法。
各国食品致敏原标识管理要求
食品过敏原标识管理 一、食品过敏原标识管理 1、过敏原：又称为致敏原、变态反应原、变应原，指能够诱发机体发生过敏反应的抗原物质（蛋白质）。 2、食物过敏是人们对某些食物产生的一种不良反应，在医学上属于一种变态反应。 3、食品过敏原是普通食品中正常存在的天然或人工添加物质，被过敏体质人群消耗后能够诱发过敏反应。 4、各个国家食品标识应标明的过敏原成分
5 1）正确的食品标签：对于过敏体质的人群，预包装食品标签上正确、清楚地标识出过敏原成分，是防止他们发生食物过敏反应甚至危及生命最有效的措施。 2）国外多国已发布多项法规对过敏原标识作出规定。 3）我国已实施的标准：GB/T23779-2009预包装食品中的过敏原成分；即将实施的《预包装食品中过敏原成分的标签要求》。
1）婴幼儿患者：在5 -6岁时大约80%对牛乳、鸡蛋、花生、小麦、大豆产生过敏反应，大约20%对鱼、甲壳类动物的过敏会消除、其余的往往是终生过敏。 2）成年人：食物过敏的发病率成快速上升的趋势。 3）食品过敏的临床表现：麻疹、疱疹样皮炎、口腔过敏综合征、肠病综合征、哮喘及过敏性鼻炎、严重时可导致过敏性休克，危及生命。 4）食物过敏至今无特效疗法。 5）过敏原引发过敏反应的最低量无定论。 6）极微量过敏原即可造成造成严重后果。 7）目前预防是防止食物过敏唯一的途径—严防有过敏体质的人接触过敏原。
三、我国出口食品因过敏原被预警召回情况（摘选） 四、过敏原管理 1、食品过敏原管理包括：生产商、监管机构、检测机构、消费者。 2、“可能存在”及预防措施： 1）需考虑对无法控制的、偶然发生的、潜在的危害所采取的最后补救措施； 2）如果上述情况存在，则可以使用“可能存在”这样的描述； 3、已确定三项过敏原管理原则： 1）控制及培训：生产企业内部必须建立行之有效的过敏原成分； 2）原料标识成分：必须准确地反映出食品听过敏成分； 3）警示标签和警示性说明：需在包装上向过敏体质消费者提供相关信息。 4、过敏原控制： 1）有意添加及潜在交叉污染的控制：导致交叉污染的原因 a收购原料前后的交叉接触；b错误的配方；c交叉接触；d存储条件差；e共享生产设备；f原料粉尘的污染；g与反工材料一起进行加工；h人为过失。 2）风险识别：a确认存在过敏原的原料；b确定各个加工环节可能存在的过敏原；c明确存在交叉污染的环节；d明确标签问题。 3）确定12个关键环节： A审核供应商；b原料验收；c确定消费群；d环境卫生；eHACCP计划；f企业员工安全意识；g反工环节； h重新配方；i产品研发；j标识；k工程及维护；l措施计划。 五、过敏原的阀值 1、食物中即使含有很微量的过敏原也可以引发消费者的过敏反应。 2、低于10mg/kg的水平可能会低于过敏反应的阀值。 3、仍需严格确定精准的过敏反应阀值。 4、最低可见有害作用水平（LOAEL）： 已公布的食品过敏原LOAEL值（蛋白水平）
水牛奶中β-乳球蛋白过敏原表位定位的初步研究
收稿日期：2007-07-27 * 通讯作者 基金项目：国家自然科学基金项目(30560096)；教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0540)作者简介：李欣(1980-)，女，博士研究生，研究方向为食品生物技术。 水牛奶中β-乳球蛋白过敏原表位定位的 初步研究 李 欣1,2，高金燕3， 陈红兵1,2,* (1.南昌大学 食品科学教育部重点实验室，江西 南昌 330047； 2.南昌大学中德联合研究院，江西 南昌 330047； 3.南昌大学食品系，江西 南昌 330047) 摘 要：为绘制水牛奶中β-乳球蛋白的过敏原表位，本实验以兔抗水牛乳β-乳球蛋白的抗体IgG 为固相筛选分子，免疫筛选噬菌体随机七肽库，采用间接ELISA 和竞争抑制ELISA 鉴定阳性克隆。经四轮富集后，得到16个阳性克隆子，进行测序，得到5个不同的肽段。与已知的表位比对，初步确定了六个I g G 识别表位，分别为：第41～51位(VYVEELKPIPE)、第51～64位(EGDLEILLQKWENDE)、第81～96位(VFKIDALNE NKVLVLD)、第141～56位(KALPMHIRLSFNPTQL)、第127～136位 (LNENKVLVLD)和第145～159 位(MHIRLSFNPTQLEEQ)。关键词：水牛乳；β-乳球蛋白；筛选；表位定位；食物过敏 Primary Epitope Mapping of β-Lactoglobulin from Buffalo Milk LI Xin 1,2，GAO Jin-yan 3，CHEN Hong-bing 1,2,* (1.Key Laboratory of Food Science, Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang 330047, China； 2.Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China； 3.Department of Food Science, Nanchang University, Nanchang 330047, China)Abstract ：To map the mimotopes of β-lactoglobulin from water buffalo milk, the specific rabbit antibody against buffalo β-lactoglobulin were used to pan the specific phage from a heptapeptide phage display library. The positive clones were identified by indirect ELISA and competitive ELISA. After fourth round enrichment , sixteen positive clones were obtained and five different clones peptide sequence were deduced by DNA sequencing. Compared with the known IgG epitopes of β-lactoglobulin,six epitopes have been identified, which are located at fragment 41～51(VYVEELKPIPE), fragment 51～64(EGDLEILLQKWENDE),fragment81～96(VFKIDALNE NKVLVLD), fragment 141～156(KALPMHIRLSFNPTQL), fragment127～136(LNENKVLVLD) and fragment 145～159(MHIRLSFNPTQLEEQ respectively. Key words ：buffalo milk ；β-lactoglobulin ；panning ；epitope mapping ；food allergy 中图分类号： TS201.6 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2007)10-0360-04 牛乳β-乳球蛋白是乳清中的一种主要蛋白质，由162个氨基酸残基组成，分子量约为18.4kDa，是牛乳中的主要过敏原之一。β-乳球蛋白有五个异构体分别为：A 、B 、C 、D 和D r ，其中A 和B 比较常见。而水牛乳中也含有丰富的β-乳球蛋白，两者除第1和162位的氨基酸不同，其余氨基酸序列一致。水牛乳的β-乳球蛋白只有一个突变体，根据泳动速度和离心情况，与B 型相似。有研究表明，两者的存在着免疫交叉反应[2]。因此，水牛乳中的β-乳球蛋白的过敏问题也值得研究。本实验采用随机肽库筛选水牛乳中β-乳球蛋白 的模拟表位,与已知序列比对，对其IgG 结合表位进行初步定位，可以初步阐明水牛乳中β-乳球蛋白过敏原的物质基础。1材料与方法1.1 材料 噬菌体7肽库(Ph.D-7.TM Phage Display Peptide Library) New England Biolabs公司，库浓度为6.00×1012pfu/ml，受体菌为E.coli 2738，-96g III自动测序引物。主要试剂：H R P 抗M 13单抗(1:5000稀释工作浓
牛乳酪蛋白检测方法研究进展
牛乳酪蛋白检测方法研究进展 倪小琴，赖卫华* （南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047） 摘?要：牛乳含有丰富的蛋白质，是比较理想的营养物质，但也是常见的过敏原之一。酪蛋白是牛乳中含量最高的蛋白，常作为牛乳过敏检测的主要参考指标之一。其检测方法主要包括基于免疫学的方法、聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction ，PCR ）、毛细管电泳分析、色谱法、质谱法等，本文就其检测方法的原理、特性及实际应用进行综述，并对未来检测的发展方向进行展望。关键词：酪蛋白；过敏原；检测方法 Research Progress in Methods for Detecting Cow ’s Milk Allergen Casein NI Xiao-qin, LAI Wei-hua * (State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China) Abstract: Cow ’s milk is rich in proteins, and an ideal nutritional substance, but it is also a common allergen in foods. Casein is the highest content of protein in milk, and is often used as a major