诱导型一氧化氮合酶与疾病_章丹丹
鼎国小鼠诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)说明书
小鼠诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定小鼠血清，血浆及相关液体样本中诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)水平。用纯化的小鼠诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)，再与HRP标记的iNOS抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中小鼠诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)浓度。 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/
分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备 用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标 准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为480 pg/ml ，320pg/ml ，160 pg/ml，80 pg/ml ，40 pg/ml）。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样 品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 注意事项： 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计
小鼠肾脏发生发育中神经型一氧化氮合酶的定量分析(一)
小鼠肾脏发生发育中神经型一氧化氮合酶的定量分析(一) 作者：刘霞包翠芬张晓明穆长征 【摘要】目的：对生后小鼠肾脏发生发育不同阶段中神经型一氧化氮合酶（nNOS)的表达进行定量分析，探讨nNOS在小鼠生后肾脏发育中的意义。方法：分别取新生（出生小于2h）、生后3、5、7、14、40天昆明小鼠各8只，共6组,用免疫印迹技术和光密度分析方法对各组小鼠生后肾神经型一氧化氮合酶进行定量检测，以测得的一氧化氮合酶最大量为1(100%),计算蛋白相对含量，SPSS10.0统计软件包统计分析。结果：新生组酶含量最高为100%,随年龄增长酶含量逐渐减少，至成年达到最低水平为44.8±2.4%。结论：这一趋势表明nNOS可能在小鼠生后肾脏发育的早期阶段起重要调节作用。 【关键词】小鼠;肾;神经型一氧化氮合酶 一氧化氮（NO）作为体内重要的信使分子和效应分子，在调节肾脏血流动力学方面具有重要的作用。肾脏中的NO主要由一氧化氮合酶（NOS）催化产生。NOS有三个亚型，即神经型一氧化氮合酶(nNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)〔1〕。目前对肾发生发育过程中NO和NOS的研究还刚刚起步,本实验通过定量方法检测生后小鼠的发生发育不同阶段nNOS的含量，旨在探讨nNOS在小鼠肾脏发生发育中的意义。 1材料和方法 1.1实验动物与分组
成年健康昆明小鼠（辽宁医学院实验动物中心提供）。根据小鼠孕程确认仔鼠出生时间,取新生（小于2h）、3、5、7、14、40天小鼠各8只，共6组。 1.2主要试剂 nNOS兔抗鼠多克隆抗体（北京中杉公司）；细胞裂解液、丙稀酰胺、N，亚甲基双丙稀酰胺、甘氨酸、Tween20、、Trisbase、SDS和PVDF膜（SIGMA公司）。 1.3Westernblot步骤 各组小鼠麻醉后剖腹取右肾,PBS冲洗,迅速置于液氮冷冻,-70℃冰箱保存。取冷冻肾组织,加入3倍体积的细胞裂解液,0℃下剪碎、匀浆,将组织匀浆液静置30min,4℃,12000rpm离心10min,留取上清液。用Bradford 法测定蛋白含量,分装成每离心管中含10μg蛋白,-20℃冰箱保存。 配制10%分离胶和5%浓缩胶,取10μg(30μl)肾组织蛋白细胞裂解上清液,加入10μlSDS样品缓冲液,100℃加热3min,离心。取上述裂解液加入电泳胶样品槽,100V电压下电泳,待样品到达合适位置,停止电泳，将胶板取下,转膜液洗涤10～30min。将胶与0.45μmPVDF膜(用前置于甲醇内浸透5min左右，再放入转膜液中至少5min)置于厚滤纸(已用转膜液浸泡)之间,赶尽气泡,常温下半干转印,转印完成后将PVDF膜用 溶液)冲洗,5%脱脂奶粉溶液室温封闭1～2h。与一抗(兔抗小鼠nNOS抗体,稀释度为1∶400)4℃孵育过夜,TBST洗脱3次,每次至少5min；再与二抗(碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体,稀释
小鼠一氧化氮合成酶(NOS)说明书
