置换色谱法分离表阿霉素和阿霉素异构体的研究
收稿日期:2003-10-29
作者简介:祁 彦,女,博士,Tel:(010)85778904,E -mail:yanqi0710@si https://www.wendangku.net/doc/4a10117313.html,.
置换色谱法分离表阿霉素和阿霉素异构体的研究
祁 彦1
, 储晓刚1
, 黄骏雄
2
(1.中国进出口商品检验技术研究所,北京100025;2.中国科学院生态环境研究中心,北京100085)摘要:采用置换色谱法在K romasil KR 100-10C 18色谱柱(250m m @416mm i 1d 1,10L m)上成功地分离了二元异构体
表阿霉素和阿霉素的混合物,并研究和探讨了置换剂类型、浓度、流动相的组成及流速对分离的影响。结果表明:选用30g/L 的海胺1622为置换剂,流速012mL/min,以及在有机相比例较低的流动相中加样,而将置换剂溶解在有机相比例稍高的流动相中进行置换展开,可以达到较好的分离。在最佳分离条件下,采用置换展开方式可以在分析色谱柱上一次分离30mg 异构体的混合物。该结果充分显示了置换色谱上样量大,可充分利用高效的色谱填料、产率高、分辨率好以及溶剂消耗少等优点,适用于药物和生物制剂的制备分离。关键词:置换色谱;表阿霉素;阿霉素;异构体;制备分离
中图分类号:O 658 文献标识码:A 文章编号:1000-8713(2004)02-0106-05
Study on Se paration of Epirubicin and Doxorubicin Isome rs
by Displaceme nt Chromatography
QI Yan 1,CHU Xiaogang 1,HUANG Junxiong 2
(1.China Import &Expor t Comm odity Inspect ion T echnology Inst it ute ,Beijin g 100025,China ;
2.Resear ch Cent er for Eco -En vironm enta l Sciences,T he C hinese Aca demy of Sciences ,Beijin g 100085,China )
Abstract :Displacement chromatography was successfully used to separate,at the preparative scale,a binary isomer mixture of epirubicin and doxorubicin,which are anthracycline antitumor antibiotics,on an analytical column (Kromasil KR 100-10C 18column,250mm @416mm i 1d 1,10L m).Displacement parameters such as the type and the concentration of displacer,the composition and the flow -rate of mobile phase were investigated.The displacer employed was 30g/L benzetho -nium chloride.The flow -rate was 012mL/min.Loading of feed at lower initial organic level of mo -bile phase coupled with displacement at higher organic level was found to give efficient separation.The binary isomer mixture of 30mg was separated on the analytical column.The results have ind-i cated that displacement mode had high efficiency,greatly reduced solvent consumption in the pro -cess of purification,and offered the possibility of both high resolution and high loading.It has also demonstrated again that high performance displacement chromatography is one of the effective methods for the purification of therapeutic compounds in industrial processes.
Ke y words :displacement chromatography;epirubicin;doxorubicin;isomers;
preparative
separation
1943年,Tiselius [1]首次提出了置换色谱的概念,建立了置换色谱的理论,并在1948年首先运用置换技术以活性炭为固定相分离了糖类化合物。但是,在以后的几十年里,受低效的色谱系统及填料的限制,该技术很少再使用。直到20世纪80年代中期,随着高效液相色谱(HPLC)技术的发展和高效色谱填料的深入研究,Horvath 等[2]将置换色谱应用于生物分子的分离与纯化,才使该技术重新崛起。置换色谱是一种非线性色谱技术,是指样品输入色
谱柱后,用一种与固定相作用力极强的置换剂通入色谱柱,去替代结合在固定相表面的溶质分子。样
品在置换剂的推动下沿色谱柱前进,使样品中各组分按作用力强弱的次序,形成一系列前后相邻的谱带,并在置换剂的推动下流出色谱柱[3]。
色谱技术是药物和生物分子分离的最基本和最有效的技术之一。目前,制备规模的分离主要应用超载洗脱的方式[4]
。置换展开与超载洗脱方式相比具有上样量大、产率高、分辨率好和有机溶剂消耗
2004年3月M arch 2004
色谱
Chinese Journal of Chromatography
Vol.22No.2106~110
少的优点,同时,被分离样品在分离过程中可能自行浓缩[3]。置换色谱尤其适用于分离结构和性质极相似的物质,如外消旋体和各种异构体,并获得较高的浓度和产量[5,6]。因此,将这一技术应用于药物和生物分子的分离显得越来越重要[7]。
表阿霉素和阿霉素作为一种有效的抗生素类抗肿瘤药物,可以治疗早期及晚期的乳腺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌和肠癌等[8],它们的结构十分相似,不同的仅是糖元中C-4c羟基的空间位置。本文采用反相置换色谱法,选用海胺1622(又称氯化苄乙氧铵)作为置换剂,在常规分析柱上分离了制备量的表阿霉素和阿霉素的混合物,并对置换色谱的实验参数置换剂类型、浓度、流动相的组成及流速等对分离的影响进行了研究和探讨,实验结果充分显示了置换展开方式的优势,表明置换色谱应用于生物制剂和药品的制备分离具有广阔的前景。
1实验部分
1.1仪器与试剂
TSP高效液相色谱仪(美国TSP公司),P4000四元梯度泵,AS3000自动进样器,Focus紫外-可见二极管阵列检测器,TSP PC1000工作站(3.0版本)。所有的置换分离及流出物的分析均采用Kro-masil KR100-10C18色谱柱(250mm@416mm i1d1, 10L m,瑞典Eka Chemicals公司)。海胺1622购自Fluka公司,所用试剂为色谱纯和分析纯,实验用水由Mill-i Q装置制备。阿霉素和表阿霉素的标准品及样品由浙江海正药业有限公司提供。
1.2实验步骤
1.2.1置换分离
用流动相平衡色谱柱;将表阿霉素和阿霉素的混合物(质量比为1B1)溶解在流动相中作为样品液(以下实验中平衡色谱柱的流动相和配制样品的溶剂均一致),将样品液注入样品环;然后以012 mL/min的流速泵入置换剂溶液进行置换分离,同时分步收集流出色谱柱的流分;当置换剂的前沿突破峰出现时,分离完成,停止收集流分;用100%甲醇以115mL/min的流速冲洗20min,再生色谱柱;经起始流动相再平衡后,又可进行下一次置换分离。
1.2.2流出物分析
样品流分的分析条件:Kromasil KR100-10C18色谱柱,流动相为甲醇-水(60B40,甲酸调节pH= 214)(文中甲醇与水的比例均为体积比),流速为110mL/min,检测波长为254nm。将所收集的流分经分析定性和定量后,所得数据以流出液体积为横坐标,流分的浓度为纵坐标绘制置换分离图。2结果与讨论
2.1置换剂的选择
置换剂的选择是置换色谱能否成功地分离目标产物的关键因素之一[2,3]。理想的置换剂应是:在色谱分离过程中,置换剂对固定相的吸附力比样品中组分强,且呈现Langmuir吸附行为,其特点表现为吸附等温线处在置换组分的等温线上方;置换剂在分离过程中性质稳定,不与样品中任何组分发生反应;在所选择的流动相中有较大的溶解度;能快速地从色谱柱中去除,使色谱柱再生等。本文分别研究了乙二醇、二甲亚砜、正辛醇、十六烷基-三甲基溴化铵、柠檬酸铵、柠檬酸、甘油、异戊醇、苄基-三甲基氯化铵、海胺1622作为置换剂分离表阿霉素和阿霉素混合物的情况。实验结果表明海胺1622较为合适,它在固定相上的保留时间比样品组分长,且符合置换色谱对置换剂的其他要求;此外,以下的实验中选用海胺1622作为置换剂,也表现出了良好的置换色谱行为。
2.2置换剂浓度的选择
由置换色谱的理论可知,置换剂浓度的变化必然引起置换分离中操作线斜率的变化,从而影响整个分离结果。只有当操作线的斜率小于被分离组分等温线的起始斜率,样品才能进行置换展开,形成置换序列[3]。因此,我们首先对置换剂的浓度进行优化。分别选择12,30,50g/L的海胺1622进行置换分离,结果如下:当置换剂的质量浓度为12g/L时,即使流动相为甲醇-水(50B50,pH=214),即有机相比例高达50%的情况下,样品液中的表阿霉素和阿霉素也没有被置换,色谱峰是以洗脱展开的方式流出色谱柱;而30和50g/L的置换剂均可以较好地置换样品液(见图1)。其中,采用较低浓度置换剂展开速度慢,样品流出色谱柱所需置换剂的体积较大(见图1-a),而采用浓度较高的置换剂则正相反(见图1-b)。此外,随着置换剂浓度的增加,阿霉素和表阿霉素的流出液的浓度也随之增加,各组分的置换区带变窄,叠加增加;当采用50g/L的置换剂时,由于置换区带的叠加严重,得到的纯组分较少,使分离效率明显降低。以上实验结果均符合置换色谱的理论[2,3]。考虑到在保证较好分离的情况下,得到尽可能多的纯组分,以下实验均选用30g/L为最佳浓度。
2.3流动相组成对置换分离的影响
置换色谱的流动相又称载液(carrier),它对样品应有足够大的溶解度,以免样品液在分离过程中被逐渐浓缩,超过饱和溶解度而发生沉淀,堵塞色谱
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第2期祁彦等:置换色谱法分离表阿霉素和阿霉素异构体的研究
图1 置换剂浓度对分离的影响
Fig.1 Effects of the displace r concentration
Mo bile p hase and disp lacer solvent:methano -l w ater (40B 60,v/v,pH =214).Feed lo ad :4mg of i so mer mixture.Flo w -rate:012mL/m in.The co ncen tratio n of b enzethon ium chlo ride (d isplacer): a.30g/L;b.50g/L.do x,do xo rub icin;ep i,epiru bicin ;d ,d isplacer.