index for detecting the allergenicity of cow ’s milk. The currently available detection methods include mainly immunological techniques, polymerase chain reaction (PCR), capillary electrophoresis, chromatography, and mass spectrometry. This article reviews the principles, characteristics and applications of these detection methods, and proposes future trends in the development of new detection methods.Key words: casein; allergen; detection methods 中图分类号：TS207.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）03-0290-05 doi:10.7506/spkx1002-6630-201403057 收稿日期：2012-12-07 作者简介：倪小琴（1990—），女，硕士研究生，研究方向为食品质量安全。E-mail ：xychun555@https://www.wendangku.net/doc/4a9595907.html, *通信作者：赖卫华（1968—），男，教授，博士，研究方向为食品安全。E-mail ：talktolaiwh@https://www.wendangku.net/doc/4a9595907.html, 牛乳制品是一种营养丰富的蛋白制品，同时也是常见的八大过敏物质之一，其致敏性严重影响了婴幼儿的身体健康。根据修订后的2007/68/EC [1]，欧盟法规规定在食品的生产加工过程中，若原料或产品中的某种成分来自附件Annex Ⅲa 指定的过敏物质时，必须在食品标签上明确标出这些物质的成分。据调查[2]，在发达国家中，牛乳过敏占过敏事件的3%～7.5%，严重影响了婴幼儿的健康，部分甚至导致儿童死亡。而目前，对于食物过敏的最好最直接的办法是严格避免食用含过敏原的食物，但在食品的加工生产过程中，会掺杂着少量潜在的致敏物质，所以，人们亟需研究出能够快速检测食物中致敏物质的方法，达到预防的目的。 牛乳过敏原引起的过敏反应是一种由IgE 介导和非IgE 介导的超敏反应，可引起皮肤、肠胃道、呼吸系统的反应，严重时甚至会导致系统过敏反应或休克。牛乳蛋白常作为一种常见的食品添加剂，应用在食品生产的很多方面，这些残留的成分可能会引起致敏反应。本文通过总结归纳目前国内外常见的检测牛乳酪蛋白的方法，简述各种方法的原理及其应用，并对未来检测的发展方向进行展望。 1 检测酪蛋白的原理 牛乳中含有3%～3.5%的蛋白质，其中酪蛋白占总蛋白的80%[3]，是牛乳中最主要的过敏原之一。由于牛乳中酪蛋白含量较高，实验可通过检测酪蛋白的有无来判断食物中是否含有牛乳成分，以此作为过敏人群判断食品成分的一个依据。基于此，本文主要对目前应用在酪蛋白上的检测方法进行总结归纳。2 牛乳过敏原酪蛋白的检测技术2.1 基于免疫学的分析技术 基于免疫学原理建立的检测方法，是借助酶标记的抗体或抗原进行特异性结合的抗原抗体反应，并根据显色颜色的深浅来进行定量或定性的分析方法。根据标记物的显色物质的类型，将免疫类型可分为酶联免疫吸附技术、免疫荧光技术、火箭电泳免疫技术、时间分辨荧光免疫分析这四类。 在应用免疫学方法检测过敏物质时，考虑到酪蛋白
吸入及食物过敏原
吸入性及食物性过敏原特异性IgE 抗体检测试剂盒的标准操作规程 1 目的：保证特异性IgE(sIgE)试验的正确操作，保证检验结果的准确可靠。 2 适用范围：临床免疫实验室 3 项目名称：吸入性及食物性过敏原特异性IgE 抗体检测试剂盒 4 项目方法：欧蒙印迹法 5．原理：采用免疫印迹法原理。 5．1 经缓冲液预处理的检测膜条与患者样本进行温育。如果样本阳性，IgE 类特异性抗体与相应的过敏原结合。 5．2 在洗涤之后，加入酶标单克隆的抗人IgE 抗体（酶结合物）进行第二步温育，以形成复合物。 5．3 在孵育之后，冲洗掉未结合的酶-抗-IgE，然后加入底物液，发生颜色反应。 5．4 终止反应之后，风干判读结果。 6．标本种类及收集、运送要求： 6．1 病人准备：要求患者在安静状态下；晨起的精神、体力、情绪等因素的影响较小，是标本采集的最佳时间；抽取肘部静脉血或毛细血管血。 6．2 标本种类：人血清或者EDTA、肝素或柠檬酸抗凝血浆。 6．3 标本稳定性：待测样本于2-8°C 条件下通常可保存14 天。稀释后的样本应在同一个工作日内检测。 6．4 标本稀释：患者样本不需稀释，直接检测。 6．5 标本容器：一般用真空采血管中的血清促凝管（红色头盖）或抗凝管（紫色或绿色头盖）。 6．6 标本最小用量：血清最小用量 1ml。 6．7 标本运送：标本采集于真空采血管后应尽快送实验室分析，物流系统可加快标本传递速度。若标本不能及时转运到实验室，应将真空采血管内的标本置冰瓶或冷藏箱内，运送过程中应避免剧烈震荡。当天无法运送的标本应分离血清后冷藏。 7．试剂： 7．1 来源：欧蒙公司. 7．2 规格： 16*1人份/盒 7. 3 试剂盒组成和代号：