小鼠小鼠一氧化氮合成酶一氧化氮合成酶一氧化氮合成酶(NOS)(NOS)(NOS)酶联免疫酶联免疫酶联免疫分析分析分析 试剂试剂盒使用说明书盒使用说明书盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围检测范围：： 96T 1μmol/L - 32μmol/L 使用目的使用目的：： 本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中一氧化氮合成酶(NOS)含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠一氧化氮合成酶(NOS)水平。用纯化的小鼠一氧化氮合成酶(NOS)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入一氧化氮合成酶(NOS)，再与HRP 标记的一氧化氮合成酶(NOS)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的一氧化氮合成酶(NOS)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），通过标准曲线计算样品中小鼠一氧化氮合成酶(NOS)浓度。 试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液 20ml ×1瓶 7 终止液 6ml ×1瓶 2 酶标试剂 6ml ×1瓶 8 标准品（64μmol/L ） 0.5ml ×1瓶 3 酶标包被板 12孔×8条 9 标准品稀释液 1.5ml ×1瓶 4 样品稀释液 6ml ×1瓶 10 说明书 1份 5 显色剂A 液 6ml ×1瓶 11 封板膜 2张 6 显色剂B 液 6ml ×1/瓶 12 密封袋 1个 标本标本要求要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP ）活性。 操作步骤 1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。 32μmol/L 5号标准品 150μl 的原倍标准品加入150μl 标准品稀释液 16μmol/L 4号标准品 150μl 的5号标准品加入150μl 标准品稀释液 8μmol/L 3号标准品 150μl 的4号标准品加入150μl 标准品稀释液 4μmol/L 2号标准品 150μl 的3号标准品加入150μl 标准品稀释液 2μmol/L 1号标准品 150μl 的2号标准品加入150μl 标准品稀释液 2. 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、
一氧化氮对人体作用
一氧化氮对人体的七个作用 一氧化氮与血压调节 1、为什么血压会升高 为了理解高血压的机制，可以把它想象为一个末端带有喷嘴的水管。有两种方法可以提高水的压力：可以打开水龙头并通过水管泵出更多的税，也可以拧紧喷嘴以提高水流的阻力。血压的作用原理与这种方式相似，血压取决于心脏泵血的力量、全身的血管容量以及血管的阻力。收缩动脉使血流受阻从而导致血压升高，相反，如果动脉舒张管径变宽，血液就更容易流动，血压则下降。 2、高血压的危险性 高血压的危害主要表现在为靶器官的损伤，如果心脑肾致命损害。长期的高血压弱得不到有效改善，心脏就会因过度劳累而代偿性肥厚扩大，进而出现功能衰退，这就是是高血压性心脏病，心力衰竭;同理，管道内压力过高，脆弱硬化部分的管道就很容易爆裂，发生在脑血管，就是出血行脑卒中;同样，肾脏是极丰富的毛细血管网，这种微细血管网排除身体内读物的功能受损，体内有毒物质贮留与血内，即策划过难为肾功能衰竭、尿毒症。高血压若得不到及时的有效的控制，心、脑、肾三个重要的生命器官就会受到致命打击，从而产生严重的并发症，诸如：心：高血压性心脏病、冠心病、心力衰竭;脑：高血压性脑出血、脑梗塞;肾：肾功能衰竭、尿毒症。 而医学界众所周知，这些问题是可以在发现高血压之初进行预防的，而且是行之有效的，但当这些问题发生后，对以上或病人及家属来讲，不论是从所花费的精力、财力、体力上都将是徒劳而无益的。 如果您和2.7亿人一样已经患有高血压，发生心脑血管病的危险将是正常人的7倍以上。 3、一氧化氮如何降低血压 早期高血压没有明显症状，可能表现不出来。由于受损的内皮细胞不能产生足量的一氧化氮，一氧化氮缺乏导致了一系列心脑血管病，使血压更高、动脉硬化更严重，进入了恶性循环。与体内其他任何因素相比，一氧化氮能更好地舒张血管平滑肌(降低血管的阻力)，随着平滑肌的舒张，血管扩张血流更童话已通过，从而降低血压的目的。 二、一氧化氮与糖尿病 1、什么是糖尿病 糖尿病病主要是由于体内胰岛素绝对或相对分泌不足而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列絮乱综合症，临床上以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮，多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状。糖尿病分Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病。在糖尿病患者中，Ⅱ型糖尿病所占的比例月为95%。