柱;流动相应有较好的化学稳定性、低粘度、低毒性,且较易和样品分离。此外,由于流动相分别是样品和置换剂的溶剂,所以,流动相中有机相的比例的微小变化即可引起置换分离的较大改变。
首先研究了流动相和置换剂的溶剂均为甲醇-水(20B 80,pH =214)(简称:20初始平衡/20置换展开,见图2-a),以及流动相和置换剂溶剂均为甲醇-水(40B 60,pH =214)(简称:40初始平衡/40置换展
开,见图2-b)对样品进行分离的情况。结果显示:随着流动相中甲醇比例的提高,分离时间明显减少;但是,流动相中较高的有机相比例也使得各样品组
分在色谱柱中的移动速度太快,选择性降低,分离效率下降;采用有机相比例较低的流动相进行分离,样品中各组分在固定相上得到了较充分的分离,分离度明显增大,且增加了流出物的浓度;但是,由于明显延长了分离时间,
使产率降低。
图2 流动相的组成对分离的影响
Fig.2 Effects of the composition of mobile phase
Feed load:811mg of isomer mixture.Flo w -r ate:0.2mL/min. a.mobile phase and displacer so lv ent:methano -l water (20B 80,p H =214).b.mob ile phase and displacer so lvent:methano-l water (40B 60,pH =214). c.mob ile phase:methano -l w ater (20B 80,pH =214);Dis -placer solvent:methano -l water (30B 70,pH =214).The concentration of displacer :30g/L.
通常,置换色谱中平衡色谱柱的流动相和置换
剂的溶剂组成均一致。然而,为了获得高产率,在保证较好的分离度的同时,还要兼顾分离时间。本文研究了流动相与置换剂的溶剂组成不同对置换分离的影响:即流动相为甲醇-水(20B 80,pH =214),置换剂的溶剂为甲醇-水(30B 70,pH =214)(简称:20初始平衡/30置换展开,见图2-c)。比较图2-c 和图2-a 可以看出,采用/20初始平衡/30置换展开0和/20初始平衡/20置换展开0方式的置换分离,两者的分
离效率没有明显差别,而前者可以缩短分离时间。
综上所述,采用有机相比例较低的流动相平衡色谱柱,然后加样,使样品各组分在固定相上的吸附能力产生较大的差别,而将置换剂溶解在有机相比例稍高的流动相中进行置换展开,不仅可以缩短置换分离所需的时间,而且可以达到较有效的分离。因此,在以下的实验中,均采用甲醇-水(20B 80,pH =214)平衡色谱柱,将置换剂溶解在甲醇-水(30B 70,pH =214)中置换展开。
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2.4 流速对置换分离的影响
置换色谱的理论认为,较低的流速可以使样品中各组分得到较好的置换分离[2,3],因此置换色谱所采用的流速一般明显低于洗脱色谱。但是,近年也有文献报道,流速并不是影响置换展开的关键因素,分别在较低的流速(011mL/min)和较高的流速(0175mL/min)下进行的置换展开并没有明显的区
别[9]
。为此,本文研究了不同的流速对二元异构体置换分离的影响,结果见图3-a,b 和图1-a 。经比较可以看出:在011和012mL/min 流速下,表阿霉素和阿霉素的分离较完全,各组分区带的叠加明显减少;在015mL/min 流速下分离,两组分的区带形状不规则,
且叠加明显增加。
图3 置换剂流速对分离的影响Fig.3 Effect of the flow -rate of displacer
Mobile phase and displacer so lvent:methano -l water (40B 60,p H =214).Displacer concentration:30g/L.Feed load:4mg of iso mer
mixture.Flow -rate: a.011mL/min; b.015mL/min.
以上结果表明,尽管015mL/min 的流速对于洗脱色谱来说仍是较低的流速,但对于置换色谱而言,011和012mL/min 的流速对样品各组分的充分分离更为有利,分离度和区带的叠加情况均相似。因此,在保证分离度的情况下兼顾分离时间,以下实验选用012mL/min
为最佳的流速。
图4 置换展开方式分离表阿霉素和阿霉素的混合物Fig.4 P reparative se paration of doxorubicin and
e pirubicin mixture by displaceme nt mode Mobile phase:methano -l w ater (20B 80,p H =214).Displacer
concentration:30g/L.Displacer solvent:methano -l water (30B
70,p H =214).Flo w -rate:012mL/min.Feed lo ad:30mg of iso -
mer mixture.
2.5 制备分离
在前述所选择的最佳置换分离条件下分离二元异构体的混合物30mg,置换分离结果见图4。
可以看出,在Kromasil KR 100-10C 18色谱柱上可以成功地分离制备量的二元异构体的混合物。流分收集后经分析定量,纯度大于9910%的阿霉素和表阿霉素的量分别为9149和8114mg 。而在同一色谱柱上,以超载洗脱的方式仅可以分离012mg 表阿霉素和阿霉素的混合物(见图5)。
图5 超载洗脱法分离表阿霉素和阿霉素混合物Fig.5 Chromatogram illustrating the ove rloading in
e lution chromatography o
f doxorubicin
and e pirubicin mixture
Mo bile p hase:methano -l water (40B 60,pH =214);flow -r ate:110mL/min;UV detectio n wavelen g th:254nm;feed load :
012mg o f iso mer mixture (1B 1,m /m ).