乳品安全中的牛乳过敏
乳品安全中的牛乳过敏 Milk allergy in the dairy safety 罗曾玲陈红兵 LUO Zeng-ling CHEN Hong-bing (南昌大学食品科学教育部重点实验室中德联合研究院,江西南昌330047) (The Key Laboratory of Food Science of MOE,Sino-German Joint Research Institute,Nanchang University,Ministry of Education,Nachang,Jiangxi 330047,China) 摘要:牛乳过敏是婴幼儿中一种常见的食物过敏，严重危害婴幼儿健康。对牛乳过敏的机理、牛乳中的过敏原成分、牛乳过敏原的检测、加工对牛乳过敏原的影响作了详细的介绍。 关键词:牛乳过敏；牛乳过敏原 Abstract:Milk allergy is the most food allergy in early childhood and is harmful for the growth of the children.The mechanism of milk allergy, milk allergens,the detection of milk allergens and effects of processing on milk allergens are introduced in detail. Keywords:Milk allergy；Milk allergen dairy safety 牛乳过敏是儿童中一种常见的食物过敏，严重地影响儿童的身体健康。它在儿童中的发生率为0.5%～7.5%[1，2]，且主要见于婴幼儿，一般是暂时性的，随着年龄的增长，会自动消失[3]。据报道，在北欧的一些国家，牛乳过敏在2岁以下儿童中的发生率为1.9%～2.8%，而在3岁以上儿童中的发生率仅为0.3%左右[4]。在成年人中牛乳过敏也偶有发生，但发生率极低，小于1%[5]。乳及乳制品是儿童重要的食物蛋白来源，而牛乳过敏严重危害儿童健康，已引起了全球的广泛关注，是食品安全领域的主要研究课题之一。 1机理 牛乳过敏是由牛乳中蛋白过敏原所引发的食物不良反应，与非过敏性食物不—————— 基金项目：国家自然科学基金项目（30560096） 作者简介：罗曾玲(1981-)，女，南昌大学中德联合研究院在读研究生。 E-mail:luozling269@https://www.wendangku.net/doc/4a9595907.html, 通讯作者：陈红兵
常见的易过敏的食物
常见的易过敏的食物 发表者：刘颖慧(访问人次：12961) 那些食物可引起过敏？ “病从口入”是过敏性疾病的特点之一。目前已知可以引起过敏的食物有数千种之多。随着生活水平的提高，高蛋白食物和水果种类越来越多，过敏食物也随之增加，如各种海鲜，奶制品，肉制品，豆制品，花生、开心果、腰果等坚果类，蘑菇、芸豆等蔬菜，桃子、草莓、菠萝等水果，蚕蛹、蚂蚱等可食昆虫，食品添加剂和防腐剂等。更为严重的是许多人甚至因为食用某些食物而死亡，所以千万不要小觑食物过敏，如美国每年有50-100人因花生过敏而猝死，他们当中的绝大多数只是不小心吃了1-2粒花生米。美国科罗拉多州过敏研究中心的医生发现因食用坚果类、牛奶和鱼类而死亡的病人中大多数伴有哮喘病。因此伴有哮喘病的过敏性疾病患者尤应注意食物过敏。由于我国和国外的饮食习惯不同，所以过敏食物的种类也有差异，我国以海产品和水产品的过敏较为常见，而国外常见的可可、草莓过敏在我国并不常见，目前在我国常见的过敏食物主要包括以下数种： 1. 海产品及水产品：虽然海鲜营养丰富，味道鲜美，但很容易诱发过敏，在沿海或湖泊地区，各种海产品或水产品如鱼、虾、蟹、蛤蜊、海螺、鱿鱼、贝类、鲍鱼和海参等均容易引起过敏，近年来人们时尚“尝海鲜”的风气增加了罹患过敏病的几率。已经发现鲐鱼、鳟鱼、金枪鱼和鲑鱼等鱼肉颜色偏红的鱼类以及虾蟹等甲壳纲海产品均含有较高的过敏原成份，而且这些过敏原通常耐热，烹饪后也常常诱发过敏。此外，海产品容易过敏也可能与海产品容易被微生物侵袭而腐败有关。近年来已证实吸入气传鱼类粉粒和吸入鱼类腐败时的异味可以诱发哮喘,?这可能是渔业发达地区哮喘发病率增高的重要原因。 2.牛奶：牛奶及奶制品是常见的过敏食物，尤其是在婴幼儿和儿童。许多婴幼儿喝了牛奶或奶粉后可诱发湿疹或哮喘，也有表现为消化道过敏，如呕吐、腹痛、吵闹。部分婴幼儿拒食牛奶的原因就是对牛奶过敏的一种自我反射性保护。国外发现的突发性婴儿“摇篮死亡（cot death）”即与牛奶过敏有关。牛奶中的甲种乳白蛋白是最强的过敏原成份，这种蛋白不耐热，经高温煮沸处理后，其过敏原性可减弱。 3.花生、黄豆、芝麻等油料作物：主要是与这些油料作物含有较高的蛋白和多糖-蛋白有关，如花生中的过敏原成分为花生仁-1A和花生仁-1B。调查显示，5%的美国儿童对花生过敏，美国每年因食物过敏而死亡的患者中，60%与花生过敏有关。我们在临床上经常可以遇到食用花生仁引发过敏的病人，尤其是生花生黄豆及豆制品过敏也较常见，过去对牛奶过敏的儿童往往以豆奶代替，现在许多学者认为豆奶也具有较高的致敏性。花生、黄豆和芝麻一旦制成油制品很少诱发过敏症状。 4.蛋类：鸡蛋以及蛋制品可以导致各个年龄段病人的过敏，其中蛋清中的卵蛋白是诱发过敏的主要成份，蛋黄较少诱发过敏。此外鹌鹑蛋、鸭蛋和鹅蛋等也可诱发过敏症状。由于我国
