酶联免疫法检测土壤二恶英的校正调节因子_张琨

第12O 期Environmental Science &Technology

第37卷第12O 期2014年12月

Vol.37No.12O

Dec.2014

张琨，邓芸芸，

梁艺怀，等．酶联免疫法检测土壤二口恶英的校正调节因子［Ｊ］．环境科学与技术，２０１４，３７（１２Ｏ）：３９１－３９５．ＺｈａｎｇＫｕｎ，ＤｅｎｇＹｕｎｙｕｎ，ＬｉａｎｇＹｉｈｕａｉ，ｅｔａｌ．Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｆａｃｔｏｒ（ＣＡＦ）ｏｆｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｍｅｔｈｏｄ（ＥＩＡ）ｉｎａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒｄｉｏｘｉｎ－ｌｉｋｅｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｓｏｉｌ［Ｊ］．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉ－ｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３７（１２Ｏ）：３９１－３９５．

酶联免疫法检测土壤二恶口英的校正调节因子

张琨，邓芸芸，梁艺怀，殷浩文

（上海市检测中心，上海201203）

摘要：酶联免疫法(enzyme immunoassay method,EIA)作为一种二口恶英物质的半定量筛选方法被越来越多的实验室使用。与经典的高分辩气相色谱-高分辨质谱法(high-resolution gas chromatrography coupled with high-resolution mass spectrometry,HRGC-HRMS)不同，ELISA 方法得到检测样本总二口恶英类物质的含量，两种方法之间存在偏差。文章引入校正调节因子（calibration adjustment factor,CAF ）来减少这种偏差。通过对本实验室前期工作中得到的47组土壤样品二口恶英数据进行统计分析，计算得到土壤来源二口恶英EIA 检测方法的校正调节因子为0.6。后期实验室进行崇明岛土壤二口恶英水平研究时，对得到的土壤样品EIA 检测结果使用本文得到的CAF 值进行校正，验证CAF 值的作用。校正前，两组数据之间存在显著性差异，校正后，数据相近，且无显著性差异。证明此CAF 值在土壤样品中的适用性。

关键词：二口恶英；酶联免疫方法（EIA ）；高分辩气相色谱-高分辨质谱法（HRGC-HRMS ）；校正调节因子（CAF ）；SPSS 中图分类号：X833

文献标志码：A

doi ：10.3969/j.issn.1003-6504.2014.12O.076

文章编号：1003-6504(2014)12O-0391-05

Calibration Adjustment Factor (CAF)of Enzyme Immunoassay Method

(EIA)in Analysis for Dioxin-like Compound in Soil

ZHANG Kun,DENG Yunyun,LIANG Yihuai,YIN Haowen

（Shanghai Academy Of Public Measurement,Shanghai 201203,China ）

Abstract ：An antibody-based method enzyme immunoassay method (EIA)and High-resolution gas chromatrography cou －pled with high-resolution mass spectrometry (HRGC-HRMS)were used for the detection and quantification of Dioxin-like compounds in 47soil samples of shanghai.We analysis the data obtained by HRGC-HRMS and EIA by using table “module A ”from Cape Technology and SPSS 16.0in this paper.Results showed that the calibration adjustment factor (CAF )of EIA for soil in our lab is 0.6.Calibration adjustment were applied to the raw quantitative data obtained from further study on in －vestigating Dioxin-like Compound in soil of Chongming island by CAF in this paper.When comparing the values from the two studies ,it is evident that the application of the CAF significantly improved most of the results,So the CAF has extensive usage in soil.

Key words ：dixion;enzyme immunoassay method (EIA);high-resolution gas chromatrography coupled with high-resolution mass spectrometry(HRGC/HRMS);calibration adjustment factor(CAF );SPSS

《环境科学与技术》编辑部：（网址）ｈｔｔｐ：／／ｆｊｋｓ．ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ．ｎｅｔ．ｃｎ（电话）０２７－８７６４３５０２（电子信箱）ｈｊｋｘｙｊｓ＠１２６．ｃｏｍ

收稿日期：2014-03-07；修回2014-05-05

作者简介：张琨（1985-），女，助理工程师，硕士，研究方向为生态毒理学，(电话)021-********(电子信箱)zhangk@https://www.wendangku.net/doc/4610880120.html, 。

二口恶英被广泛认为是目前已知最毒的物质，具有“三致”效应。它是一类在垃圾燃烧、意外火灾及化学制造等热反应中产生的三环芳香族有机化合物，由75种多氯代二苯-对-二口恶英和135种多氯代二苯并呋喃组成[1-2]。