以上结果充分显示了置换色谱在制备分离中有着传统的洗脱色谱方式无可比拟的优势:允许的上样量比洗脱色谱高得多,可以在分析柱上一次分离
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制备量的样品,单位柱长的固定相利用率最高;可以较好地分离极相似的物质,各组分在分离过程中能形成较清晰的界限,消除了洗脱分析中的拖尾现象,提高了样品组分的回收率;分离制备级的样品只需要较少的有机溶剂,减少了溶剂的后处理量。 另外,本文还考察了进一步增加上样量的情况下阿霉素和表阿霉素在置换色谱中的分离情况。实验结果表明:在使30mg 二元异构体混合物分离良好的色谱条件下,大于30mg 的样品没有得到良好的分离。这是因为样品在色谱柱中的移动过程也是样品的分离过程,样品的分离是由于被分离组分之间对固定相结合部位直接竞争作用的结果,当置换剂泵入色谱柱后,结合能力较强的置换剂置换结合能力较弱的组分,并推动其向前移动,系统达到平衡后,样品中各组分按照它们对固定相亲和力的大小形成置换序列,依次流出色谱柱。当色谱柱不够长时,样品流出色谱柱时仍未达到完全分离,没有形成置换序列,因此分离效果不理想。完全分离所需的柱长与上样量成正比[10],可以采用适当增加色谱柱长度的方法使大于30mg 的阿霉素和表阿霉素的样品得到较好的分离。
3 结论
本文采用置换色谱法,在分析型色谱柱上成功地分离了表阿霉素和阿霉素的混合物,所确定的最
佳分离条件为:30g/L 海胺1622为置换剂;流速为012mL/min;在有机相比例较低的流动相中加样,采用置换剂溶解于有机相比例稍高的溶剂来进行置换展开。结果表明,采用置换展开的方式可以成功地在反相分析柱上一次分离制备量的二元异构体的混合物,验证了置换色谱具有上样量大、充分利用高效的色谱填料、产率高、分辨率好以及有机溶剂消耗量少等优点,使置换色谱应用于生物制剂和药品的制备分离有着广阔的前景。参考文献:
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大连地区电话号码升位及本刊联系方式变更通知
自2004年3月21日零时起,大连市内四区及县(市)区固定电话、小灵通号码由7位升至8位。升位方法:所有固定电话、小灵通号码前加/80。因此,5色谱6编辑部联系方式也有相应变动。电话:(0411)84379021;传真:(0411)84379600。 特此通知。
5色谱6编辑部
2004-03-22
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薄层色谱分离叶绿素
一实验目的 1．掌握提取叶绿素的方法； 2．了解薄层层析的原理，掌握薄层层析的一般操作和定性鉴定方法 二实验原理 1．叶绿素提取 高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a (C55H72O5N4Mg)、叶绿素b(C55H70O6N4Mg)、β—胡萝卜素(C40H56)和叶黄素 (C40H56O2)等4种。叶绿素a和叶绿素b为吡咯衍生物与金属镁的配合物，胡萝卜素是一种橙色天然色素，属于四萜类，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，其中，β异构体含量最多。叶黄素为一种黄色色素，与叶绿素同存在于植物体中，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在乙醚中溶解度较小。根据它们的化学特性，可将它们从植物叶片中提取出来，并通过萃取、沉淀和色谱方法将它们分离开来。 2．薄层色谱 薄层层析是快速分离和定性分析微量物质的一种极为重要的实验技术，具有设备简单、操作方便而快速的特点。它是将固定相支持物均匀地铺在玻片上制成薄层板，将样品溶液点加在起点处，置于层析容器中用合适的溶剂展开而达到分离的目的。用此法分离时几乎不受温度的影响，可采用腐蚀性显色剂，而且可在高温下显色，特别适用于挥发性小或在较高温度下易发生反应的物质，同时也常用来跟踪有机反应或监测有机反应完成的程度。 薄层层析的器材选择： （1）基板：玻璃、塑料、金属箔，常用玻璃板。 2）吸附剂： 吸附剂要有合适的吸附力，并且必须与展开剂和被吸附物质均不起化学反应。可用作吸附剂的物质很多，常用的有硅胶和氧化铝，由于吸附性好，适用于各类化合物的分离，应用最广。选择吸附剂时主要根据样品的溶解度、酸碱性及极性。氧化铝一般是微碱性吸附剂，适用于碱性物质及中性物质的分离；而硅胶是微酸性吸附剂，适用于酸性物质及中性物质的分离。以下简单介绍吸附剂的几个基本参数。 种类：常用：氧化铝（强极性）、硅胶（中强极性） 不常用：硅藻土、纤维素、糖类、活性碳 符号：H——无任何添加剂；G——加有锻石膏（Gypsum，CaSO4·1/2 H2O）粘合剂； F——加有荧光素（Fluorescein） CMC——加有羧甲基纤维素钠（Carboxymethyl cellulose） 例：硅胶GF254表示硅胶中既加有煅石膏粘合剂，也加有荧光素，可以在波长254nm的紫外光下激发出荧光
mTOR信号通路的生物学功能
ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２０１０，３０（４） 文章编号： １０００－１３３６（２０１０）04－0555-07 ｍＴＯＲ信号通路的生物学功能 陈洪菊 屈 艺 母得志 四川大学华西第二医院儿科，成都 ６１００４１ 摘要：哺乳动物的雷帕霉素靶（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ， ｍＴＯＲ）是一种非典型丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，可整合细胞外信号，磷酸化下游靶蛋白核糖体ｐ７０Ｓ６激酶，如Ｓ６Ｋ１及４Ｅ－ＢＰ１，影响基因转录与蛋白质翻译，从而参与调控细胞生长、增殖等过程。ｍＴＯＲ的生物学功能的多样性，使其成为当今生物学研究的焦点之一。ｍＴＯＲ与蛋白质合成、免疫、细胞运动及代谢、细胞凋亡及自噬等均有联系。关键词：ｍＴＯＲ；凋亡；自噬；蛋白质合成中图分类号：Ｑ７１ 收稿日期：２０１０－０２－１５ 国家自然科学基金项目（３０８２５０３９，３０７７０７４８）；四川省青年科技基金（０８ＺＱ０２６－０６９，０７５Ｙ０２９－０６７）；四川省卫生厅基金（０８０２３６）；四川省人事厅基金（０７８ＲＣ－２５６５１５）资助 作者简介：陈洪菊（１９８５－），女，硕士生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｉｌｌａ＿８５９７＠１６３．ｃｏｍ；屈艺（１９７１－），女，博士，教授，Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｕｙｉ７１２００２＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ；母得志（１９６３－），男，博士，教授，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｅｚｈｉｍｕ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆｒａｐａｍｙｃｉｎ， ｍＴＯＲ）是一种非典型丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，为磷脂酰肌醇激酶相关激酶（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙ－ｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ｋｉｎａｓｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ， ＰＩＫＫ）蛋白质家族成员。ｍＴＯＲ进化上相对保守，可整合营养、能量及生长因子等多种细胞外信号，参与基因转录、蛋白质翻译、核糖体合成等生物过程，在细胞生长和凋亡中发挥极为重要的作用。近年来，ｍＴＯＲ的生物学功能研究日益深入，特别是其与细胞凋亡及自噬、蛋白质合成、免疫、细胞运动及代谢等的联系越来越受到重视。 １． ｍＴＯＲ信号通路 ｍＴＯＲ是一类大分子蛋白质，分子量为２８９ ｋＤａ，其很多区域可参与调节蛋白质之间的相互作用。ｍＴＯＲ存在两种不同复合物形式，即ｍＴＯＲＣ１（ｍＴＯＲｃｏｍｐｌｅｘ １）及ｍＴＯＲＣ２。ｍＴＯＲ可与Ｒａｐｔｏｒ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｍＴＯＲ）及哺乳动物ＬＳＴ８形成一个对雷帕霉素（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）抑制敏感的复合物，即 ｍＴＯＲＣ１。Ｒｉｃｔｏｒ（ｒａｐａｍｙｃｉｎ－ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｏｆｍＴＯＲ）蛋白与Ｓｉｎ１（也称为Ｍｉｐ１）及ｍＬＳＴ８、ｍＴＯＲ构成了ｍＴＯＲＣ２。ｍＴＯＲＣ２对雷帕霉素耐受。 