现代医学研究证明Ⅱ型糖尿病人的主要病因是因为胰岛素抵抗(氧化应激)，即胰岛素对血糖代谢的敏感度不够，不能正常的代谢血糖 2、糖尿病的危害 糖尿病并不可怕，可怕的是有血糖偏高引起的一系列并发症，如：心血管病变、脑血管病变、肾脏病变、神经病变、视网膜病变、糖尿病足等。糖尿病病人中75%的人患上了心脑血管病变，患病10年以上的人群中，80%最终死于肾脏衰竭，几乎所有人的糖尿病人都与不同程度的视网膜病变及神经病变。糖尿病将是21世纪比癌症还要恐怖的、严重威胁人类健康的慢性病! 3、一氧化氮对糖尿病的重要作用 一氧化氮能够降低胰岛素抵抗力，提升胰岛素对血糖的敏感度，从而加快体内血糖的代谢;另一方面，一氧化氮能够修复血管内皮细胞，降低因糖质代谢而引发的血管、神经病变，从根本上抑制及改善糖尿病并发症。最后一氧化氮还能够清楚体内的自由基，提示胰岛素受受体敏感度，更好的祈祷代谢血糖的作用 三、一氧化氮与性功能 1、性功能障碍的原因 正常的男子的性功能包括性欲、阴茎勃起、性高潮、射精和性满足等环节，如果其中任何渔歌环节发生问题二医学性生活的完善，医学上称之为性功能障碍。而女性的性功能障碍主要表现为性欲冷淡，性高潮缺乏及阴道痉挛，性生活异常疼痛与性生活障碍。 从医学来说肾动脉硬化会引起肾血流量的减少，引起肾功能障碍，影响性功能。从医学的观念来讲，肾藏精，主生殖，肾所藏之元阴和元阳是人身的根本，人体的各种生理活动，特别是性及生殖活动都由肾
内皮型一氧化氮合酶脱偶联的研究进展
Therapeuti c effects of a sp i r i n and m echan is m s of a sp i r i n resist ance HUA Yi2nan,X I E Mei2lin (D ept of Phar m acology,M edical School of Suzhou U niversity,Suzhou 215123,China) Abstract:A s p irin is one of the maj or drugs used f or p reventing ather othr ombotic vascular diseases,but not effective t o all patients or s o2called as p irin resistance. However,the mechanis m s of this resistance still re2 mains t o be elucidated.The recent p r ogresses is re2vie wed in the therapeatic effect of as p irin and mecha2 nis m s of the drug resistance. Key word:as p irin;as p irin resistance;thr ombosis; p latelet;mechanis m 内皮型一氧化氮合酶脱偶联的研究进展郑建普1,卞 卡1,2,3,可 燕1,2,Murad Ferid1,3 (1.上海中医药大学穆拉德中药现代化研究中心,上海 201203;2.上海高校一氧化氮与炎症医学研究院,上海 201203;3.美国德克萨斯大学休斯顿医学院综合生物及药理学系,德克萨斯大学分子医学研究所,休斯顿 T X77030) 中国图书分类号:R205;R28911;R345144;R5431023; R7431023;R91613;R97713;R97714 文献标识码:A文章编号:1001-1978(2006)06-0659-05摘要:血管内皮功能障碍(endothelial dysfuncti on)是多种心脑血管疾病的共同病理机制,其突出表现为内皮依赖性血管舒张功能障碍,主要由NO减少及氧自由基增加所致。最新研究发现,内皮型一氧化氮合酶脱偶联(e NOS uncoup ling)是导致NO水平下降和氧自由基水平升高的重要机制,是高血压、糖尿病、动脉粥样硬化等疾病中内皮功能障碍的重要原因。通过纠正e NOS脱偶联可有效改善内皮功能,有望为保护血管内皮功能提供有效途径。 关键词:e NOS脱偶联;内皮功能障碍;一氧化氮;氧化应激;四氢生物蝶呤 血管内皮细胞(vascular endothelial cells, VECs)是分布于所有血管内侧的单层纵向细胞,在调节血管舒缩状态、凝血和纤溶,防止有害脂蛋白浸 收稿日期:2006-02-22,修回日期:2006-04-16 基金项目:上海市教委高校一氧化氮与炎症医学E研究院计划资助项目(No E204010);上海市教委重点科研资助项目(No 05ZZ11);上海市科委基础研究重点资助项目(No 05JC14056) 作者简介:郑建普(1979-),男,博士生,研究方向:心血管药理学与炎症医学,Tel:021*********,E2mail:je mpoo.tseng@ g https://www.wendangku.net/doc/485526858.html,; 卞 卡(1958-),男,教授,博士生导师,研究方向:心脑 血管药理学与炎症医学,通讯作者,Tel:021*********,E2 mail:Ka.B ian@uth.t m https://www.wendangku.net/doc/485526858.html, 润及氧自由基损伤等方面起重要作用。