八大类食物易过敏
最容易引起过敏的八大类食物 因进食某种正常状态的食物引起的不正常反应，如荨麻疹、湿疹、哮喘、过敏性鼻炎、血管性水肿、皮炎、腹胀、腹泻或腹痛、偏头痛等，而且这些反应只在一部分敏感人群发生，称为食物过敏（Food allergy or Food hypersensitivity）。食物过敏的发生机制与不正常免疫（特别是IgE抗体）有关。还有一种与食物过敏类似的情况，叫做食物耐受不良（Food intolerance，也称食物不耐受），也是因为进食某种正常状态的食物引起的不正常反应，其表现与食物过敏相似，也与某些人特殊敏感体质有关，但其发生机制与免疫机制无关，最典型的例子是牛奶乳糖不耐受。在实际工作中，食物过敏和食物耐受不良这两种情况很难区分。有人统称它们为“食物的不良反应”（adverse reaction of food）。还有人干脆把这两种情况都称为食物过敏，造成了概念上很大的混乱。 1999 年国际食品法典委员会第23 次会议公布了常见致敏食品的清单，认为在世界范围内（中国的情况未必完全一致）临床上90%以上的过敏反应（可能也包括了食物不耐受）由八类食物引起： ①奶类，特别是牛奶； ②禽蛋类； ③鱼类（包括海水鱼、淡水鱼）； ④甲壳类水生动物（虾、对虾、螃蟹、大小龙虾、蛤蜊等）； ⑤花生； ⑥大豆； ⑦坚果类（杏仁、核桃、腰果、榛子、松子、栗子等）； ⑧小麦。 明确对某种食物过敏的人，应尽量避免食用该种食物，同时，（因为食物过敏经常有交叉现象）要注意以上各种高致敏性的食物，密切观察进食这些食物后的反应。 未明确过敏食物，但经常出现上述过敏反应者，除了密切观察进食这些食物后的反应外，还可以进行食物过敏检测，包括“食物过敏原过筛实验”（IgE检测）和“乳糖氢呼吸实验”，前者针对食物过敏，后者针对乳糖不耐受。
食品过敏原
二、食品过敏原的性质 （一）食品过敏原的一般特性 食品中含有多种不同类型的蛋白质，但只有少数一些蛋白质是已知的过敏原。在植物性食品中，如花生和大豆，大多数过敏原蛋白都是储存蛋白，而且在某些特定食品中含量丰富。但也有些蛋白质含量很低，却是主要过敏原，如鳕鱼过敏原Gad c 1。 与所有其他种类的抗原一样，要引起机体免疫反应，食品过敏原必须是一种宿主免疫系统不能识别的外来分子。大多数食品过敏原是一些对食品处理、烹饪和消化过程具有抗性的高稳定性蛋白质分子。但也有例外，如苹果等新鲜水果及蔬菜中的某些过敏原就是一些不稳定蛋白。一般来说，稳定性过敏原引发的过敏反应主要发生在口腔粘膜上，因为它们被降解后就会失去过敏原性。但消化过程中食品过敏原的抗原表位是否会改变，从而影响其致敏性，进而引发过敏反应还有待进一步研究证实。 对本土性的常见食品，摄入量往往是该食品过敏原诱发过敏反应的重要因素，如挪威的鳕鱼、美国的花生日本的大豆和大米诱发的过敏反应等。同时，食品过敏反应中食品过敏原的摄入方式也是一个重要的因素。食品过敏原的摄入主要是通过食入的方式，但越来越多的研究表明吸入和皮肤接触食品过敏原同样能引起食品过敏反应，从事食品工作的人员有职业性食品过敏疾病就是最好的例子。黏膜渗透性被认为是食品过敏反应中的另一个重要因素。许多食品蛋白能够穿透胃肠黏膜，进而诱导正常个体产生免疫反应。但食品过敏患者与正常人在黏膜对过敏原的吸附方式究竟有什么不同，及肠胃黏膜渗透性与是食品过敏之间究竟存在怎样的关系，至今仍未得到阐明。对于婴幼儿，由于其胃肠黏膜屏障还未成熟，大分子蛋白质能够很容易地通过胃肠上皮细胞而引发食品过敏反应，所以相比之下，婴幼儿食品过敏性疾病的发病率要比成年人高很多。 食品过敏性疾病在全国范围内都是很常见的一种疾病。但由于食品过敏易与食品毒性反应及食品不耐受相混淆，因而其发病率的多篇报道结果相差悬殊。发达国家儿童食品过敏原发病率是1.4%（0.5%~3.5%），北美报告整个人群中食品过敏原的发病率为10%（儿童13%，成人7%），欧洲儿童过敏原发病率为0.3%~7.5%，成人为2%。成人食品过敏原发病率明显低于儿童过敏原发病率，这主要是由于婴儿及儿童的胃肠道屏蔽作用差，免疫系统发育不成熟的缘故。婴儿及儿童食品过敏原发病率随年龄的增长而下降。1990年采用双盲对照食品激发实验对两组人群进行调查研究，结果发现荷兰的成年人中有2.4%发生食品过敏，而英国成年人中有1.4%~1.8%发生食品过敏。