ｍＴＯＲ主要通过磷酸化其下游靶蛋白４０Ｓ核糖体Ｓ６蛋白激酶（ｐ７０ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ６ ｋｉｎａｓｅｓ，ｐ７０Ｓ６Ｋ），如Ｓ６Ｋ１及真核启动因子４Ｅ结合蛋白１（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４Ｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １， ４Ｅ－ＢＰ１）来调节下游蛋白质翻译。 活化的Ｓ６Ｋ１可磷酸化下游底物，如４０Ｓ核糖体蛋白Ｓ６（ｐ７０Ｓ６）等，从而促进延长因子－１α（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｔｏｒ－１α， ＥＦ－１α）、ｐｏｌｙ（Ａ）结合蛋白等蛋白质翻译及表达。ｍＲＮＡ ５＇端的７－甲基鸟苷帽子结构（ｃａｐ）可被２４ｋＤａ的真核起始因子－４Ｅ（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－４Ｅ，ｅＩＦ４Ｅ）识别并夹住，支架蛋白ｅＩＦ４Ｇ与ｅＩＦ４Ｅ及ｅＩＦ４Ａ结合并使后二者稳定。４Ｅ－ＢＰ１与ｅＩＦ－４Ｅ结合并抑制其活性，进而抑制依赖ｅＩＦ－４Ｅ转录的启动及蛋白质的表达。当ｍＴＯＲ磷酸化４Ｅ－ＢＰ１后，可使其激活，活化的４Ｅ－ＢＰ１与ｅＩＦ－４Ｅ分离，从而促成ｅＩＦ４Ｅ与ｅＩＦ４Ｇ结合，ｅＩＦ４Ｆ复合物形成及进一步ｃａｐ－依赖的翻译。 ｍＴＯＲ参与了体内多条信号通路。其一是ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ通路，主要在肿瘤的生成及发展中起重要作用。Ａｋｔ可被序贯活化，首先由ＰＤＫ１通过ＰＩ３Ｋ通路在Ｔｈｒ３０８位点活化，然后被激活的ｍＴＯＲＣ２在Ｓｅｒ４７３位点完全活化。ＰＲＡＳ４０抑制ｍＴＯＲＣ１使其失活，Ａｋｔ可直接磷酸化ＰＲＡＳ４０，使其对ｍＴＯＲＣ１的
光学异构体的分离
光学异构体的分离 实验报告课程名称: 化工专业实验指导老师: 成绩:__________________ 实验名称: 光学异构体的分离实验类型:_______ 同组学生姓名: 一、实验目的与要求(必填) 二、实验内容与原理(必填) 三、主要仪器设备(必填) 四、操作方法与实验步骤 五、实验数据记录与处理六、实验结果与分析(必填) 七、讨论、心得 一、实验目的 1、通过苯甘氨酸的拆分实验,理解对映异构体的各种拆分方法; 2、理解有机物溶解、结晶的原理及意义,并将其用于分离提纯; 3、掌握拆分、结晶的基本操作。 二、实验原理与仪器 1、实验原理 对映异构体(也称光学异构体、对映体)就是指分子为互相不可重合的镜像的立体异构体,其主要的拆分方法有机械拆分法,微生物化学拆分法,选择吸附拆分法,诱导结晶拆分法,化学拆分法。 诱导结晶拆分法就是指在外消旋体(两种对映体的等量混合物)的过饱与溶液中,加入一定量的一种旋光体的纯晶体作为晶种,形成溶液中该种旋光体过量,且在晶种的诱导下优先结晶析出。将这种结晶滤出后,则另外一种旋光体在滤液中相对较多。再加入外消旋体制成过饱与溶液,于就是另外一种旋光体优先结晶析出,如此反复进行结晶,就可以把一对对映体分开。 化学拆分法就是指利用手性试剂作为拆分剂加入外消旋体混合物中,使它与外消旋体发生反应,生成两个非对映异构体复盐(非对映异构体指具有二个或多个非对称中心,并且其分子互相不为镜像的立体异构体),再利用它们物理性质(例如溶解度、蒸汽压、吸收系统等)的不同,用常规的方法将其拆分,最后再把这两个非对映异构体分别复原为原来的对映体。化学拆分法最适用于酸或碱的外消旋体的拆分。 对于苯甘氨酸,诱导结晶拆分法得到的产物光学纯度较低,难以找到合适的溶剂使得两种对映体在其中的溶解度有较大差异,且循环量较大,因此本实验采用化学拆分法,利用手性拆分剂与外消旋体形成的复盐溶解度的差异进行结晶拆分。 本实验中,D,L-苯甘氨酸(简写D,L-PG分子式如I),手性拆分剂为d-樟脑磺酸(简写d-CS,分子式如II),二者形成的复盐在水中溶解度有很大差异(如表1),可用结晶方法分离。D,L-苯甘氨酸与d-脑磺酸溶于热溶剂中,形成非对映异构体复盐的饱与溶液,降低温度则复盐溶解度降低,溶液变成过饱与溶液,在饱与溶液中结晶与溶解存在动态平衡,可以通过降温与／或加晶种破坏其平衡使一种结晶优先析出。D-苯甘氨酸-d-樟脑磺酸(简写D-PG-d-CS分子式如ⅡI)溶解度相对较小,则加入D-苯甘氨酸-d-樟脑磺酸晶种后D.苯甘氨酸-d 一樟脑磺酸优先结晶析出,过滤时D-苯甘氨酸-d-樟脑磺酸被滤除,L-苯甘氨酸-d-樟脑磺酸留在母液中与结晶分离,从而达到拆分的目的。(如图1) 影响拆分效率的因素有: (1)温度。 1)起始的结晶温度。起始的结晶温度就是控制其溶液过饱与程度的,如果让溶液在结晶前过度地饱与, 专业: _ 姓名: 学号: 日期: 地点:
叶绿素的提取和分离实验报告
陕西师范大学远程教育学院生物学实验报告 报告题目叶绿素的提取和分离 姓名刘伟 学号 专业生物科学 批次/层次 指导教师 学习中心
叶绿素的提取和分离 一、实验目的 1. 学习叶绿体色素的提取、分离方法。 2. 通过叶绿体色素提取、分离方法的学习了解叶绿体色素的相关理化性质。 3. 为进一步研究各叶绿体色素性质、功能等奠定基础。 二、原理 叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。它们与类囊体膜蛋白相结合成为色素蛋白复合体。它们的化学结构不同，所以它们的物化性质（如极性、吸收光谱）和在光合作用中的地位和作用也不一样。这两类色素是酯类化合物，都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙醇等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。 三、材料、仪器设备和试剂 1. 绿色植物如菠菜等的叶片。 2. 研钵、漏斗、三角瓶、剪刀、滴管、康维皿、圆形滤纸（直径11cm）。 3. 试剂：95%乙醇，石英砂，碳酸钙粉，推动剂:按石油醚:丙酮:苯=10:2:1比例配制（v/v） 四、试验步骤 1. 叶绿体色素的提取 （1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4-5片（4g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。 （2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2-3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10ml 95%乙醇，然后以漏斗过滤之，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。 2. 叶绿体色素的分离 (1)将11cm的滤纸的一端剪去二侧，中间留一长约1.5cm、宽约0.5cm窄条。 (2)用毛细管取叶绿体色素浓溶液点于窄条上端，用电吹风吹干，如一次点样量不足可反复在色点处点样数次，使色点上有较多的叶绿体色素。 (3)在大试管中加入四氯化碳3-5ml及少许无水硫酸钠。然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄端浸入溶剂中，而色点略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁，软木塞盖紧，直立于阴暗处层析。 0.5-1小时后，观察色素带分布：最上端橙黄色(胡萝卜素)，其次黄色(叶黄素)，再崐次 蓝绿素(叶绿素a)，最后是黄绿色(叶绿素b)。（4）当展层剂前沿接近滤纸边缘时便可结束实 验，此时可看到不同色素的同心圆环，各色素由内往外的顺序为：叶绿素b（黄绿色）、叶 绿素a（蓝绿色）、叶黄素（鲜黄色）、胡萝卜素（橙黄色），再用铅笔标出各种色素的位置 和名称。
自噬和雷帕霉素靶蛋白复合物I(mTORC1)调控体细胞重编程的随机阶段pdf
中科院研究发现细胞“返老还童”关键机制 2015年05月21日08:16来源：《中国科学报》 原标题：研究发现细胞“返老还童”关键机制 （记者朱汉斌、丁佳通讯员黄博纯）记者从中科院广州生物医药与健康研究院获悉，该院裴端卿和秦宝明实验组发现了细胞在结构上“返老还童”的关键机制，有望为寻找新的治疗手段提供有力依据。5月18日，相关成果在线发表于《自然·细胞生物学》杂志。 据裴端卿介绍，细胞在饥饿等胁迫条件下会主动降解自身细胞质组分，这一过程被称为“自噬”。此前有研究认为，自噬在重编程早期发挥关键作用。但最新研究发现，自噬对重编程非但不是必须，反而起阻碍作用。重编程在自噬缺失的细胞中不仅效率更高，而且获得的诱导多能干细胞（iPS细胞）具有正常的多能性。 据了解，2006年，日本科学家建立的iPS细胞技术，实现了成体细胞逆转为具有多种分化潜能的类似胚胎干细胞状态的iPS细胞，从而叩开了再生医学的大门。不过，该技术在获得大规模应用前仍存在很多问题。 什么是细胞重塑？科研人员介绍说，成体细胞犹如一个具有特定功用的房间，房间里的器具构造决定了它是居家、办公还是商铺；而胚胎干细胞更像是一个空房间，根据需要可把它改造做任何用途。成体细胞重编程为胚胎干细胞的过程，如同把原有房间里的器具构造清空，只留下一些水电等最基本的设施。这就是细胞在结构上“返老还童”的关键过程。 最新发现将拓展对糖尿病、癌症以及神经退行性疾病等代谢疾病中细胞重塑如何影响细胞命运的认识，从而为寻找新的治疗手段提供有力依据。研究人员进一步发现，细胞重塑的发生实际上来自雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）的关闭，其持续开启则阻断细胞重塑、线粒体代谢转变以及重编程的发生。
