流式细胞术联合测定保存血小板表达的磷脂酰丝氨酸和CD62P
流式细胞术联合测定保存血小板表达的
磷脂酰丝氨酸和CD62p
欧阳锡林,刘景汉,骆 群,石 群,韩 玮,李锡金,Dayong Gao1 (解放军总医院,北京100853;1University of Kentucky,Lexington,KY40506USA)
摘要 人类血小板通过不同的技术进行离体保存后,其特性改变差异较大。建立适用于各种保存血小板特性分析的流式细胞术(FCM)对保存血小板的质量监测和新保存方法研究有重要意义。本研究通过对FCM分析方法主要条件的优化评估,建立了联合测定血小板膜表面包括磷脂酰丝氨酸在内的多参数FCM定量分析方法。在标本制作中,血小板不需要洗涤即可直接进行标记,减少了血小板离心洗涤过程中的激活。除了FCM常用的同型对照外,文中还将新鲜富含血小板血浆(FPRP)、凝血酶激活FPRP和液氮处理FPRP作为血小板标准阴性、阳性对照,直接应用于FCM分析,且效果良好。该方法中G ly2Pro2Arg2Pro乙酸盐(GPRP)的选择应用,既防止了血小板聚集和纤维蛋白的形成,同时可稳定血小板,减少制备过程中人为激活,克服了在血小板、Ca2+和血浆共存条件下FCM定量分析血小板的困难,尤其是为深低温处理血小板包括PS在内的多参数分析提供了良好的方法基础。研究表明该方法标本处理简单,结果分析简便、准确,重复性好。作者还通过低温、低渗或激活剂的方法制备了几种膜表面分子标记显著不同的血小板应用于FCM分析,不仅证实了所建立的FCM分析方法在各种不同膜表面分子标记的血小板分析中的实用性,又表明了文中制备的这4种不同膜表面分子标记的血小板在FCM分析保存血小板方法学中的实用价值。
关键词 流式细胞术;磷脂酰丝氨酸;CD62p;血小板保存
中图分类号 R457.1;R331.143
Flow Cytometry Combined Assay for Phosphatidylserine and CD62p Expressed by Preserved Platelets
OU YAN G Xi2Lin,L IU Jing2Han,L UO Qun,SHI Qun,HAN Wei,L I Xi2Jin,Dayong G ao1
(The General Hospital of PL A,Beiji ng100853;1U niversity of Kent ucky Lexi ngton,K Y40506USA)
Abstract Human platelets have distinct characters when preserved by different methods.A efficient flow cytometric assay for different preserved platelets expression of CD62p and phosphatidylserine(PS)is in dire need.E fficient flow cytometric assay for CD62p and PS expressed by preserved platelets was established and the ma jor conditions were optimized.The platelets need not to be washed to wi pe off plasma and can be labelled diredtly during the sample preparation.It is efficient for flow cytometric analysis when fresh platelet riched plasma(FPRP)was set as negative control,thrombin actived FPRP,and liquid nitrogen treated FPRP were set as positive control res pectively.G ly2Pro2Arg2 Pro acetate salt(GPRP)was applied to prevent platelets aggregation and fibrin formation,stabilize platelets and minimize the artifical platelets activation.This is also the key to conquer difficulty of flow cytometric quantitive analysis when platelet,Ca2+and plasma coexist.This flow cytometric method is s pecially suitable for the multi2parameter assay including PS expression for cryopreserved platelets.Minimal sample manipulation,no fixation,and GPRP a pplication resulted in minor artefacts and good sample stability.Results suggested,this flow cytometric assay for preserved platelets is simple and efficient.In addition,the author prepared four different methods treated platelets that can be easily distinguished through this flow cytometric assay.It not only makes sure the practicability of this flow cytometric assay,but also suggests the value of the treated platelets applied in preserved platelets flow cytometric assay.