大量实验研究证明,正常的血管内环境是抵御心血管疾病的基础防线,内皮细胞的健康与否直接关系到血管内环境的稳定,而一氧化氮(nitric oxide,NO)信息系统的健全又是内皮细胞发挥生理作用的关键。正常生理条件下,血管系统中的NO主要源于内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS),发挥扩张血管、调节血压、抑制血小板聚集、抗平滑肌细胞增殖等作用[1]。近年来,大量的基础及临床资料进一步证实,在诸如高血压、动脉粥样硬化、充血性心力衰竭、糖尿病及长期吸烟等病理情况下, e NOS出现功能障碍,此时e NOS不再生成NO而是产生超氧阴离子,造成NO生物利用度降低及氧化应激(oxidative stress)增加,导致或加重内皮功能障碍,该现象被称为e NOS脱偶联(e NOS uncoup2 ling)[2,3]。 1 eN O S脱偶联的产生机制 e NOS脱偶联的产生机制主要有:①NO生成底物L2精氨酸(L2arginine,L2A rg)不足,使本应转移到L2A rg的电子转移到O2从而产生超氧阴离子(O? 2 );②NO生成的重要辅助因子四氢生物蝶呤 (tetrahydr obi op terin,BH4)供应不足,导致主要的终 产物是O? 2 ,而不是NO;③氧化应激使e NOS结构发生改变从而导致活性下降。 1.1 L2Arg与eN O S脱偶联 L2A rg是人体的半必需氨基酸之一,也是NO合成的底物。L2A rg在生理 浓度下,电子由NADPH转移到F AD,生成F ADH 2 , ? 9 5 6 ? 中国药理学通报 Chinese Phar m acological B ulletin 2006Jun;22(6):659～63
人一氧化氮合成酶(NOS)elisa试剂盒使用说明书
人一氧化氮合成酶(NOS)elisa试剂盒使用说明书 Elisa kit规格：48孔配置/96孔配置 标准品稀释液：1.5ml×1瓶 酶标试剂：3 ml×1瓶（48）/6 ml×1瓶（96） 【人一氧化氮合成酶(NOS)elisa试剂盒】本试剂仅供研究使用 计算： 以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 试剂盒组成： 封板膜:2片（48）/2片（96） 说明书:1份 密封袋:1个 标准品：2700ng/L 0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存 酶标包被板: 1×48 1×96 2-8℃保存 样品稀释液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存 显色剂A液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存 显色剂B液: 3ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存 终止液: 3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存 浓缩洗涤液:（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人一氧化氮合成酶(NOS)水平。用纯化的人一氧化氮合成酶(NOS)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入一氧化氮合成酶(NOS)，再与HRP标记的一氧化氮合成酶(NOS)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的一氧化氮合成酶(NOS)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人一氧化氮合成酶(NOS)浓度。 目的：本试剂盒用于测人血清，血浆及相关液体样本中一氧化氮合成酶(NOS)的含量。 服务承诺： 供货期：款到发货。 工作时间内免费的技术咨询和指导。请来电咨询 为客户提供来样检测服务，最大限度实验结果的有效性(免费代测)。 保存条件及有效期： 试剂盒保存：2-8℃| 有效期：6个月 【人一氧化氮合成酶(NOS)elisa试剂盒】样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
一氧化氮及其合酶在杀伤肿瘤细胞中的作用(一)