有机作业1(含答案)
1.下面四个同分异构体中哪一种沸点最高? A. 己烷 B. 2-甲基戊烷 C. 2,3-二甲基丁烷 D. 2,2-二甲基丁烷 2不是有机化合物的是( )。 A. CH3Cl B. NH3 C. CH3OH D. CH3CN 3下列环烷烃中加氢开环最容易的是: A. 环丙烷 B. 环丁烷 C. 环戊烷 D. 环己烷 4没有构象异构的化合物是( )。 A. CH3CH3 B. CH3CHO C. CH2=CHBr D. C2H5Cl 5下列一对化合物是什么异构体? A. 非对映体 B. 构型异构体 C. 对映体 D. 构造异构体 6光照下,烷烃卤代反应的机理是通过哪一种中间体进行的? A. 正碳离子 B. 自由基 C. 负碳离子 D. 协同反应,无中间体 7下列化合物：CH3CH═CH—H（Ⅰ），CH3C≡C—H（Ⅱ），CH3CH2—H（Ⅲ）的C—H 键的键能大小顺序 A. Ⅰ＞Ⅱ＞Ⅲ B. Ⅲ＞Ⅱ＞Ⅰ C. Ⅱ＞Ⅰ＞Ⅲ D. Ⅲ＞Ⅰ＞Ⅱ 8下列化合物中指定的C—H键长最短的为 A. A B. B C. C D. B和C 9构造式为CH3CHClCH=CHCH3 的立体异构体数目是: A. 2种 B. 4种 C. 3种 D. 1种 10下列化合物中哪些可能有E,Z异构体? A. 2-甲基-2-丁烯 B. 2,3-二甲基-2-丁烯 C. 2-甲基-1-丁烯 D. 2-戊烯 11.在下列共振结构式中对共振杂化体贡献最大的 是 A. A B. B C. C D. A和C 12内消旋体2,3-二氯丁烷的优势构象的Newman投形式是（）。
13下列四对结构式，哪一对是等同的（）。 14一个天然醇C6H12O，比旋光度[α]25= 69.50，催化氢化后吸收一分子氢得一个新的醇，比旋光度为0，则天然醇结构是（）。 15 一对化合物的相互关系是（）。 A. 对映关系 B. 非对映关系 C. 相同化合物 D. 不同化合物 16 (R)-2-氯丁烷与(S)-2-氯丁烷的哪种性质不同? A. 熔点 B. 沸点 C. 折射率 D. 比旋光度 17 上述构型的正确命名是: A. (1)R (2)R (3)S B. (1)R (2)S (3)S C. (1)S (2)S (3)S D. (1)R (2)R (3)R 18 A. 2R, 3R B. 2R, 3S C. 2S, 3R D. 2S, 3S 19用来表示下列药物假麻黄碱的投影式应是:
美国FDA关于开发立体异构体新药的政策简介
美国FDA关于开发立体异构体新药的政策简介 作者：黄晓龙 单位：国家药品监督管理局药品审评中心 1前言与背景 立体异构体是指原子的组成及连接方式相同，而其三维空间的排列不同的分子。此处最引人注意的对映异构体是指有一个或一个以上的不对称（手性）中心，相互间成镜像关系的“立体异构体对”，它们的物理（旋光性除外）及化学（手性环境下除外）性质相同。 本文着重于单一对映异构体及消旋体的药学研究与开发，此类立体异构体通常需要特殊的手性技术来正确地鉴别、定性、分离及定量。然而它们可被生物体系区别，而体现出不同的药代动力学性质（吸收、分布、生物转化及排泄）和不同的药效或毒性，这种不同可以是数量或性质上的。 当立体异构体能被生物识别时，它们就成为不同的药物。尽管过去开发了消旋体（即50∶50的对映体）药物，而对单一的对映异构体的性质通常并没有很好地研究，因为消旋体的廉价分离是比较困难的，是否需开发对映异构体主要还是一个学术问题；而现在，技术的进步（大规模手性分离方法或不对称合成）使得许多对映异构体的大规模生产成为可能，所以有必要了解FDA对立体异构体混合物的政策。消旋体的开发带来了诸如合成与杂质的生产控制、足够的药效及毒性评估、代谢与分布的合理定性、临床的正确评价等问题。 应注意的是，“立体异构体”为一个总的概念，泛指所有因原子在空间的排列不同而形成的异构体，它不仅包括镜像异构体，也包括几何异构体（顺反异构）及非对映异构体（有多个手性中心、互不为镜像的异构体）。非对映异构体与几何异构体均存在化学及药效的差异（除非它们在体内可相互转化），并且可不通过手性技术分离。因此几何异构体与非对映异构体应按单独的药物对待，但当它们会在体内相互转化时除外。开发几何异构体或非对映异构体的混合物没有必要，除非它们恰好形成一合理的复方药；即使在这种情况下，也应严格检查这两个异构体的最佳比例是否不加控制即可合成。非对映异构体的情况就比较复杂，在此处不做深入探讨。从已有的研究结果看，两个对映异构体可有相同的活性：如多巴酚丁胺的两个对映体均具有正性肌力作用，布洛芬的两个对映体均为抗炎药，华法林及苯丙羟基香豆素的两个对映体均为抗凝剂，布比卡因的两个对映体均产生局麻作用。 其中一个对映体有药理活性，而另一个则没有，如左旋普奈洛尔是β-受体阻滞剂，而右旋体则不是，另如都具有抗菌作用的喹啉及β-内酰胺类抗生素即为此类。 两个对映体具有完全不同的活性，如右旋索它洛尔属于III类抗心律失常药，而左旋体则为β-受体阻滞剂，或者对于一个特定的作用具有不同的浓度-效应关系。 尽管无活性的对映体可不予考虑，但存在毒性与该对映体有关的实例（如粒细胞减少与右旋多巴有关；左旋咪唑的呕吐作用是其中的右旋体杂质引起的；当从消旋卡尼丁中去掉右旋体后，就再也观察不到严重的肌无力不良反应），也存在一个对映体影响另一个的分布的例子。另外，很多对映异构体的药代动力学行为也不同，这种不同不一定会引起治疗问题，尽管它会使非手性的血药浓度及与之相关的活性的解释变得困难，同时当异构体在动物中的药代动力学行为与人不同时，也会影响非临床数据的解释。 虽然某些“对映异构体对”（如消旋索它洛尔、消旋多巴酚丁胺）具有较好的治疗作用，但没有理由希望其组成与外消旋体一样，正好为1∶1，即其剂量效应曲线不一定是成正比
普通高中叶绿素提取和分离实验
植物叶绿体中色素的提取与分离实验报告 用具：剪刀一把、干燥的定性滤纸、50ml的烧杯及100ml的烧杯各3个、白纸3张、试管架一个、研钵一个、玻璃漏斗一个、尼龙布或纱布、毛细血管一只、药勺一个、10ml 量筒一只，天平一只，试管3支、纸板一块、棉塞3个、培养皿3个、刻度尺、注射器一只、盖玻片 试剂：丙酮、无水乙醇、层吸液（20份石油醚、2份丙酮、1份苯配置而成）、白沙（二氧化硅）、碳酸钙、碳酸钠 材料：新鲜的紫茎泽兰叶、其他野生植物叶片 背景资料： 1、叶绿素等是脂溶性的有机分子，根据相似相溶的原理，叶绿素等色素分子溶于有机溶剂而不溶于有极性的水。故在研磨和收集叶绿色素时要用丙酮或乙醇等有机溶剂而不用水。 2、叶绿素分布于基粒的片层薄膜上，加入少许二氧化硅是为了磨碎细胞壁、质膜、叶绿体被膜和光合片成，使色素溶解于丙酮中。 3、破碎的细胞中含有草酸等有机酸，叶绿素分子中含有的Mg元素处于不稳定化合太，镁离子与有机酸结合将导致色素分子破坏。加入少许碳酸钙使得钙离子与有机酸结合，减少镁离子的转移，防止研磨时叶绿体色素的破坏。所以在研磨时加入适量的碳酸钙，同时加入碳酸钠的道理亦如此。 4、在过滤时选用脱脂棉或纱布，而不用滤纸。原因主要有下：（1）色素分子比较大，不容易透过滤纸；（2）滤纸有较强的吸附性而使色素吸附在滤纸上，从而降低色素浓度，影响实验效果；（3）叶绿素是脂溶性，根据相似相容的原理，脱脂棉可以减少实验过程中色素的流失，增强实验效果。 5、根据物理学中的毛细现象，画滤纸细线前滤纸必须经过干燥处理，是为了阻止水分子堵塞滤纸中的毛细管而影响层析液的扩散。但如果用火烤的话，会使滤纸纤维变形同时破坏啦毛细管，而影响层析液的扩散。 6、由于液面的不同位置表面张力不同，纸条接近液面时，其边缘的表面的张力较大，层析液沿滤纸边缘扩散过快，而导致色素带分离不整齐的现象。故而，在插入层析液的滤纸条一端剪去两个角。 7、为了防止滤纸条倒入层析液中而使层析实验失败。同时，防止因液体表面张力引起层析液沿滤纸条向上的“壁流”而导致色素溶解。 8、色素分离的原理：纸层析是用滤纸作为载体的一种色层分析法，其原理主要是利用混合物中各组分在；流动相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分离。滤纸上吸附的水为固定相（滤纸纤维常能吸20%左右的水），有机溶剂如乙醇等为流动相，色素提取液为层析试样。把试样点在滤纸的滤液细线位置上，当流动相溶剂在滤纸的毛细管的作用下，连续不断地沿着滤纸前进通过滤液细线时，试样中各组份便随着流动相溶剂向前移动，并在流动相和固定相溶剂之间连续一次有一次的分配。结果分配比比较大的物质移动速度较快，移动距离较远；分配比较小的物质移动较慢，移动距离较近，试样中各组分分别聚集在滤纸的不同的位置上，从而达到分离的目的。符合我国的资源友好型社会。 操作步骤 1．称取新鲜叶子2g，放入研钵中加丙酮5ml，少许碳酸钙(防止叶绿素被破坏）和石英砂（帮助研磨），研磨成匀浆，再加丙酮5ml，然后以漏斗过滤之，即为色素提取液。
含氮大环内酯类抗生素生物合成及其研究进展.