酶联免疫方法(enzyme immunoassay method,EIA)方法是近年来用于二口恶英定量筛选的分析方法。该方法是根据鼠单克隆抗体DD3与二口恶英结合的特点而建立的竞争抑制酶免疫方法。使用酶竞争配合物

（HRP ）和样品中二口恶英共同竞争有限的DD3抗体的

特异性结合位点,以一系列不同浓度的2,3,7,8-TCDD 为标准物质，作出2,3,7,8-TCDD 标样与对应样品的剂量－效应曲线，样品中二口恶英毒性强度以计算出的TCDD 毒性等价浓度间接表示[3]。

EIA 方法与国际上通用的二口恶英类物质的定量方法HRGC/HRMS 相比具有成本低、分析时间短等优点[4]。但这种分析方法与化学分析方法相比最大的区别在于，EIA 的分析方法仅能给出二口恶英类物质总

第37

卷

体TEQ （Toxic equivalency ）值或总二口恶英类物质含量值，而不能给出每种二口恶英类物质在样品中的比例关系[5-7]。EIA 分析方法给出的TEQ 值是通过测定二恶英类物质标准品(已知TEF 值（toxic equivalency factors ）的混合物后，校正得到的[5]。此校正基于标准品，如果检测的目的为定性和半定量，则可直接通过Cape Technology 公司提供的计算表格Module C 计

算得到受试样品二口恶英物质的初始含量值，

并将这个初始值作为检测终点。如果检测的目的为绝对定量，则需要测试人员进一步确定CAF 值[8]。

这是因为二口恶英样品前处理的复杂性以及其他类似二口恶英类物质的交叉干扰性，都决定了二口恶英生物定量不能仅仅靠理想状态下的二口恶英标准品进行校正。现实中需要检测的二口恶英样品不同于标准品；不同基质类型的样品来源较广泛；含量较为复杂；，二口恶英类物质所占的比例往往不同，干扰因素差异较大[9]。因此，需要基于样品基质的类型来确定CAF 值，并在检测过程中提供验证数据支持。

为了生物方法在中国有更好的适用性，筛选结果更有效，本文对实验室多年累积数据进行分析，通过

CAPE Technology 提供的表格module A [10]，

计算得到土壤基质来源二口恶英EIA 检测的CAF 值。因表格module A 中，输入EIA 和HRGC/HRMS 原始数值后，直接得到基于输入数据的CAF 值及相关系数。无使用的统计方法及所得数值的统计学有效性验证。为佐证通过表格module A 计算得到的CAF 值的准确性，同时使用SPSS 统计软件进行CAF 值的计算及统计验证。同时根据实验室后续的研究对得到的CAF 值进行验证，确保其在土壤样品中具有广泛的适用性。2

材料与方法

2.1样品

2.1.1CAF 值计算数据来源

本文CAF 值计算使用的数据来源于上海市嘉定、南汇、宝山等地农业土壤样品，使用EIA 及HRGC/HRMS 两种方法检测得到的二口恶英含量数据，共47个。

2.1.2CAF 值验证数据来源

本文CAF 值验证数据来源于上海市崇明岛土壤样品，使用EIA 及HRGC/HRMS 两种方法检测得到

的二口恶英含量数据，

共31个。2.2样品分析方法2.2.1EIA 分析方法

以美国环保局USEPA4025方法为基础，通过萃取、多次硅胶柱纯化和碳柱净化的步骤提取样品，样

品分析采用酶联免疫检测方法,用标准样品作出标准

曲线,样品中PCDD/Fs 的含量通过标准曲线计算得出。空白样品、加标空白样品及加标样品等质量控制样品与样品同时测定,程序相同。标准曲线满足质量控制标准[3,11]。

2.2.2HRGC-HRMS 分析方法

以美国环保局USEPA1613方法为基础，所有样品加入15种13C 12-PCDD/Fs 提取内标,用ASE 抽提。样品提取液经氮吹浓缩后,依次通过酸性硅胶床（10g 30%酸性硅胶），用150mL 正己烷洗脱、多层硅胶柱，用正己烷洗脱和弗罗里土柱，用正己烷:二氯甲烷=1∶1洗脱,收集含有PCDD/Fs 的洗脱液,将洗脱液旋转蒸发浓缩,用高纯氮气浓缩后,加入回收率内标,密封待测.采用同位素稀释、高分辨气相色谱和高分辨质谱联用技术(HRC/HRMS)测定样品中的PCDD/Fs [12]。2.3数据分析方法