进一步调查发现，芬兰青壮年约有3%~6%对牛奶过敏；美国的普通人群中约有1.1%对花生和坚果过敏；英国的成年人中约有0.5%对花生过敏。国内对3040名2岁以下儿童的一项调查显示，产生食品过敏原的比率为5.2%。最近我国24个省和自治区健康人群食品过敏状况的初步调查结果显示自诉有食品过敏史的有5.7%，其中，皮肤点刺试验阳性率为1.9%，占自诉食品过敏人群的33.5%。在其他研究中发现，食品过敏的发生存在性别上的差异，发生食品过敏的患者中女性占轻微的优势。年龄在25~74岁的受试者中发生过敏反应的女性占27.5%，而男性为14.0%。此外，食品过敏性疾病的发病率也存在地域上的差异，不同国家、地区过敏性疾病的发病率有很大的不同，例如在西班牙有4.6%的人有食品过敏史，而在澳大利亚则有19.1%的人有食品过敏史。本病的发生还与
过敏原分类
过敏原分类 (2009-12-21 12:09:49) 能引起过敏症的物质数以千计，它们存在的空气、食物、饮料、药物、甚至可接触到的日用品中，而这些物质便叫做“过敏原”分为以下几类： 1、食物过敏原：食物过敏原可以是一些普通的食物和饮料，如海产类、果仁类、草莓类、香料、牛奶、啤酒或含有酒精的饮料均可能成为引起最常有的皮肤过敏症状------荨麻疹。 接触性过敏原： 2、有毒物质过敏：接触有毒的常春藤和有毒的橡树及金属（镍）和染料引起。还有一般的日用品如香水、指甲油、化妆品及橡胶。过敏的部位会呈现类似荨麻疹的红疹及瘙痒。 3、空气过敏原： 散播于空气的过敏原，因其可以远播而引起的多种过敏症。其中花粉、霉菌和藻类都会引起最常见的一种鼻敏感症----枯草热，枯草热的季节由春天开始直至秋天。其他散播于空气中的过敏原有尘螨、动物皮毛、工业污染废料以及在潮湿环境中生长的霉菌。 4、注入性过敏原：除了某些注射药物外，还包括昆虫叮咬、大黄蜂和蜜蜂等的刺蛰。 传统医学界对过敏没有很好的根治手段，大量的黄胺类、激素类的药物运用只是起到缓解症状的作用而且副作用极大，过敏病人都是在一次次的长年累月的反复发作中缓解症状，身体的免疫能力日趋低下，极为痛苦。 在7月8日全球首个“世界过敏日”里，中华医学会会长钟南山院士指出，中国有两亿多人患过敏性疾病，脱敏已是公认疗效显著的疗法。 钟南山院士介绍，目前全球有22％的人群患有过敏性鼻炎、哮喘、湿疹等过敏性疾病，并以每10年23倍的速度增加，预计2010年将达到全球人口的40％。依此类推目前中国有两亿多人患有过敏性疾病，应引起重视。 诱发过敏反应的抗原称为过敏原。过敏原是过敏发生的必要条件。引起过敏反应的抗原物质常见的有2000-3000种，医学文献记载接近2万种。它们通过吸入、食入、注射或接触等方式使机体产生过敏现象。常见的过敏原如下： A、吸入式过敏原：如花粉、柳絮、粉尘、螨虫、动物皮屑、油烟、油漆、汽车尾气、煤气、香烟等。 B、食入式过敏原：如牛奶、鸡蛋、鱼虾、牛羊肉、海鲜、动物脂肪、异体蛋白、酒精、毒品、抗菌素、消炎药、香油、香精、葱、姜、大蒜以及一些蔬菜、水果等。 C、接触式过敏原：如冷空气、热空气、紫外线、辐射、化妆品、洗发水、洗洁精、染发剂、肥皂、化纤用品、塑料、金属饰品（手表、项链、戒指、耳环）、细菌、霉菌、病毒、寄生虫等。 D、注射式过敏原：如青霉素、链霉素、异种血清等。 E、自身组织抗原：精神紧张、工作压力、受微生物感染、电离辐射、烧伤等生物、理化因素影响而使结构或组成发生改变的自身组织抗原，以及由于外伤或感染而释放的自身隐蔽抗原，也可成为过敏原。 治疗顽固性过敏最有效的措施是寻找出过敏诱发因子（过敏原），但要在2万种不同的诱发因子中准确地找到致病因子犹如大海里捞针。最新权威实验证实：过敏人群体内自由基
食品过敏原的常见检测技术
食品过敏原的常见检测技术 1、免疫学检测技术 之前提到95%的食品过敏原属于蛋白质，因此专门针对蛋白检测的免疫学相关技术是检测食品中蛋白类过敏原的重要手段。其中免疫学检测包括免疫吸附技术、免疫层析技术、免疫传感器技术、免疫扩散技术以及免疫印迹等技术。 免疫吸附技术主要包括酶联免疫吸附技术和放射/酶联吸附抑制实验。酶联免疫技术是将抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化反应有机结合起来的一种检测技术，其原理是被酶标记的抗体与食品过敏原发生反应作用于底物后，其显色深浅能够反映待测样品中过敏原的含量。该技术特异性强，灵敏度高，操作简单，易于推广，但也存在制备抗体困难，不适用于低分子量和不稳定的过敏原检测，存在结构类似物的交叉反应和对试剂选择性高导致无法进行多残留检测等不足。而放射/酶联吸附抑制实验则是使待测食品中的过敏原与固相载体上的抗原竞争结合特定人群血清中的IgE，之后再加入一种抗IgE的同位素或酶标记抗体，反应完成后通过添加可改变颜色或者能发光的底物用于检测结合IgE的抗体，最终推测出食品中过敏原的浓度。尽管它是科研人员使用最广泛和最灵敏的方法，在生海鲜、大豆、花生油和坚果类食物过敏原检测中已有应用，然而由于检测过程中的人血清难以标准化以及商业化的食品过敏原在固相载体上与IgE的结合 能力不尽相同，限制了该方法的推广。 