含氮大环内酯类抗生素及其生物合成研究进展 雷帕霉素、他克莫司等一类含氮大环内酯类微生物代谢产物是目前临床重要的药物，它们具有特殊的结构基团，即内酯环上含有1分子非蛋白质组成氨基酸——哌可酸，通过哌可酰基与细胞内一类具有脯氨酰顺反异构酶活性的免疫亲合蛋白（immunophilin）FKBPs（FK506 bingding proteins）相互作用形成复合物，作用于细胞不同靶位，发挥多种不同的生物学功能[1]。这类化合物具有广泛的生物学活性，除抗真菌活性外，临床已用作器官移植抗排斥药物、血管扩张支架涂层药物[2]、靶向抗肿瘤药物[3-4]、炎症治疗药物[5]，同时，这类化合物还具有潜在的治疗中风[6]、神经退行性疾病[7]、帕金森综合症[8]、老年痴呆[9]等作用，Harrison等人2009年7月在《Nature》杂志上报道雷帕霉素可以延长哺乳类动物老龄小鼠寿命的研究成果[10]，立即引起各国科学家的广泛关注和高度兴趣[11]，美国《Science》杂志把此项研究成果评选为当年十大科学进展之一，预计10年左右可望应用于人体。 含有哌可酰基的含氮大环内酯类微生物代谢产物具有相似的生物合成途径，它们都属大环内酯类化合物，由典型的具有模块结构的I型聚酮合酶（Polyketide synthase, PKS）催化合成内酯环碳链骨架，由单模块的非核糖体肽合成酶（Non-ribosomal peptide synthetase, NRPS）催化把哌可酸整合到内酯环骨架，并通过环化酶活性域使含哌可酰基的聚酮链内酯化从PKS/NRPS杂合酶上脱离，最后通过一些列氧化酶、甲基转移酶等进行侧链基团的修饰形成最后的活性产物，由于这类化合物具有相似的结构和合成机制，特别是它们的作用机制独特带来广泛的生物学活性和临床应用前景，已经成为目前国内外关注和研究的热点。 一、微生物产生的含氮大环内酯类化合物 1、Rapamycin（雷帕霉素, 西罗莫司/sirolimus） 1975年，加拿大Ayerst试验室Vezina等在筛选抗真菌抗生素中，从太平洋复活岛土壤样品中分离到一株具有抗白色念珠菌（Candida albicans）等酵母样真菌和石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)等丝状真菌活性的吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus
光学异构体的分离
实验报告 课程名称：化工专业实验指导老师：成绩：__________________ 实验名称：光学异构体的分离实验类型：_______ 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填） 三、主要仪器设备（必填）四、操作方法和实验步骤 五、实验数据记录和处理六、实验结果与分析（必填） 七、讨论、心得 一、实验目的 1、通过苯甘氨酸的拆分实验，理解对映异构体的各种拆分方法； 2、理解有机物溶解、结晶的原理及意义，并将其用于分离提纯； 3、掌握拆分、结晶的基本操作。 二、实验原理和仪器 1、实验原理 对映异构体（也称光学异构体、对映体）是指分子为互相不可重合的镜像的立体异构体，其主要的拆分方法有机械拆分法，微生物化学拆分法，选择吸附拆分法，诱导结晶拆分法，化学拆分法。 诱导结晶拆分法是指在外消旋体（两种对映体的等量混合物）的过饱和溶液中，加入一定量的一种旋光体的纯晶体作为晶种，形成溶液中该种旋光体过量，且在晶种的诱导下优先结晶析出。将这种结晶滤出后，则另外一种旋光体在滤液中相对较多。再加入外消旋体制成过饱和溶液，于是另外一种旋光体优先结晶析出，如此反复进行结晶，就可以把一对对映体分开。 化学拆分法是指利用手性试剂作为拆分剂加入外消旋体混合物中，使它与外消旋体发生反应，生成两个非对映异构体复盐（非对映异构体指具有二个或多个非对称中心，并且其分子互相不为镜像的立体异构体），再利用它们物理性质（例如溶解度、蒸汽压、吸收系统等）的不同，用常规的方法将其拆分，最后再把这两个非对映异构体分别复原为原来的对映体。化学拆分法最适用于酸或碱的外消旋体的拆分。 对于苯甘氨酸，诱导结晶拆分法得到的产物光学纯度较低，难以找到合适的溶剂使得两种对映体在其中的溶解度有较大差异，且循环量较大，因此本实验采用化学拆分法，利用手性拆分剂与外消旋体形成的复盐溶解度的差异进行结晶拆分。 本实验中，D，L-苯甘氨酸（简写D，L-PG分子式如I），手性拆分剂为d-樟脑磺酸（简写d-CS，分子式如II），二者形成的复盐在水中溶解度有很大差异（如表1），可用结晶方法分离。D，L-苯甘氨酸和d-脑磺酸溶于热溶剂中，形成非对映异构体复盐的饱和溶液，降低温度则复盐溶解度降低，溶液变成过饱和溶液，在饱和溶液中结晶和溶解存在动态平衡，可以通过降温和／或加晶种破坏其平衡使一种结晶优先析出。D-苯甘氨酸-d-樟脑磺酸（简写D-PG-d-CS分子式如ⅡI）溶解度相对较小，则加入D-苯甘氨酸-d-樟脑磺酸晶种后D．苯甘氨酸-d一樟脑磺酸优先结晶析出，过滤时D-苯甘氨酸-d-樟脑磺酸被滤除，L-苯甘氨酸-d-樟脑磺酸留在母液中与结晶分离，从而达到拆分的目的。（如图1） 影响拆分效率的因素有： 专业： _ 姓名： 学号： 日期： 地点：
叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定
实验报告 植物生理学及实验（甲）实验类型：课程 名称：实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶 绿素含量的测定姓名：专业：学 号：指导老师：同组学生姓名： 实验日期：实验地点： 二、实验内容和原理一、实验目的和要求装 四、操作方法与实验步骤三、主要仪器设备订 六、实验结果与分析五、实验数据记录和处理 七、讨论、心得一、实验目的和要求、掌握植物中叶绿体色素的分离和 性质鉴定、定量分析的原理和方法。1 和b的方法及其计算。a2、熟悉在 未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素二、实验内容和原理以青菜为 材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。 原理如下：80%的乙醇或95%叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，1、常用的丙酮提取。、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应， 形成绿色的可溶性叶绿素2． 盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。- COOCHCOO3 Mg + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH
HONC43230+C20H39OH 、3H+可依次被在酸性或加温条件下，叶-COOCOOCH39 20 绿素卟啉环中的Mg++取代反应。Mg2+, Cu2+ 取代Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+和H+ ) 取代(Zn2+) 绿色褐色 、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。4645其中叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，5、定量分析。 652可直接用于总量分析。663用于定量叶绿素a,b及总量，而和C最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度根据朗伯-比尔定律， *k+C*kOD=Ca*k与吸光值之间有如下的关系： OD=Ca*k+C b2 1g/L和b的80查阅文献得，2b1 b1a1a2b时，比吸收系％丙酮溶液，当浓度为 叶绿素a 值如下。数k k 比吸收系数波长/nm b 叶绿素a 叶绿素 9.27 82.04 663 45.60 645 16.75