K ey w ords flow cytometry;phosphatidylserine;CD62p;platelet preservation
目前还缺乏检测离体后血小板保存质量变化的流式细胞术,即包括检测磷脂酰丝氨酸(PS)在内的多参数分析方法。本研究建立三色法流式细胞术联合测定血小板膜表面PS和CD62p表达,分别反映血小板激活、血小板膜损害以及二者的相互关系,用以评价血小板在保存过程中的变化,并为血小板质量检测和血小板保存新方法研究提供方法学基础。
基金项目:本课题为国家自然科学基金资助项目 编号39970812 通讯作者:欧阳锡林 电话:(010)66937134;Email:Ouyang70@ https://www.wendangku.net/doc/4b10731050.html,.
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?中国实验血液学杂志 Journal of Ex perimental Hem atology2002;10(1):66-69
材料与方法
主要仪器和应用试剂
血细胞计数仪:M EK26180K型日本N I KON KOHDEN公司。FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)和CellQuest分析软件。抗CD61抗体: PerCP标记(Becton Dickinson)。抗CD62p抗体: RPE标记(PharMingen)。AnnexinⅤ(膜联蛋白Ⅴ):FLOUS标记(Boehringer Mannheim)。Hepes 缓冲液:Hepes10mmol/L;NaCl137mmol/L;KCl 2.8mmol/L;MgCl21mmol/L;CaCl25mmol/L; p H7.4。人凝血酶:10U/L(Sigma)。G ly2Pro2Arg2 Pro乙酸盐(GPRP):25mmol/L(Sigma)。改良TBS:(NaCl137mmol/L;KCl2.8mmol/L;MgCl2 1mmol/L;NaHCO312mmol/L;Hepes10mmol/ L;NaH2PO4014mmol/L;D2glucose515mmol/L; ED TA111mmol/L p H714)。
血液采集和血小板制备
室温(22℃左右)条件下,用ACD三联采血袋在3分钟内采集全血200ml,用于制备新鲜富含血小板血浆(FPRP)或用COB E Spectra血液分离机采集浓缩血小板(PC)。
血小板CD62p的表达和AnnexinⅤ结合率测定方法
标本处理步骤 血小板不需要洗涤,直接用T BS 将血小板浓度调至(2-4)×1011/L;将AnnexinⅤ原液解冻后,用Hepes缓冲液稀释为25μl/T est备用;其它荧光抗体直接取原液;在流式细胞术(FCM)专用管内加入GPRP5μl,抗CD615μl,抗CD62p5μl,An2 nexinⅤ25μl;血小板5μl;37℃避光孵育15分钟后;加Hepes缓冲液500μl。30分钟内上流式细胞仪测定。需要的对照包括:单纯血小板对照;单染抗CD61 PerCP;单染抗CD62p RPE对照;单染AnnexinⅤFLOUS对照;用于调补偿。
三色法流式细胞术结果分析方法 ①仪器校正:FACSCalibur流式细胞仪由CellQuest3.1支持,激发光采用488nm的激光,用Flow2Set beads(Bec2 ton Dickinson)对正、侧散射光和各项荧光参数进行分别校正。或用单纯血小板对照和各种单染(An2 nexinⅤFLOUS单染,抗CD62p RPE单染和抗CD61PerCP单染对照)调节FL1(AnnexinⅤFLOUS),FL2(CD62p RPE)和FL3(CD61PerCP)的荧光参数补偿后待用。②信息获得和存储:以SSC, FSC和CD61联合识别去除杂质后获取血小板。以300个/秒的速度获取5000-10000个血小板,对其FSC,SSC,FL1,FL2和FL3信息进行获取和储存,放弃其他杂质颗粒的信息。③阴性和阳性对照的选择:CD62p RPE阴性对照取RPE同型对照; CD62p RPE阳性对照采用新鲜富含血小板血浆经过1U/L凝血酶,37℃水浴15分钟制备的血小板; AnnexinⅤFLOUS阴性对照采用无Ca++HEPES (用1.1mmol/L ED TA替代CaCl2和MgCl2)缓冲液为反应介质;AnnexinⅤFLOUS阳性对照采用含5%DMSO的血小板直接投入液氮冻存2小时, 37℃复苏的样本。结合CD62p,AnnexinⅤ阴性和阳性对照设定FCM4格图的十字标记的位置。
方法学评价
重复性 随机取1份207mOsm TBS4℃处理15分钟的新鲜机采浓缩血小板标本,10分钟内连续重复测定10次。
稳定性 取含5%DMSO的机采浓缩血小板,以1℃/分钟降温至-15℃,保持15分钟,37℃复苏后平行为5份,分别在孵育完成后0,15,30,45,60, 75,90和105分钟测定。
激活剂、低温和低渗制备的膜表面分子特征不同的血小板