一氧化氮及其合酶在杀伤肿瘤细胞中的作用(一) 关键词：巨噬细胞肺泡一氧化氮合酶肿瘤活化的巨噬细胞(M)在抗肿瘤过程中具有十分重要的意义。一氧化氮(NO)作为活化的M的细胞毒效应分子之一，在杀伤肿瘤效应中起重要作用〔1〕。本研究通过测定肺M内诱导型一氧化氮合酶（iNOS）及其产物NO水平，并应用特异性NOS抑制剂来观察肺M对肿瘤细胞杀伤作用的影响，旨在探讨肺MNOS 活性与肿瘤杀伤力之间的关系，以阐明肺M在抗肿瘤免疫中的地位。1材料和方法 1.1肺M的制备及培养体质量20～25g的纯种C57雄性小鼠32只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,随机分成实验组和对照组，每组16只，均经腹腔注入2%戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉放血处死,暴露颈部气管后,用37℃生理盐水进行支气管肺泡灌洗,每次1ml,共15次。将回收的灌洗液以1500r/min离心10min,弃上清,用含10%小牛血清的最低必需培养液(MEM)配成1×106个/ml的细胞悬液。将细胞悬液接种于96孔板中,37℃,5%CO2培养2h,洗去未贴壁细胞,根据需要分别加入不同剂量(50，100，150，200U/ml)的干扰素γ（INFγ）,继续培养24h。 1.2肿瘤细胞培养上清液的收集将无菌取得的肥大细胞肿瘤细胞P815(上海肿瘤研究所提供)以5×105个/ml的密度培养在RPMI1640培养液中,置37℃,5%CO2培养箱培养48h,2500r/min离心20min,取上清液,置-20℃保存待用。 1.3iNOS活性测定用Smith薄层层析法〔2〕测定上清液培养标本中瓜氨
酸(citrulline)的生成量，以此反映iNOS的活性。 1.4NO测定10mmol/L硼酸钠溶液系列稀释10mmol/L亚硝酸钠，测定其相应于波长为545nm时的光密度(D)值,作曲线,并得出直线回归方程式〔3〕。取上清培养液，加入等量的Greiss试剂（1%磺胺、0.1%萘乙二胺、 2.5%磷酸),室温放置10min，545nm比色，根据直线回归方程计算出NO含量。 1.5肺M肿瘤杀伤活性测定在培养板内加入肺M悬液100μl/孔，实验组再加入2mmol/LNG单甲基左旋精氨酸（L-NMMA，Sigma公司），50μl/孔，置37℃，5%CO2培养箱培养4h，再加入含10%P815上清液的营养液100μl/孔，置37℃,5％CO2培养72h。每孔加二甲基亚砜(DMSO)100μl,混匀静置20min,在PG-3022酶联仪上用570nm波长测定D值,计算肿瘤细胞生长抑制率。 1.6统计学处理所有数据采用X±s表示，组间显著性检验用配对资料t 检验，各指标进行直线相关分析。 2结果 2.1不同剂量INFγ对肺M产生NO的影响不同剂量的INFγ与活化的肺M共同培养24h后,培养液中NO含量随着INFγ剂量的增加而升高(图1),且呈明显的剂量依赖关系(r=0.985,t=19.89,P＜0.01)。 图1INFγ对肺巨噬细胞NO产生和iNOS活性的影响 fig1TheeffectofINFγonNOproductionand activityofiNOSbymacrophages
美国好时威一氧化氮胶囊与心脑血管疾病
美国好时威一氧化氮胶囊与心脑血管疾病 心脑血管疾病 元气理论是中医学理论体系中重要的组成部分，自《内经》首倡保养真气在防病治病中的主导作用以来，经过历代医家的继承发扬，元气理论日臻完善，有效地指导着临床，在医疗实践中发挥着重要的作用。 临床常见的心脑血管疾病包括冠心病心绞痛、心肌梗死、各种心律失常、慢性充血性心衰、缺血性脑血管病和出血性脑血管病等，随着社会的进步，生活质量的提高，人们饮食结构的改变使这些心脑血管疾病的发病率呈上升趋势。 现代医学认为心脑血管疾病病变的实质是血管栓塞、狭窄、破裂等，导致心脑组织缺血，心脑细胞受损死亡。传统治疗心脑血管疾病往往只针对一点，如扩张血管，溶解血栓等，这些药物虽能在一定程度上缓解病情，但只是解决了其中的一个方面。而心脑血管的发生非常复杂，一对一、单靶点的治疗远远无法满足需要。与此相反，中医理论强调，治病必求于本，认为在治疗过程中，要探求疾病的根本原因，采取一对多、作用多靶点的治疗方式，即针对疾病根本原因确定正确的治本方法。培补元气法便是这一理论的体现。 元气是维护人体生命活动所必需的精微物质，是推动人体脏腑组织机能活动的动力，它既是物质的代称，也是功能的表现。元气在人体有推陈出新、温煦脏腑、防御外邪、固摄精血等重要职能。“人之有生，全赖此气”。元气充足，运行正常，则人可度百岁而去;反之，元气不足，或升降出入失常，则百病皆生，可引发多器官多系统功能失调，其中以心脑血管系统功能紊乱最为多见。 中医理论认为，心脑血管疾病是指由于元气亏耗不足，五脏气血阴阳失调，加之忧思恼怒，或饮酒饱食，或房事劳累，或外邪侵袭等诱因，以致气血不能濡养心脑;或由于元气亏耗，痰浊、瘀血、水饮等病理产物随之而生，引起心脑功能失常和病理变化的一类病症。其本为元气亏耗，气血不足，阴阳亏损，其标是气滞、血瘀、痰浊、水饮，临床表现多为虚实夹杂，可出现胸闷、心悸、心绞痛等心血管症状以及头晕头疼、记忆力减退、感觉和运动障碍等脑血管症状。 值得注意的是，元气的虚衰不足，可导致痰浊、瘀血、水饮等病理产物的产生，继而引发心脑血管系统功能的紊乱，其中以瘀血最为重要。气为血帅，血为气母，气行血行，气虚血瘀。元气充足，心脏泵血有力，血流畅通;元气亏耗不足，鼓动心脏搏动和血液流动的动力不足，就会形成瘀血，这就是中医所讲的心脑血管疾病发病的原因。清代医家王清任特别强调气虚与血瘀的病理转归，在其著作《医林改错》中就提到“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀。”
巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶来源的 N O