叶绿素的提取和分离实验报告
叶绿素的提取和分离实 验报告 Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】
陕西师范大学远程教育学院 生物学实验报告 报告题目叶绿素的提取和分离 姓名刘伟 学号 专业生物科学 批次/层次 指导教师 学习中心 叶绿素的提取和分离 一、实验目的 1. 学习叶绿体色素的提取、分离方法。 2. 通过叶绿体色素提取、分离方法的学习了解叶绿体色素的相关理化性质。 3. 为进一步研究各叶绿体色素性质、功能等奠定基础。 二、原理 叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b）和黄色素（包括胡萝卜素和叶黄素）两大类。它们与类囊体膜蛋白相结合成为色素蛋白复合体。它们的化学结构不同，所以它们的物化性质（如极性、吸收光谱）和在光合作用中的地位和作用也不一样。这两类色素是酯类化合物，都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇、丙醇等有机溶剂提取。提取液可用色谱分析的原理加以分离。因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。 三、材料、仪器设备和试剂 1. 绿色植物如菠菜等的叶片。 2. 研钵、漏斗、三角瓶、剪刀、滴管、康维皿、圆形滤纸（直径11cm）。 3. 试剂：95%乙醇，石英砂，碳酸钙粉，推动剂:按石油醚:丙酮:苯=10:2:1比例配制（v/v） 四、试验步骤 1. 叶绿体色素的提取 （1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4-5片（4g左右），洗净，擦干，去掉中脉剪碎，放入研钵中。 （2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2-3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10ml 95%乙醇，然后以漏斗过滤之，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。
普通高中叶绿素提取和分离实验
普通高中相关实验 植物叶绿体中色素的提取与分离 用具：剪刀一把、干燥的定性滤纸、50ml的烧杯及100ml的烧杯各3个、白纸3张、试管架一个、研钵一个、玻璃漏斗一个、尼龙布或纱布、毛细血管一只、药勺一个、10ml量筒一只，天平一只，试管3支、纸板一块、棉塞3个、培养皿3个、刻度尺、注射器一只、盖玻片 试剂：丙酮、无水乙醇、层吸液（20份石油醚、2份丙酮、1份苯配置而成）、二氧化硅、碳酸钙、碳酸钠 材料：新鲜的菠菜叶、青菜叶、大叶黄杨叶片 背景资料： 1、叶绿素等是脂溶性的有机分子，根据相似相溶的原理，叶绿素等色素分子溶于有机溶剂而不溶于有极性的水。故在研磨和收集叶绿色素时要用丙酮或乙醇等有机溶剂而不用水。 2、叶绿素分布于基粒的片层薄膜上，加入少许二氧化硅是为了磨碎细胞壁、质膜、叶绿体被膜和光合片成，使色素溶解于丙酮中。 3、破碎的细胞中含有草酸等有机酸，叶绿素分子中含有的Mg元素处于不稳定化合太，镁离子与有机酸结合将导致色素分子破坏。加入少许碳酸钙使得钙离子与有机酸结合，减少镁离子的转移，防止研磨时叶绿体色素的破坏。所以在研磨时加入适量的碳酸钙，同时加入碳酸钠的道理亦如此。 4、在过滤时选用脱脂棉或纱布，而不用滤纸。原因主要有下：（1）色素分子比较大，不容易透过滤纸；（2）滤纸有较强的吸附性而使色素吸附在滤纸上，从而降低色素浓度，影响实验效果；（3）叶绿素是脂溶性，根据相似相容的原理，脱脂棉可以减少实验过程中色素的流失，增强实验效果。 5、根据物理学中的毛细现象，画滤纸细线前滤纸必须经过干燥处理，是为了阻止水分子堵塞滤纸中的毛细管而影响层析液的扩散。但如果用火烤的话，会使滤纸纤维变形同时破坏啦毛细管，而影响层析液的扩散。 6、由于液面的不同位置表面张力不同，纸条接近液面时，其边缘的表面的张力较大，层析液沿滤纸边缘扩散过快，而导致色素带分离不整齐的现象。故而，在插入层析液的滤纸条一端剪去两个角。 7、为了防止滤纸条倒入层析液中而使层析实验失败。同时，防止因液体表面张力引起层析液沿滤纸条向上的“壁流”而导致色素溶解。 8、色素分离的原理：纸层析是用滤纸作为载体的一种色层分析法，其原理主要是利用混合物中各组分在；流动相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分离。滤纸上吸附的水为固定相（滤纸纤维常能吸20%左右的水），有机溶剂如乙醇等为流动相，色素提取液为层析试样。把试样点在滤纸的滤液细线位置上，当流动相溶剂在滤纸的毛细管的作用下，连续不断地沿着滤纸前进通过滤液细线时，试样中各组份便随着流动相溶剂向前移动，并在流动相和固定相溶剂之间连续一次有一次的分配。结果分配比比较大的物质移动速度较快，移动距离较远；分配比较小的物质移动较慢，移动距离较近，试样中各组分分别聚集在滤纸的不同的位置上，从而达到分离的目的。符合我国的资源友好型社会。 操作步骤
立体化学基础
第五章 立体化学基础（手性分子） 一、选择题 1．下列化合物具有旋光性的是( )。 CH 2OH HO H 2OH 3 H A ． B ． C ． D ． 3 3COOH H 2．3-氯-2,5-二溴己烷可能有的对映体的个数是( )。 A ．3对 B ．1对 C ．4对 D ．2对 3．下列羧酸最稳定的构象是( )。 COOH CH 3H 3C H 3C COOH CH 3A ．B ． C ． D ． 4．下列化合物构型为S 型的是( )。 A ． B ． C ． D ．CH 3 Br H 2 CH 3 HO H 2CH 3 CH 2OH Cl H COOH HO H 2OH 5．具有手性碳原子，但无旋光活性的是( )。 A.E-1,2-二甲基环丁烷 B.Z-1,2-二甲基环丁烷 C.1,2-二氯丁烷 D.1,3-二氯丁烷 E.1,4-二氯丁烷 6．下列化合物的绝对构型为( )。 COOH H OH 2CH 3 A ． B ． C ． D ．D-L-R-S-型 型型型 7．下列化合物构型为S 型的是( )。 A ． B ． C ． D ．CH 3 Br H 2 CH 3 HO H 2CH 3 CH 2OH Cl H COOH HO H 2OH 8．下列互为对映体的是( )。 H HO COOH H OH COOH H OH H COOH H HOOC OH H HO COOH OH H COOH HO COOH (1)(3) (4) (2)(1)(3)(4)(2)(1)(3)(2)和和和和(3)A ． B ． C ． D ． 9．3R ，4R-3，4-二苯基戊酸的最稳定构象是( )。
光学异构体的分离
浙江大学 化学实验报告 课程名称:化学专业实验Ⅱ 实验名称：光学异构体得分离 指导教师： 专业班级: 姓名: 学号: 同组学生： 实验日期： 实验地点:
