北京雷根生物技术有限公司
Western一抗稀释液
产品简介:
Western一抗稀释液(Primary Antibody Dilution Buffer)可以用于免疫印迹中的一抗的稀释和配制。使用Leagene Western一抗稀释液配制的一抗,可以在4℃保存6个月,并且可以反复多次使用。
产品组成:
操作步骤(仅供参考):
1、根据一抗的使用说明,以及样品中目的蛋白含量,按照适当比例(例如1:1000、1:500
等比例)稀释一抗。
2、一抗稀释后即可直接用于Western孵育膜。一次Western结束后,可以回收稀释的一
抗4℃保存,用于下次Western实验。
注意事项:
1、为了能使抗体可以反复多次使用,建议尽量在4℃条件下进行一抗和蛋白膜的结合反
应,以减缓一抗的衰减速度。
2、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期:6个月有效。
相关产品:
产品编号 产品名称
PE0081Tris-HCl缓冲液(1.5mol/L,pH8.8)
PE0103丙烯酰胺:亚甲基双丙烯酰胺溶液(30%Acr-Bis,29:1)
PS0008通用细胞裂解液
PT0001BCA法蛋白定量试剂盒
PW0041Western blot二抗稀释液
PW0046Western封闭液
PW0084丽春红S染色储存液(10×Ponceau S)
良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节,每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果,因此,要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题,但从染色的结果看,一般可分为两类:无色片(即无阳性信号)和“杂音”染色片(有阳性信号)。 一、无色片 染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象,出现这种现象,有两种可能:1、真阴性结果:整个染色过程没有出现问题,组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果:即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况:(1)、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况,要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了,要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明:制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事,病理医生也起着不可缺少的作用。(2)、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如,组织未进行抗原修复,有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达;或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;或一抗失效,虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程,但偶尔也遇到突然失效的情况,抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节,如忘记加二抗或三抗,或用了两次二抗而缺少了三抗,或配制DAB时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误,有一种简单的方法:在三抗孵育结束时,将切片上的三抗甩在一张白纸上,在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号,问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应,问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。 解决阴性染色的问题非常简单,就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达,说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性,便是真实的阴性,说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之,如果阳性对照没有着色,表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种,一种称为“自身对照”或“内部对照”,这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原,如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原,CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照,对照和测试组织或细胞都在同一张切片中,都处于相同的试验条件下,结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分,这样有利于对比。另一种称为“外部对照”,有时在测试的切片中不存在已知的抗原,如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤,需要用HMB45或Mart-1来检测,在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原,如果病变出现阳性反应结果,尚能提示是恶黑,但是如果出现阴性结果,就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原,还是技术问题。因此,应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多,如果每一种抗体都要选不同的阳性对照,工作量会很大。