免疫层析技术检测食品中的过敏原的原理是将特异的抗体固定在硝酸纤维素膜的某一取代，当样品浸入干燥膜一端，通过毛细管作用沿膜向前移动到有抗体的区域时，过敏原能与其发生特异性结合，之后若使用免疫胶体金或免疫酶染色则可使该区域呈色实现免疫诊断。目前该技术在花生蛋白类过敏原和榛子过敏原上具有一定应用，具有检测阈值低和高特异性的优点，但作为定性或半定量技术来说，还有待进一步发展。免疫传感器技术则是将传感技术和特异性免疫反应相结合对食品中的过敏原进行检测，具体是通过对识别原件表面的特异性抗原抗体反应实时监测，将检测结果通过传感器转换为精密数字输出，不仅具有快速简便，便于收集和整理数据的优点，而且损伤和污染样品的可能性小，推广性强。 免疫扩散技术是免疫学中最常用的检测手段，一般来说，单向琼脂扩散可用于定量分析，双向琼脂扩散用于定性分析。目前为了提高扩散速度和灵敏度，通常结合电泳共同检测食品过敏原，基本原理是以半固体的琼脂凝胶作为介质，将食品中可溶性的过敏原溶于凝胶中，在通电条件下进行琼脂扩散后与特定抗体结合后发生沉淀。具体包括对流免疫电泳和火箭电泳等技术，其中后者的灵敏度较高，在鸡蛋、牛奶、意大利面食和荞麦等食品中均有应用。对于免疫印迹来说，也被称为酶联免疫电转移印斑法，是将高分辨率的凝胶电泳和免疫化学分析相结合的一种杂交技术，经过凝胶电泳分离的蛋白类食品过敏原被转移到固相载体上（通常是硝酸纤维素膜），先与对应抗体发生免疫反应，反应产物再与酶或同位素标记的第二抗体结合，经过底物显色或放射自显影后即可对样品中的过敏原进行检测，具有经济性和灵敏度高的特点。
食品过敏原物质种类
过敏原种类列表 食品安全性（Food Safety）是食品质量最重要的组成部分。1996年世界卫生组织定义食品安全性为“食品按其原定用途进行制造和（或）使用时不会使消费者受害的一种担保”。我国有关专家认为食品安全性应该是“食品中不应含有可能损害或威胁人体健康的有毒、有害物质或因素，从而导致消费者急性或慢性毒害或感染疾病，或产生危及消费者及其后代健康的隐患”。从理论上看，食品安全性包含绝对安全性和相对安全性两种概念。所以，一种食品是否安全，取决于食品本身，取决于其制造、食用方式是否合理，食用数量是否适当，还取决于消费者自身的一些内在条件。 大多数人都经历过不良的食品反应，但只有少数人（大约8%的婴儿和2%的成人）产生过强烈的因食品蛋白质引起的过敏反应。 1.食品过敏原种类及造成的危害 对食品安全性的正确理解与毒性概念及其相应的风险概念分不开。毒性是指物质在任何条件下对有机体产生任何种类（慢性或急性）损害或伤害的一种能力。所以，评价一种食品或其成分是否具有安全性主要是看其是否会造成实际的危害。 目前大约有160多种食品含有可以导致过敏反应的食品过敏原，常见的食品有：奶（牛奶、山羊奶等），树果（杏仁、胡桃、山核桃、榛子和腰果等），菜籽（葵花籽、芝麻等），豆类（花生、大豆、豌豆、蚕豆等），蛋类，巧克力，香辛料，鲜果，海产品（虾、贝壳类）等。可详见附录A、附录B。 食品过敏原产生的过敏反应包括呼吸系统、肠胃系统、中枢神经系统、皮肤、肌肉和骨骼等不同形式的临床症状，有时可能产生过敏性休克（Anaphylactic Shock），甚至危及生命。当摄入了有关的食物，其中的食品过敏原可能导致一系列的过敏反应。过敏反应通常会在一个小时内出现，症状明显，有时表现得会较激烈，包括诸如呕吐，腹泻，呼吸困难，嘴唇、舌头或咽喉肿胀，血压骤降等。而因食品产生的敏感或不适反应却可能在几小时内，甚至几天后才会发生，主要的症状有：湿疹，胃肠不适综合症，偏头痛，麻疹，鼻炎，全身乏力，哮喘，关节炎，疼痛，儿童多动症等。 2. 过敏原列表的准则 虽然普遍认为几乎每一种食品或食品原料都有至少导致一个人不良反应潜在可能性，但只有一小部分物质会导致严重的危及生命的反应。用来描述这些物质的准则如下：1〕具可信度的出版物上刊载的严重的危及生命的案例 2〕此类反应的多份独立的报告 3〕此类反应的清楚的科学证据，连同食品过敏领域有经验专家对该反应进行的口头验证。 4〕至少两个独立的，公认的科学家通过对相关科学数据的分析对危及生命的可能性的科学论断。
食品过敏源识别及其检测
食品过敏源识别和控制 一、过敏源定义 食品过敏原是指食物中能够引起机体免疫系统异常反应的成分，在医学上属于一种变态反应；食物过敏原一般为相对分子质量10000～70000的蛋白质或糖蛋白。 二、各国对过敏源的识别 1、含麸质蛋白的谷类及制品：包括小麦、黑麦、大麦、燕麦，或其杂交品系和制品 2、甲壳类及其制品：蟹、虾、龙虾 3、蛋类及其制品：鸡蛋、鸭蛋