PEG 10mRNA 的抑制作用最强,表明靶mRNA 的 二级结构对siRNA 的功能有很大影响。 本研究中我们构建针对PEG 10基因的siRNA 真核表达载体,并通过酶切鉴定和测序鉴定,说明我们构建的针对PEG 10的真核表达载体是正确有效的,可以用于后续PEG 10基因功能的研究,以及沉默PEG 10后抑制肝癌细胞生长,诱导肝癌细胞凋亡,从而为肝癌的基因治疗提供理论依据和实验工具。 参考文献: [1] Ryuichi Ono ,Shin K obayashi ,Hirotaka Wagat suma ,et al.A retrotransposon 2derived gene ,PEG 10,is a novel imprinted gene located on human chromosome 7q 21[J ]. Genomics , 2001,73(2):2322237. [2] Noble A ,Towne C ,Chopin L ,et al.Insulin 2like growt h fac 2 tor 2Ⅱbound to vitronectin enhances MCF 27breast cancer cell migration[J ].Endocrinology ,2003,144(6):241722424.[3] Moorehead RA ,Sanchez O H ,Baldwin RM ,et al.Transgenic overexpression of IGF 2Ⅱindues spontaneous lung tumors :a model for human lung adenocarcinoma [J ].Oncogene ,2003, 22(6):8532857. [4] Vella V ,Sciacca L ,Pandini G ,et al.The IGF system in t hy 2 roid cancer :new concept s[J ].Mol Pat hol ,2001,54(3):1212 124. [5] Tsou AP ,Chuang YC ,Su J Y ,et al.Overexpression of a no 2 vel imprinted gene ,PEG 10,in human hepatocellular carcino 2ma and in regenerating mouse livers [J ].J Biomed Sci ,2003, 10(6Pt 1):6252635. [6] Hiroshi Okabe ,Seiji Satoh ,Y oichi Furukawa ,et al.Involve 2 ment of PEG 10in human hepatocellular carcinogenesis t hrough interaction wit h SIA H 1[J ].Cancer Research ,2003,63(12): 304323048. [7] 常莹,陶璐薇,陈孝平,等.肝癌组织中遗传印记基因PEG 10 表达的特异性及其意义[J ].世界华人消化杂志,2005,13 (12):140821411. [8] Naito Y ,Yamada T ,Ui 2Tei K ,et al.siDirect :highly effec 2 tive ,target 2specific siRNA design software for mammalian RNA interference [J ].Nucleic Acids Res ,2004,32:W 1242 129. [9] Reynolds A ,Leake D ,Boese Q ,et al.Rational siRNA design for RNA interference[J ].Nat Biotechnol ,2004,22(3):3262 330. [编辑:刘红武] 收稿日期:2006202221;修回日期:2006204214基金项目:怀化市科技计划资助项目(0502) 作者单位:1.418000湖南怀化医学高等专科学校检验 系;2.中国科学院生物物理研究所结构与分子生物学研究 中心作者简介:张申(1955-),男,学士,教授,主要从事自由 基生物学研究 巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶来源的NO 对共培养HL 60细胞凋亡的影响 张 申1,尹利华1,卫涛涛2 E ffects of Inducible Nitric Oxide Synthase Derived Nitric Oxide on Apoptosis of H L 60Cells Co 2cultured with RAW 264.7Macrophages ZHAN G Shen 1,YIN Li 2hua 1,WEI Tao 2tao 2 1.De partment of L aboratory Medicine ,H uai hua Medical College ,H uai hua 418000,China; 2.Center f or S t ructural and Molecular B iology ,I nstitute of B iophysics ,Chinese