为了解决这个问题,目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起,制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等,其连续切片储备待用,需要时取出一张便可作为阳性对照。另外,比较简单的方法,是采用阑尾作为阳性对照,因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多,如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。 设立阳性对照是病理医生的任务或责任,而不是技术员的责任。病理医生观察了HE切片,了解切片中是否有自身对照,如果没有,就应告诉技术员采用阳性对照。因此,病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。 抗体未覆盖上测试组织:当多块散开的小组织染色时,可能漏掉某块组织染色。 二、“杂音”染色片 免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色,这些非正常的着色称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多,产生的原因也多种多样,为了便于说明,笔者将其归纳为下面几种 1、全片着色
常用填充剂的分类与应用 来源:塑料论坛(https://www.wendangku.net/doc/4410990127.html,) 3.填充剂的分类 1. 根据其来源通常分为矿物性、植物性填料和工业性填充剂。后者可分为合成型和废渣型。 2.根据其形状分为粉末状、球状、片状、柱状、针状及纤维状填充剂。 3.根据其效能分为增量型、补强型及功能型填充剂。 4.根据其化学组成分为无机填充剂和有机填充剂。 常用填充剂分类 1.碳酸钙类填充剂 (1)普通碳酸钙(白垩):白色晶体或粉末,比重2.70-2.95,溶于酸而难溶于水。在以二氧化碳饱和的水中辩解而成碳酸氢钙,加热到825℃分解为氧化钙和二氧化碳。 天然产的碳酸钙矿物有石灰石、方解石、白灭、大田石等,将它们磨成粉后叫为普通碳酸钙。它们又有干解与湿磨之别,粒径在1.5-44微米之间,干磨者粒度大于20微米而湿磨者小于20微米。 (2)沉淀碳酸钙:用二氧化碳通入石灰水或碳酸钠溶液与石灰水发生沉淀作用生成的粉状碳酸钙,一般分为: 轻质沉淀碳酸钙:比重2.50-2.60 重质沉淀碳酸钙:比重2.70-2.80 沉淀碳酸钙粒径为1.0-16微米,比表面积为5-25米2/克,折光率1.49,PH值10左右,不溶于水和醇,遇酸放出二氧化碳;有轻微吸湿性。 (3)活性轻质碳酸钙(白艳华):这是一种粒子表面吸附一层脂肪酸皂的轻质碳酸钙,无味无嗅的白色粉末,比重1.99-2.01。水分在0.5%以下,硬脂酸含量2-5%,粒径小于0.1微米,比表面积25-28米2/克,折光率1.49。不溶于水和醇,遇酸分解放出二氧化碳,在空气中放置无化学变化,只有轻微吸湿能力。活性比普通碳酸钙大,略具有增强作用。 2.炭黑类填充剂 这类填充剂包括各种炭黑。炭黑是以液体或气体碳氢化合物为原料,在空气不足的条件下经部分燃烧或热分解所生成的产物。炭黑的元素组成主要是碳,只含有少数氢和氧,是具有“准石墨晶体”构造和胶体粒径范围的黑色粉状物质。
免疫组化染色过程中存在的问题、原因分析及对策 良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节,每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果,因此,要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题,但从染色的结果看,一般可分为两类:无色片(即无阳性信号)和“杂音”染色片(有阳性信号)。 一、无色片 染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象,出现这种现象,有两种可能:1、真阴性结果:整个染色过程没有出现问题,组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果:即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况:(1)、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况,要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了,要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明:制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事,病理医生也起着不可缺少的作用。(2)、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如,组织未进行抗原修复,有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达;或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;或一抗失效,虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程,但偶尔也遇到突然失效的情况,抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节,如忘记加二抗或三抗,或用了两次二抗而缺少了三抗,或配制DAB时少了