2.3.1Module A 数据表

此数据表由CAPE-Technologies 提供。2.3.2SPSS16.0数据处理

（1）对数据进行配对T 检验，期望识别两组数据是否存在显著性差异，从而确定两种二口恶英检测方法是否存在显著性差异。

（2）对参与CAF 值计算的数据进行相关性分析，期望得到两组数据的相关性系数，确定两者之间的相关关系。

（3）对参与CAF 值计算的数据进行线性回归分析，并对回归方程的有效性进行验证。3数据统计及CAF 值计算

3.1

试验结果

47个样本[2]经EIA 方法分析后得到未进行校正的原始值（下文称原始值）为0.75~12.28pg EIA-TEQ/g ，HRGC/HRMS 方法检测结果为0.6~72.56pg I-TEQ/g 。见表1。3.2CAF 值的计算

3.2.1使用module A 格计算CAF 值

使用CAF 校准表格module A 计算CAF 值，得到r =0.63，CAF =0.6。两种分析方法显著相关，具有线性关系，见图1。

3.2.2采用SPSS 统计软件计算CAF 值

使用SPSS16.0软件对EIA 及HRGC/HRMS （pg EIA-TEQ /g ）（MEAN ±SD ）。两组数据之间不存在显著性差异（P =0.293），见表2。

两组数据相关系数r =0.627，回归系数为β=0.627见表3。同时对回归方程的线性关系进行统计检验，包

３９２

第12O 期张琨，等酶联免疫法检测土壤二口恶英的校正调节因子

平均值

标准差t Sig.(双侧检验概率)

HRGC/HRMC

4.68a 11.2-1.07

0.293

EIA

3.09b

1.58

表2两种二口恶英检测结果基本统计表

注：a 单位为(pgI-TEQ /g);b 单位为(pg-TEQ /g)。

模型平方和F Sig.（显著性水平

）回归2254

29.1

0.000a

表4回归方程的显著性检验

注：a.Predictors:(Constant),EIA ；b.Dependent Variable:HRGCHRMC 。

模型标准化系数

T Sig.（显著

水平）B β

(Constant)-9.04-3.170.003EIA

4.44

0.627 5.39

0.000

非标准化系数Std.Error 2.850.823

表3回归系数表

表1二口恶英检测结果

样品流水号

EIA 检测原始值

（pg EIA-TEQ /g ）

HRGC-HRMS 方法结果

（pg I-TEQ /g ）

1 1.90 2.803 3.85 6.126 1.850.8215 2.500.78250.850.59300.900.8434 3.78 5.1036 5.858.0039 5.1

2 1.1241 4.68 1.504

3 3.62 3.0458 3.40 1.9960 2.48 1.9968 3.78 1.39Y1 1.28 2.78Y2 3.85 1.63Y3 2.32 1.81Y

4 2.82 1.85Y

5 1.52 3.07Y

6 2.400.95Y

7 2.820.64Y15 1.40 1.05Y1

8 1.40 1.92Y1

9 4.10 1.10J10.75 2.34J2 1.9211.4J38.9272.6J4 2.50 2.03J8 1.62 1.55J9 2.800.77J10 1.88 1.90J11 3.12 2.22J12 4.9829.3J13 5.00 2.12J17 3.08 2.36J18 2.28 1.99B2 2.28 1.26B5 1.200 1.18B7 5.3814.0B9 3.15 1.92B14 3.628.20B18 4.930.60B21 4.08 1.31B22 1.90 1.53B25 3.35 1.76B26 4.40 1.74B28

3.70

3.31

括回归分析的显著性检验、回归系数的显著性检验、

残差分析。

回归系数的显著性检验结果：t =-3.17，P <0.05(P =0.03),回归系数与零有显著性差别，方程成立。见表3。

回归方程的显著性检验采用方差分析的方法，分

析结果显示F =29.1，P <0.05(P =0.00)。回归系数与零有显著性差异，两种二口恶英检测方法的线性关系显著，见表4。

残差分析结果：标准化残差成正态分布，

散点在直线上或靠近直线，说明变量之间呈线性分布。见图2、3。

经Module A 及SPSS 16.0统计软件，得到本实验室土壤二口恶英EIA 方法与化学方法HRMS/HRGC 的校正调节因子CAF 均为0.6。4

CAF 值的有效性验证

为证明47个样品得出的CAF 是有效的，需要通过进一步的EIA 和HRMS/HRGC 比对数据证明。本实验室对崇明岛31个土壤样品[13]分别使用EIA 和HRMS/HRGC 进行二口恶英含量的测定，对CAF 值的有效性进行验证。使用CAF 值对EIA 方法得到的原始值进行校正，得到样品二口恶英EIA-TEQ 总含量