FPRP通过1U/L凝血酶37℃激活15分钟; FPRP通过将22℃含5%DMSO的血小板直接投入液氮冰冻2小时,37℃水浴复苏;FPRP通过血小板150mOsm低渗TBS22℃处理15分钟,恢复至等渗;与未处理血小板SSC2CD61p流式细胞术图比较,右下方新出现的血小板亚群。上述4种血小板利用上述建立的FCM方法进行分析。
结 果
阴性和阳性对照及随机1份样本的流式细胞术图
经检测,AnnexinⅤ和CD62p的阴、阳性对照及随机样本的FCM图,见图1-2。
重复性
随机取1份207mOsm TBS4℃处理15分钟的新鲜机采浓缩血小板标本,10分钟内连续重复测定10次,结果见表1。
稳定性
降温至-15℃维持5分钟,然后复苏的机采浓缩血小板,平行为5份按上述标本处理方法处理后0,15,30,45,60,75,90和105分钟测定结果,血小板CD62p和PS阳性率变化见图3。可见在105
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流式细胞术测定保存血小板表达的磷脂酰丝氨酸和CD62p
Figure 1 G raphs of negative and positive control for Annexin Ⅴand CD62p respectively.A :IgG 1RPE isotype control.B :CD62p RPE positive control.C :Annexin ⅤC a ++free negative control.D :Annexin Ⅴpositive
control
Figure 2 The flow cytometry analytic chat of random sample.
The cross marker w as decided b y the combination of positive and negative controls of CD62p 2RPE IgG 1monoclonal antibody and Annexin ⅤF LOUS.The active markers of platelets are CD62p positive and PS negative in U L ,CD62p and PS positive in UR,CD62p and PS negative in LL ,CD62p negative and PS positive in L R,respectively
T able 1 Flow cytometry analysis results of platelets measured repeatedly
Active marker of the platelets Percentage CD62p positive and PS negative 4.18±0.19CD62p and PS positive 45.74±0.51CD62p and PS negative 41.17±0.26CD62p negative and PS positive
8.91±0.37
Coefficient of variation value is 0.6-4.5
percent
Figure 3 CD62p and PS positive percentage of platelets after
the sample has been prepared
分钟内血小板CD62p 基本稳定,而PS 却逐渐升高。
膜表面不同标记分子特征的血小板分析图谱经检测,在膜表面分子特征不同的血小板分析图谱见图4。
讨 论
通常情况下血小板膜上的PS 仅位于细胞膜内层,在细胞膜外层几乎不表达。当细胞在某些因素作用下,PS 在细胞膜上重新分布,可以出现在细胞膜外层,以往文献多作为有核细胞凋亡过程中的膜表面标志物之一。本研究应用Annexin Ⅴ能与细胞膜表面PS 通过钙离子特异性结合,检测血小板胞膜内层PS 在胞膜外层的表达,作为保存血小板灵敏、稳定、可重复性好的激活标志物之一。CD62p 即血小板颗粒膜蛋白2140,也称P 选择素,是血小板α颗粒膜蛋白成分。血小板被激活时,细胞内α颗粒与质膜或与表面连接小管系统膜融合,CD62p 等即在质膜上表达,成为血小板激活标志物之一。
血小板膜表面PS 测定需要有钙离子参与,同时又有血小板和血浆成分存在,有可能发生血小板聚集成团或出现凝胶状凝块,尤其是深低温处理后的血小板促凝血活性明显增高,出现凝胶状块不可避免。一旦聚集或/和凝块出现,血小板FCM 定量分析就不能进行。虽然利用荧光显微镜和电镜等技术仍然可以观测到PS 阳性血小板[1,2],但是无法进行准确的FCM 定量分析。作者选用GPRP 完全阻止了血小板发生聚集及胶状凝块的出现。从FPRP 阴性对照看出GPRP 还可稳定血小板,减少人为影响,且不影响血小板表达PS 和CD62p 测定。这不但使血小板膜表面PS 表达测定成为可能,也使联合测定血小板膜表面PS 和血小板其他分子标记测定成为可能,尤其是为深低温保存血小板特性的流式细胞术分析提供了良好的方法基础。
?86?中国实验血液学杂志 J Ex p Hem atol 2002;10(1)