4、花生及其制品：花生 5、乳及其制品：牛奶、乳糖 6、坚果及其制品：杏仁、腰果、胡桃、板粟、美洲山核桃、开心果 7、大豆及其制品：大豆 8、鱼类及其制品：鲈鱼、鳕鱼、比目鱼 9、芹菜及其制品：芹菜 10、荠菜及其制品：荠菜 11、芝麻及其制品：黑芝麻、白芝麻 12、羽扇豆及其制品：羽扇豆（鲁冰花） 13、软体动物及其制品：牡蛎、蜗牛、鲍鱼 14、二氧化硫或者亚硫酸盐（10ppm） 四、过敏源控制 风险控制要从源头即供应商开始，并贯彻于生产和销售的全过程中，重点应集中在法律法规的识别，标签、标示的管理，交叉污染的防止以及建立无过敏源的清洁规范等方面。 1、有意添加及潜在交叉污染的控制：导致交叉污染的原因 a收购原料前后的交叉接触；b错误的配方；c交叉接触；d存储条件差；e共享生产设备；f原料粉尘的污染；g与返工材料一起进行加工；h人为过失。 2、风险识别：a确认存在过敏原的原料；b确定各个加工环节可能存在的过敏原；c明确存在交叉污染的环节；d明确标签问题。 3、确定12个关键环节：a审核供应商，b原料验收；c确定消费群；d环境卫生；e HACCP 计划；f企业员工安全意识；g反工环节；h重新配方；i产品研发；j标识；k工程及维护；l措施计划 五、过敏源的常见检测 1、基于过敏蛋白的免疫学检测； 酶联免疫吸附技术（ELISA），又简称酶标法 两种试验方法（RAST/EAST） 免疫层析技术 免疫传感器检测技术 2、基于DNA的检测方法 聚合酶链式反应技术（PCR）
食品过敏原的相关规定
食品过敏原的相关规定 随着人们对食品安全越来越重视，食品过敏原一词已不在新鲜。我们集团的食品公司、酒店面对的是国际化的客户，过敏原的了解与控制显得尤为重要。 我国关于过敏原的相关规定有GB/T23779-2009《预包装食品中的致敏原成分》、GB7718-2011《预包装食品标签通则》，对过敏原的种类及标签标示做出了明确的规定。 在GB7718-2011的4.4.3条款中规定,以下食品及其制品可能导致过敏反应，如果用作配料，宜在配料表中使用易辨识的名称，或在配料表邻近位置加以提示：a）含有麸质的谷物及其制品（如小麦、黑麦、大麦、燕麦、斯佩耳特小麦或它们的杂交品系）； b）甲壳纲类动物及其制品（如虾、龙虾、蟹等）； c）鱼类及其制品； d）蛋类及其制品； e）花生及其制品； f）大豆及其制品； g）乳及乳制品（包括乳糖）； h）坚果及其果仁类制品。 在不同的国家对食品过敏原种类的定义有所差异： 1、在欧盟2003/89/EC指令中食品过敏原除了我国的八大类，还包括：芹菜及其制品；芥末及其制品；芝麻及其制品；二氧化硫和浓度大于每公斤10克的亚硫酸盐。 2、美国《2004年食品过敏源标识和消费者保护法规》中规定：对于鱼类、甲壳贝类、树坚果三类食品必须标注具体的食品名称。食品过敏源应标注在成分表之后或附近，标注的大小与成分表相同；或者在成分表的相关食品过敏源处用括号标出。例外情况除外。如果违反《法规》要求，对于公司和其管理者将受到民事制裁或刑事处罚，或两者并罚。对于不符合要求的产品将进行扣留。对于含有未声明过敏原的产品，美国FDA可能会要求产品召回。 3、日本对食品标签的要求非常严格，明确提出对于导致食物过敏的成分必须明示。日本在修订后的《食品卫生法》中规定了对鸡蛋、牛奶、小麦、荞麦、花生等五种食物为原料的加工食品和添加物，必须在容器和包装上注明所含的过敏性物质，推荐过敏物质 20种，这包括：鲍鱼、鱿鱼、鲑鱼卵、虾、柑桔、蟹、猕猴桃、牛肉、核桃、鲑鱼、鲛鱼、大豆、鸡肉、猪肉、松菇、桃子、山药、苹果、胶冻、香蕉。
10种常见过敏原
10种常见过敏原 揭开过敏原的面纱 大约20%的美国人有过敏反应。过敏是一种免疫系统异常反应。机体对正常情况下无害的物质如花粉、动物皮屑或食物启动防御反应。任何东西都可能引发过敏反应，从轻微扰人的症状到突然甚至危及生命的反应。以下列举了10种常见的过敏反应。 花粉 树、草和杂草中的花粉可以引发花粉热或季节性过敏。你可能会有像打喷嚏、流鼻涕、鼻塞,发痒,流泪等症状。治疗方法包括直接销售产品、处方药,和过敏疫苗注射。防止症状包括花粉含量高的有风日子里待在室内，关闭窗口，打开空调。 图中所示是放大的向日葵花粉
动物皮屑 动物皮肤油腺分泌和存在于唾液中的蛋白质对某些人来说可以引起过敏反应。过敏可能需要两年或两年以上的发展时间，其症状可能在远离动物的几个月后仍不能去除。如果你的爱宠会引发过敏，保证你的卧室别让宠物进入，避免地毯，并经常给宠物洗澡。高效过滤器和惯用吸尘器能派上用场。过敏针也可能有效。 尘螨 尘螨是生活在室内尘土里的微生物，它们生长在高湿度的环境中，生长在人或宠物身上死皮中，还有花粉、细菌和真菌中。给床垫、枕头、弹簧床垫加罩盖，使用低过敏原的枕头，每周用热水清洗被单，及时清理毛绒动物玩具、窗帘和地毯上的灰尘。
虫叮 虫叮引发的过敏反应可能有严重甚至危及生命的反应。症状包括过度的肿胀，叮咬处持续一周或一周以上发红，恶心，疲劳和低热。极少数情况下昆虫叮咬引发严重反应（过敏性反应），症状包括呼吸困难、脸部、喉咙或嘴肿胀，心跳加速，瘙痒皮疹或荨麻疹，头晕或者血压急剧下降。如果你的反应严重，应该在被叮咬后及时注入肾上腺素。过敏疫苗也被推荐用于防止某些叮咬引发的反应。 霉菌 霉菌也可以作为过敏原，刺激物，在某些情况下还是潜在的有毒物质。吸入或接触霉菌（如放大图所示）或霉菌孢子对某些人来说可能会引起过敏反应。霉菌种类很多，它们都需要潮湿的环境生长。在潮湿的地下室和卫生间等区域和草地及覆盖物中可以发现它们。应尽量避免如扫落叶等引发过敏反应的活动和家里潮湿通风的地方。