。

３９３

第37

卷

样品号EIA 检测结果HRGC-HRMS 检测

结果/pg ·g -1

原始值校正值/pg ·g -1

47 2.40 1.440.7848 3.03 1.820.7850 2.38 1.430.6351 3.08 1.850.8452 2.48 1.49 1.3254 2.35 1.410.6055 3.33 2.00 1.4456 3.28 1.97 1.2957 2.88 1.730.7858 3.40 2.04 1.3059 2.38 1.430.7360 2.70 1.620.5361 2.43 1.460.7462 2.28 1.370.7863 3.60 2.160.9564 2.68 1.61 1.4765 4.18 2.51 1.5266

2.48 1.49 1.9967

3.68 2.21 1.5668 3.78 2.27 1.0769 3.25 1.950.9170 3.05 1.830.7971 1.83 1.100.9472 2.78 1.67 1.6073 3.68 2.21 1.4074 2.85 1.710.9875 2.78 1.67 1.8776 2.05 1.230.7677 2.85 1.710.697980

1.85

2.08

1.111.25

1.101.14

表5崇明岛二口恶英检测结果

表5中列出31个土壤样品EIA 检测原始值（未

进行校正）、EIA-TEQ （乘以校正因子CAF =0.6）和WHO-TEQ 值。其中HRMS/HRGC 检测二口恶英总含

量为0.53~1.99pg WHO-TEQ /g ，

EIA 检测二口恶英含量原始值为1.83~4.18；

EIA 检测二口恶英总含量0.75~3.06pg EIA-TEQ /g 。

使用SPSS16.0软件对EIA 及HRGC/HRMS 检测方法得到的两组数据进行的T 检验。EIA 检测到的原始值与HRGC/HRMS 得到的二口恶英含量值相比具

有显著性差异

（P =0.035，P <0.05），而经过校正后无显著性差异（P =0.485，P >0.05）。

未经过校正前，EIA 分析与HRGC/HRMS 分析之间的回收率为264%；经过校正后，EIA 分析与HRGC/HRMS 分析之间的回收率为159%[14]。5结论

PCDD/Es 的生物检测方法具有快速、

灵敏、特异性强、操作简单、成本相对低的优点，作为筛选工具日益被接受[15]。虽EIA 的分析结果与HRGC-HRMS 两者之间具有较好的相关关系，但实际结果有一定的差距。为增加生物检测方法的使用范围，得到相对较高的阳性率数值，各个实验室需根据所得样品的基质类型及本实验室的实际情况确定CAF 值，对检测结果进行校正。本文通过对实验室前期工作的统计分析，得到土壤二口恶英EIA 检测方法的校正因子CAF ，CAF =0.6。

通过对崇明岛31个土壤样品EIA 方法得到的原始数据进行校正，并将校正前后两组数据与化学方法得到的数据进行比较，可知校正后EIA 数据有明显改进，更接近真值。证明了此CAF 值在土壤样品中的适用性。

由于二口恶英样品提取纯化过程的复杂性和不同类型的二口恶英样品成分组成的变化性，对不同类型（例如土壤、沉积物、飞灰）的样品需要对一定数据样品进行检测研究后确定不同的CAF 值。不适宜使用相同的CAF 进行计算。确定不同类型样品的CAF 值期待未来进一步的研究。

[参考文献]

[1]Arnold Sachecter,Linda Birnbaum,John J Ryan,et al.Consta

－

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第12O期

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

（上接第377页）

空气污染事件。

[参考文献]

[1]石元春.中国雾霾的产生机理及应对策略研究[J].陕西电力,

2013(4):1-4.

[2]贺泓,王新明,王跃思,等.大气灰霾的追因与控制[J].中国科

学院院刊,2013,28(3):344-351.

[3]丁一汇,李巧萍,柳艳菊,等.空气污染与气候变化[J].气象,

2009,35(3):3-15.

[4]师华定,高庆先,张时煌,等.空气污染对气候变化影响与反

馈的研究评述[J].环境科学研究,2012,25(9):974-980. [5]王自发,吴其重,Alex Gbaguidi,等.北京空气质量多模式集成

预报系统的建立及初步应用[J].南京信息工程大学学报:自然科学版,2009,1(1):19-26.

[6]王淑云,节江涛,熊险平,等.城市空气质量与气象条件的关

系及空气质量预报系统[J].气象科技,2006,34(6):688-692.