Figure4 G raphs of different characteristic platelets with its molecules.A:Fresh platelet2rich plasma.B:Thrombin actived platelets.C:Platelets directly dropped in liquid nitrogen then tha w ed.D:A new subpopulation generated from hypoosmotic treated platelets
保证分析结果准确性的首要前提是能够特异性获取血小板进行分析。本研究采用SSC,FSC和CD61[3]特异性识别获取血小板,并选择性地只对5000-10000个血小板的信息进行储存,大大减少了储存容量(约占传统方法的1/10),同时提高了方法的精确度。
在标本制备过程中,血小板不需要洗涤去除血浆即可直接用于分析,以避免人为激活。在孵育后的100分钟内,血小板表面CD62p基本稳定,而AnnexinⅤ的结合率却缓慢逐渐升高(图3),这就要求制备好的标本必须在15-30分钟内及时上机分析,或统一定于30分钟上机测定。同时需要特别注意的是,不能采用甲醛对血小板进行固定,因为我们发现常规的醛类固定可以造成血小板AnnexinⅤ结合呈阳性。
通过不同处理方法我们制备了4种膜表面分子标记显著不同的血小板。采用上述建立的FCM分析方法对其进行分析,图4的结果表明,各种血小板的显著特征为:FPRP CD62p和AnnexinⅤ双阴性率为99106%;凝血酶激活FPRP单纯CD62p阳性率为97107%,CD62p和AnnexinⅤ双阳性率为2123%,CD62p总阳性率为99130%;含5%的DMSO直接液氮冻存的血小板5%AnnexinⅤ阳性率为99171%;低渗处理后产生的血小板新亚群CD62p,AnnexinⅤ双阳性率为98.74,AnnexinⅤ阳性率为99.87%。以上分析说明本文建立的流式分析方法实用于分析多种不同特性的血小板,同时表明我们制备的4种不同特性的血小板可以为流式细胞仪分析提供标准的阴性、阳性对照,在流式细胞仪分析血小板特性的方法学中有重要的实用价值。
本文建立的方法不但可以用于同时测定各种保存血小板表面PS和CD62p的表达,评价血小板质量,更重要的是根据同时获得的血小板多种相关参数,包括FSC,SSC和PS再结合另一种血小板表面标记特征,可以用于血小板亚群分析。既可以分析血小板不同亚群的不同特性,而且可以监测新的血小板亚群的产生、消失和其它变化。可以方便地用于不同保存因素对血小板影响的研究。本文采用荧光标记物一步同时添加,克服了文献[4-6]报道的多步逐渐添加和一次分析单一指标的诸多不足,尤其是减少了测定过程对血小板人为的激活。
参考文献
1Tzima E,Trotter PJ,Orchard MA,et al.AnnexinⅤbinds to the actin2based cytoskeleton at the plasma membrane of activated platelets.Exp Cell Res,1999;251:185-193
2Trotter PJ,Orchard MA,Walker J H.Relocation of annexinⅤto platelet membranes is a phosphorylation2dependent process.Biochem J,1997;328(Pt2):447-452
3Modderman PW.Cluster report.CD61.In:Knapp W,Dorken B,
G ilks WR,et al.eds.Leucocyte Typing IV,White Cell Differenti2
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4Stuart MC,Bevers EM,Comfurius P,et al.Ultrastructural detec2 tion of surface exposed phosphatidylserine on activated blood platelets.Thromb Haemost,1995;74:1145-1151
5Trotter PJ,Orchard MA,Walker J H.Thrombin stimulates the intracellular relocation of annexinⅤin human platelets.Biochem Biophys Acta,1994;1222:135-140
6Matsubayashi H,Weidner J,Miraglia CC,et al.Platelet membrane early activation markers during prolonged storage.Thromb Res, 1999;93:151-160
(2001-06-29收稿;2001-11-23接受)
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流式细胞术测定保存血小板表达的磷脂酰丝氨酸和CD62p