一、实验目得 1、通过苯甘氨酸得拆分实验,理解对映异构体得各种拆分方法; ２、理解有机物溶解、结晶得原理及意义,并将其用于分离提纯； ３、掌握拆分、结晶得基本操作。 二、实验原理与仪器 1、实验原理 对映异构体（也称光学异构体、对映体)就是指分子为互相不可重合得镜像得立体异构体,其主要得拆分方法有机械拆分法，微生物化学拆分法,选择吸附拆分法,诱导结晶拆分法,化学拆分法。 诱导结晶拆分法就是指在外消旋体（两种对映体得等量混合物)得过饱与溶液中，加入一定量得一种旋光体得纯晶体作为晶种，形成溶液中该种旋光体过量,且在晶种得诱导下优先结晶析出。将这种结晶滤出后,则另外一种旋光体在滤液中相对较多。再加入外消旋体制成过饱与溶液,于就是另外一种旋光体优先结晶析出,如此反复进行结晶,就可以把一对对映体分开。 化学拆分法就是指利用手性试剂作为拆分剂加入外消旋体混合物中，使它与外消旋体发生反应,生成两个非对映异构体复盐(非对映异构体指具有二个或多个非对称中心,并且其分子互相不为镜像得立体异构体）,再利用它们物理性质（例如溶解度、蒸汽压、吸收系统等）得不同,用常规得方法将其拆分，最后再把这两个非对映异构体分别复原为原来得对映体。化学拆分法最适用于酸或碱得外消旋体得拆分。 对于苯甘氨酸，诱导结晶拆分法得到得产物光学纯度较低,难以找到合适得溶剂使得两种对映体在其中得溶解度有较大差异,且循环量较大,因此本实验采用化学拆分法,利用手性拆分剂与外消旋体形成得复盐溶解度得差异进行结晶拆分。 本实验中,D,L-苯甘氨酸(简写D ，L-PG 分子式如Ⅰ),手性拆分剂为d －樟脑磺酸(简写d-ＣS ，分子式如Ⅱ),二者形成得复盐在水中溶解度有很大差异(如表１),可用结晶方法分离。Ｄ,L-苯甘氨酸与d-脑磺酸溶于热溶剂中,形成非对映异构体复盐得饱与溶液,降低温度则复盐溶解度降低,溶液变成过饱与溶液，在饱与溶液中结晶与溶解存在动态平衡，可以通过降温与/或加晶种破坏其平衡使一种结晶优先析出。Ｄ-苯甘氨酸－d-樟脑磺酸（简写D-PG －d －ＣS 分子式如Ⅲ）溶解度相对较小,则加入Ｄ-苯甘氨酸-d-樟脑磺酸晶种后D.苯甘氨酸-ｄ一樟脑磺酸优先结晶析出,过滤时D-苯甘氨酸－ｄ－樟脑磺酸被滤除,Ｌ-苯甘氨酸-d-樟脑磺酸留在母液中与结晶分离,从而达到拆分得目得。(如图1) COOH NH 2 Ⅰ S O OH Ⅱ COOH 3H D-PG (+)-CS Ⅲ · 表 1 PG-d-C Ｓ复盐溶解度
实验六叶绿素的提取、分离
叶绿素的提取、分离一、实验目的 1. 掌握从植物叶中提取叶绿素的方法。 2. 了解纸层层析的原理，掌握纸层析的一般操作和定性鉴定方法。 二、实验原理 1. 叶绿素提取原理：叶绿素等是脂溶性的有机分子，根据相似相溶的原理，叶绿体中含有叶绿体色素（叶绿素a和b、胡萝卜素及叶黄素）等色素分子溶于有机溶剂而不溶于有极性的水。故在研磨和收集叶绿色素时要用丙酮或乙醇等有机溶剂提取而不用水。 2. 色素分离的原理：纸层析是用滤纸作为载体的一种色层分析法，其原理主要是利用混合物中各组分在；流动相和固定相的分配比（溶解度）的不同而使之分离。滤纸上吸附的水为固定相（滤纸纤维常能吸20%左右的水），有机溶剂如乙醇等为流动相，色素提取液为层析试样。把试样点在滤纸的滤液细线位置上，当流动相溶剂在滤纸的毛细管的作用下，连续不断地沿着滤纸前进通过滤液细线时，试样中各组份便随着流动相溶剂向前移动，并在流动相和固定相溶剂之间连续一次有一次的分配。结果分配比比较大的物质移动速度较快，移动距离较远；分配比较小的物质移动较慢，移动距离较近，试样中各组分分别聚集在滤纸的不同的位置上，从而达到分离的目的。 毛细管点样薄层色谱展开 三、仪器和药品 剪纸形状 滤液基线
研钵、毛细管、漏斗、纱布、小烧杯、试管、培养皿等 95%酒精、丙酮、石油醚 碳酸钙，石英砂 四、实验步骤 （1）取菠菜或其他植物新鲜叶片20g左右，洗净，用滤纸擦干，去掉叶柄和中脉剪碎，放入研钵。 （2）研钵中加入少量碳酸钙和石英砂，加4-5ml 无水乙醇，研磨至糊状，再加10ml 无水乙醇充分混匀以提取叶片匀浆中的色素，15-20分钟后，过滤入50ml锥形瓶中加塞待用。 分离：（1）取圆形定性滤纸一张（直径15cm），将其剪成滤纸条（15cm×2cm），将其2cm一端剪去两侧，中间留一长约，宽约的窄条，并在滤纸剪口上方用铅笔画一条直线，作为画滤液细线的基准线（注意：滤液线必须距底边）。用毛细管吸取乙醇叶绿体色素提取液，沿纸条的滤液线涂，等风干后，再重复操作数2-3次。（用滤液涂圆点状类似） （2）在层析缸中加入适量（约2ml）的丙酮作为推动剂，将滤纸条带有色素的一端轻轻插入层析缸中，使滤纸条下端浸入推动剂中。迅速盖好层析缸盖，静置40-60min。此时，推动剂借毛细管引力顺滤纸条向上扩散，并把叶绿体色素向上推动，不久即可看到各种色素的条带。 （3）当推动剂前沿接近滤纸边缘时，取出滤纸，风干，即可看到分离的各种色素，从上到下为：胡萝卜素为橙黄色、叶黄素为鲜黄色、叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，用铅笔标出各种色素的位置和名称。 五、数据记录
《叶绿体色素的提取和分离》 实验报告
《叶绿体色素的提取和分离》实验报告 实验目的 1. 学习叶绿体色素的提取、分离方法。 2. 通过叶绿体色素提取、分离方法的学习了解叶绿体色素的相关理化性质。 3. 为进一步研究各叶绿体色素性质、功能等奠定基础。 实验原理 叶绿体色素包括绿色的叶绿素(包括叶绿素a和叶绿素b)和黄色的类胡萝卜素(包括胡萝卜素和叶黄素)两大类,它们均以色素蛋白复合体形式存在于类囊体膜上。两类色素均不溶于水而溶于有机溶剂,故可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。由于提取液中不同色素在固定相和流动相中的分配系数不同,所以可借助分配层析方法将其分离。 实验仪器与药品 1. 绿色植物如菠菜等的叶片。 2. 研钵、漏斗、三角瓶、剪刀、滴管、康维皿、圆形滤纸(直径11cm)。 3. 95%乙醇、石英砂、碳酸钙、展层剂。展层剂按石油醚:丙酮:苯10:2:1的比例配制(V/V)。 实验步骤 1. 叶绿体色素的提取
(1)取菠菜或其它新鲜植物叶片4~5片(4g左右),将其洗净、擦干并去掉中脉,剪碎后置入研钵中。 (2)研钵中加入95%乙醇2~3 ml及少许石英砂、碳酸钙研磨至匀浆,再加95% 乙醇5ml,然后以漏斗过滤之,即为色素提取液。 2. 叶绿体色素的分离 (1)取圆形定性滤纸一张(直径应小于康维皿直径)于其中心扎一圆形小孔(直 径约3mm),另取长方形滤纸条一张(5cm×1.5cm),用滴管吸取乙醇叶绿体色素提取 液沿滤纸条的长度方向涂抹,注意涂抹色素扩散宽度应限制在0.5cm以内,风干后再重复操作数次。然后沿长度方向将滤纸条卷成纸捻,使涂抹过叶绿体色素溶液的一侧恰在纸捻的一端。 (2)将纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸的小孔中,使与滤纸刚刚平齐(勿突出)。 (3)在康维皿中央小室中加入适量的展层剂,把带有纸捻的圆形滤纸平放在康 维皿中央小室上,使纸捻下端浸入展层剂中,迅速盖好培养皿。展层剂将借助毛细管作用顺纸捻扩散至圆形滤纸上,使叶绿体色素在固定相(滤纸中吸附有水分的纤维素)和流动相(展层剂)间反复分配,从而使不同色素得到分离,分离结果为滤纸上可见到各种色素的同心圆环。无康维皿时亦可用底、盖直径相同的培养皿进行实验,实验时可在培养皿底中放入一平底短玻管或塑料药瓶盖以替代康维皿中央小室盛装展层剂,其余相同。 (4)当展层剂前沿接近滤纸边缘时便可结束实验,此时可看到不同色素的同心 圆环,各色素由内往外的顺序为:叶绿素b(黄绿色)、叶绿素a(蓝绿色)、叶黄素(鲜黄色)、胡萝卜素(橙黄色),再用铅 笔标出各种色素的位置和名称。