A cadem y of Sciences Abstract :Objective To study effects of inducible nitric oxide synthase (iNOS )2derived nitric oxide (NO )on apoptosis of HL 60cells co 2cultured with RAW 264.7macrophages.Methods Upon stimulation with lipopolysaccharide (L PS )and interferon 2 γ(IFN 2γ),inducible nitric oxide synthase gene was expressed in RAW 264.7macrophages ,which caused the consequent generation of nitric oxide.Effects of nitric oxide on HL 60cells viability ,expression of bcl 22and bax protein ,activity of Caspase 23and cell apoptosis were evaluated with M T T assay ,Western blot analysis ,fluorescence analysis ,flow cytometry (FCM ),trans 2mission electron microscopy (TEM )and DNA agarose gel electrophoresis.R esults The results showed that iNOS 2derived nitric oxide caused oxidative damage of HL 60cells co 2cultured with RAW 264.7mac 2rophages ,and decreased cell viability ,and evidently reduced expression of bcl 22and increased expression of bax ,and induced activity of caspase 23and DNA f ragmentation.Conclusion The results suggested im 2portant effect of iNOS 2derived nitric oxide on apoptosis of cells in RAW 264.7macrophages. K ey w ords : Inducible nitric oxide synthase ;Nitric oxide ;Apoptosis ;Mac 2 rophage 摘 要:目的 研究巨噬细胞中诱导型一氧化氮合酶(iN 2OS )来源的一氧化氮(NO )对共培养HL 60细胞凋亡的影响。 方法 以脂多糖(L PS )和γ2干扰素(IN F 2γ)诱导RAW 264.7巨噬细胞iNOS 基因的表达产生过量NO 为实验模型,通过
诱导型一氧化氮合酶
诱导型一氧化氮合酶(iNOS)与寄生虫感染 转载自中国科技信息网 一氧化氮(NO)在体内由L－精氨酸在一氧化氮合成酶(NOS)的催化下生成。它是一种重要的信使分子, 参与血管、气道平滑肌的调节,神经递质的传递,细胞杀伤, 肿瘤细胞的溶解及内分泌激素的释放过程, 与许多疾病的发生、发展密切相关; 既在机体多个系统多种细胞中具有广泛的生理功能，又可能参与多种疾病的发生过程。NOS是合成NO的唯一限速酶，寄生虫感染时，动物机体内由其诱发产生各种细胞因子，细胞因子激发一氧化氮合酶基因,其转录产生iNOS (inducible nitricoxide synthase)mRNA,由iNOSmRNA 指导一氧化氮合酶生成。本文就NOS的类型和iNOS的表达及NO的生成和NO对寄生虫的作用以及影响NO抗寄生虫感染的因素做一简要综述。 1 NOS的类型和iNOS的表达及NO的生成 许多研究表明,NO 是一种重要的细胞内信使和新的神经递质, 又是效应分子[1]。它介导并调节多种生理机制, 在呼吸系统、神经系统、炎症和免疫反应中起着重要的作用, 但也导致病理生理状态。由于NO 可在数种哺乳动物细胞内产生, 在体内又具有广泛的生理作用, 因而这种化学结构如此简单的小分子被美国《Science》杂志评为1992 年年度分子[2]。NOS 根据所在组织类型，在细胞中的分布，效应方式，组织表达，对Ca 2＋/钙调蛋白的依赖性及对不同激动剂的反应，可分为以下3种类型[3]: I型:神经型NOS （ncNOS )，首先于脑组织中发现，所产生的NO为神经递质，也可能作为神经和血管之间的间介物。为结构表达。Ⅱ型:可诱导型NOS (iNOS)，主要存在于单核/巨噬细胞系统、肝脏、平滑肌、神经胶质细胞中，另外在内皮细胞、神经元中也有分布。为非结构表达。Ⅲ型:上皮型NOS(ecNOS)，存在于血管内皮细胞，与ncNOS类似，为结构表达，对Ca2＋/钙调蛋白依赖，分布于胞浆中。在心脏、肠、肾、肝脏和脑等重要脏器的血流量调节以及血管舒张的局部信号机制中占有重要地位。 