[7]张小玲,徐敬,李腊平.不同气象条件下烟花爆竹燃放对空气

质量的影响研究[J].气象与环境学报,2008,24(4):6-12. [8]王书肖,陈瑶晟,许嘉钰,等.北京市燃煤的空气质量影响及

其控制研究[J].环境工程学报,2010,4(1):151-158.

[9]Zhang Yunhai,Wang Yangfeng,Hong Ye,et al.Analysis of

the characteristics of typical haze in winter[J].Atmospheric Physics and Atmospheric Chemistry,2010,1(4):18-20,51. [10]Dutcher D D,Perry K D,Cahill T A,et al.Effects of indoor py－

rotechnic displays on the air quality in the Houston astrodome [J].Journal of the Air and Waste Management Association, 1999,49:156-160.

[11]洪盛茂,何曦,祁国伟,等.杭州市区春节期间空气质量变化

特点[J].气象科技,2003,31(6):340-344.

[12]周伟东,梁萍.风的气候变化对上海地区秋季空气质量的可

能影响[J].资源科学,2013,35(5):1044-1050.

张琨，等酶联免疫法检测土壤二口恶英的校正调节因子

ble dioxin:an overview[J].Environmental Research,2006,101: 419-428.

[2]Li Kang,Rong Zhiyi,Deng Yunyun,et al.Research and prac－

tice of regional dioxin screening and cofirmation technology [J].Research of Environmental Sciences,2009,2(7):799-804.

[3]Li Wen,Xu Ying,Wu Wenzhong,et al.A new enzyme im－

munoassay for TEQ screening of dioxin/furan in environmen－tal samples[J].Environmental Science,2000,21(4):69-72. [4]J-F Focant,G Eppe,E De Pauw.Optimistion and use of tandem-

in-time mass spectrometry in comparison with immunoassay and HRGC/HRMS for PCDD/F screening[J].Chemosphere, 2001,43:417-424.

[5]Fatin Samara,Brian K Gullett,Robert O Harrison,et al.Deter－

mination of relative assay response factors for toxic chlorinat－ed and brominated dioxins/furans using an enzyme immunoas－say(EIA)and a chemically-activated luciferase gene expres－sion cell bioassay(CALUX)[J].Enviroment International, 2009,35:588-593.

[6]Malin Nording,Michael S Denison.Analysis of dioxins in con－

taminated soils with the CAULX and caflux Bioassays,an im－munoassay,and gas chromatography/high-resolution mass spectometry[J].Environ Toxicol Chem,2007,26(6):1122-1129.

[7]Cape Technologies(2003)Insert for DF1dioxin/furan im－

munoassay kit.https://www.wendangku.net/doc/4610880120.html,.Accessed14May 2009.(2008):35-37.

[8]Cape Technologies(2003)Insert for TN-004dioxin/furan im－

munoassay kit.https://www.wendangku.net/doc/4610880120.html,.Accessed14May 2009.[9]Eric Buan,Ching Lo,Wei Zhang,et al.Correction of discrep－

ancies in dioxin quantification between immunoassay and gas chromatography-high-resolution mass spectrometry[J].Anal Bioanal Chem,2010,398:2233-2241.

[10]Cape Technologies.Insert for Module A dioxin/furan im－

munoassay[DB/OL].kit.https://www.wendangku.net/doc/4610880120.html,.Accessed 14May2009.

[11]US EPA.Method4025:Screening for Polychlorinated Diben－

zodixins and Polychlorinated Dibenzofurans(PCDD/Fs)by Immunoassay[R].Washington DC:US Enviromental Protec－tion Agency,2002;1-20.

[12]US EPA.Method1613.Revision B:Tetra-thru Octa-chlori－

nated Dioxins and Furans by Isotope Dilution HRGC/HRMS [R].Washington DC:US Enviromental Protection Agency, Office of Water,1994:1-86.

[13]Deng Y,Jia L,Mao W,et https://www.wendangku.net/doc/4610880120.html,binatorial bio/Chemical

Analysis of PCDD/Fs in Agricultural Soils from Chongming Island in Shanghai,China[C].The33rd International Sympo－sium on Halogenated Persistent Organic Pollutants and POPs (Dioxin2013).

[14]US EPA Performance of the CAPE Technologies DF1Dioxin/

Furan Immunoassay Kit for Soil and Sediment Samples[R].

Washington DC:US Enviromental Protection Agency,Office of Research and Development,2005:1-110.

[15]Eric J,Reiner Ray E,Clement Allan B,et al.Advances in ana－

lytical techniques for polychlorinated dibenzo-p-dioxins, polychlorinated dibenzofurans and dioxin-like PCBs[J].Anal Bilanal Chem,2006,386:791-806.

３９５