目前普遍认为, 与抗寄生虫感染密切相关的为iNOS, 主要存在于Mφ中, 也存在于中性粒细胞、神经小胶质细胞和肝细胞等多种细胞内, 细菌脂多糖(LPS)和多种细胞因子都可诱导其高水平表达iNOS。一旦被诱导, iNOS 接着能在相当长时间内以恒定的速度合成大量的NO。由此产生的NO 能选择性地作用于寄生虫或寄生虫感染的细胞, 在局部或全身发挥抗寄生虫作用[4]。Hibbs 等[5～7]在1987 年提出了NO的生化合成途径: 在此途径中, 细胞因子可由寄生虫感染所致。杨志伟等[8] (1999) 发现经血吸虫感染家兔, 虫卵肉芽肿周围有iNOS和巨噬细胞强阳性反应物, 虫卵肉芽肿周围聚集有巨噬细胞、肥大细胞, 并有肿瘤坏死因子TNF－α和表皮生长因子EGF 存在。龙小纯、李雍龙等[9]对小鼠感染血吸虫后不同时间的肝组织总RNA进行RT-PCR，结果表明，未感染血吸虫的小鼠肝组织iNOS的转录表达为阴性，感染后21d,肝组织出现iNOS的转录表达，提示日木血吸虫能诱导宿主肝组织iNOS的转录。还有学者发现在肺内特别是寄生虫周围的炎性组织中有高水平iNOSmRNA[10],表达iNOS基因缺陷小鼠(iNOS-鼠)感染枯氏锥虫后,其体内NO的产生明显减少,并减弱了杀锥虫能力[11]。证实iNOS是合成NO的关键酶。 2 NO抗寄生虫感染的作用机制 在寄生虫感染中,NO一方面能杀死寄生虫,起保护机体的作用,另一方面可能产生相反的作用。关于NO的抗寄生虫作用的确切机制尚不清楚,多数学者认为NO作用于寄生虫的关键代谢酶,使其失活,而发挥抗寄生虫的作用[12]。人们知道,NO与一般的生物效应分子不同,其不需与特异性受体结合,因具有脂溶性,可直接进入寄生虫体内发挥杀伤作用。NO抗寄生虫感染的作用机制可能有二种，一种是NO与寄生虫体内多种代谢酶的活性部位Fe-S基团结合形成铁-亚硝酰基复合物,造成铁离子的丧失和酶活性的抑制,致使能量的产生和DNA的合成受阻,从而干扰寄生虫的生理代谢。NO抗寄生虫作用的另一机制为通过与氧自由基作用。
一氧化氮让你远离心脑血管病
一氧化氮让你远离心脑血管病 目录 编辑本段版权信息 书名: 一氧化氮让你远离心脑血管病 作者：(美)伊格纳若 出版社：北京大学医学出版社 出版时间： 2007 ISBN: 9787810714099 定价: 20.00 元 开本：32开 装帧：平装 字数：154千字 页数：160页 编辑本段内容简介 《一氧化氮让你远离心脑血管病》中，Ignarro博士将和你一起共同分离一氧化氮养生法对心血管系统产生的益处。无需刻意高速自己的生活方式，一氧化氮养生法非常简单，它包括三个方面：服用在任何保健品商店都能买到的一氧化氮保健品，同时食用一氧化氮食品，并进行适当的锻炼。按照《一氧化氮让你远离心脑血管病》所阐述的内容开始行动，将会使心脏病、卒中和心血管疾病对你的困扰成为历史。
编辑本段作者简介 LouisJ.Ignarro博士是美国加州大学洛杉矶分校医学部著名的药理学教授，1998年因一氧化氮在心血管系统的重要发现而获得诺贝尔医学奖。Ignarro博士从哥伦比亚大学获药理学医学学士学位，从明尼苏达大学获药理学理学博士学位。 吴寿岭博士现任开滦（集团）有限责任公司医疗集团管委会主任，华北煤炭医学院附属开滦医院院长，华北煤炭医不院硕士研究生导师、教授，《高血压杂志》编委，《中国争救复苏与灾害医学杂志》常务编委。主要从事高血压发病机理及防治的研究。目前已发表医学论文20余篇，译著6部；获中国煤炭工业协会科学技术二等奖一项，河北省科技进步三等奖一项，唐山市科技进步一等奖两项。 编辑本段编辑推荐 在美国，心血管疾病影响着约6亿人的健康，是目前导致死亡的主要原因。这已成为所有美国人关注的问题。诺贝尔奖获得者路易斯J?伊格纳若 （LouisJ.Ignarro）博士30余年的研究结果《一氧化氮让你远离心脑血管病》一书向人们展示了一氧化氮可以预防甚至逆转心血管疾病——无需任何处方药物。Ignarro博士因为发现一氧化氮是机体产生的一种信号分子，它能够舒张血管从而有利于血液循环，而于1998年获得诺贝尔医学奖，Ignarro博士的这一研究发现促使了伟哥（Viagra）的研发。在该书中，他集中于一氧化氮血管系统的研究。通过舒张血管，一氧化氮可以调整血压、阻止诱发卒中和心脏病的血栓形成，并阻止血管内斑块的形成。 L-精氨酸和L-瓜氨酸在机体内生成一氧化氮的过程中发挥重要作用。一氧化氮对维持心血管系统的健康非常重要，L-瓜氨酸可增强L-精氨酸的作用，而L-精氨酸是刺激机体生成一氧化氮的重要物质。我们知道，L-瓜氨酸是一种可被血管内皮细胞吸收并转化为L-精氨酸的氨基酸，因而它可以为机体生成更多的一氧化氮提供原料。 美国好时威一氧化氮胶囊采用好时威生物药业公司所研发的专有配方，科学的原料配比，提升了受体细胞膜靶位的敏感度，消除自由基能力更强，使心康信使一氧化氮保持有效的作用浓度。专有技术，使人体吸收率可以达到95%以上，并提升第二信使跨膜转运速度，生物利用率达99%以上。 编辑本段目录 第一章：我的人生旅程从诺贝尔到诺贝尔奖 第二章：心血管系统：个人手册 第三章：一氧化氮的科学：神气分子产生的难以置信的效果 第四章：一氧化氮在人体四个重要生理过程中的作用 第五章：一氧化氮养生法：防止心血管系统老化的三个步骤 第六章：一氧化氮养生法：保健品的作用 ……