过氧化氢。为了避免这种简单的错误,有一种简单的方法:在三抗孵育结束时,将切片上的三抗甩在一张白纸上,在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号,问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应,问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。 解决阴性染色的问题非常简单,就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达,说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性,便是真实的阴性,说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之,如果阳性对照没有着色,表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种,一种称为“自身对照”或“内部对照”,这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原,如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原,CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照,对照和测试组织或细胞都在同一张切片中,都处于相同的试验条件下,结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分,这样有利于对比。另一种称为“外部对照”,有时在测试的切片中不存在已知的抗原,如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤,需要用HMB45或Mart-1来检测,在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原,如果病变出现阳性反应结果,尚能提示是恶黑,但是如果出现阴性结果,就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原,还是技术问题。因此,应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多,如果每一种抗体都要选不同的阳性对照,工作量会很大。为了
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织得采集、固定与保存: 采取组织后, 方法一:4%多聚甲醛(4%PFA)4?C固定1小时(根据组织大小与致密程度调整固定时间)或过夜 方法二:采用bouin’s固定RT 2h(6—8dtesis)or RT过夜(成年tesis) PBS缓冲液洗三次,每次5min,4?C保存于70%乙醇中。 2、组织得包埋、切片、展片及保存:: 固定后得样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,52-54?C石蜡包埋,常规切片,切片厚4—10μm,贴于处理过得干净载玻片上,37?C烤片过夜,之后收集于载片盒中,RT密封保存。 石蜡包埋: 保存于4?C70%乙醇中得组织样品 ↓ 80%乙醇15min ↓ 95%乙醇15 min ↓ 100%乙醇15min? 2 ↓ 1/2乙醇1/2二甲苯15 min ↓ 二甲苯透明5-10 min ↓ 1/2二甲苯1/2石蜡30 min
↓ 石蜡(1) 1。5hr ↓ 石蜡(2) 1.5-2.5hr ↓ 石蜡(3) 包埋 ↓ RT保存 3、石蜡组织切片得免疫组化方法: 密封保存于RT得组织切片 ↓ 二甲苯(1) 20 min ↓ 二甲苯(2)20min ↓ 100%乙醇20min ↓ 95%乙醇10 min ↓ 80%乙醇10min ↓ 通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈 ↓ 切片在PBS中浸泡 5 min*2 ↓ 0.4%Tritonx RT10 min ↓ 切片在PBS中浸泡 5 min*3 3%H2O2 RT 10min
切片在PBS中浸泡5min*3 0、25%胰酶RT 10min 切片在PBS中浸泡 5 min*3 Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0、2%Tritonx—100 in PBS) RT 60min 倾去blocking buffer,勿洗 一抗4 C overnightin blockingbuffer 取出切片复温1h,切片在PBS中浸泡 5 min*3 二抗inblocking buffer GAR1:200 (GAM1:100),R T 1h 切片在PBS中浸泡5min*3 DAB显色5—10min(50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2) 如果就是增强型DAB只要1min即可。 切片浸入PBS终止显色,HE衬染1s, 玻片架放入泡沫盒,流水冲洗15min,肉眼瞧到淡淡得紫色即可停止。 若颜色太深,可用0、1-0、5%盐酸乙醇分色1~2秒钟(或更久)
自动化免疫组化染色机种类介绍 免疫组化的传统技术正在受到新的快速高敏的新技术的挑战,一方面是新试剂的推出,如SP、EPOS、Envision和CSA,另一方面是自动免疫组化染色机的问世。免疫组化技术正进入一个新的发展阶段。从先进国家免疫组化规范化或标准化的进程来看,自动免疫组化染色机的应用几乎贯穿始终,早在20世纪末已得到极大的普及,然而国内的自动免疫组化染色机应用则在近几年才得以发展。浙江省肿瘤医院作为省内较早应用的少数单位之一,在自动化免疫组化染色的使用和质量控制方面获得些许经验,在此做简单的介绍交流。 自动化免疫组化染色技术是由电脑控制整个染色程序的免疫组化染色机,具有自动加抗体、自动冲洗、显色、复染及预处理等功能,有全自动和半自动、封闭型和半开放型之分。根据不同仪器大小,每次染色20~240张切片不等,整个染色程序约需60~90min左右,它不仅可以应用于免疫组化染色,某些仪器还可应用于组织化学染色、特殊染色及原位分子杂交染色。目前较为理想的仪器为Roche公司、Lecia公司及Thermo公司的产品等。下面对不同机型的自动免疫组化染色机的特点分述如下。 Thermo公司的LabVision Autostainer 该机型属开放式半自动系统类型,用户可任意编辑所需试剂及模板,内建试剂兼容性检测。切片特殊染色模板可任意调整试剂量、孵育时间。体系开放保证可适就性强,即可同时运行不同检测试剂盒和不同的染色程序及不同厂商生的的一抗。使用单一探头,探头材料为特氟伦包被不锈钢,检测探头交叉污染残留物 <10-6 ,且分样精度>99%(总体积)。联合使用配套的抗原修复仪,可实现脱蜡与抗原修复一步完成。DAKO公司的 Autostainer系LabVision Autostainer贴牌产品,配合使用DAKO的Flex检测系统可获得极为敏感的免疫组化结果。早期的Biogenex i6000TM全自动染色仪亦属该类型产品,不同的是其加样头采用标准的Tip头加样,完全避免交叉污染的风险。 Lecia公司的Bond-Max
药剂浓度表示法及稀释计算方法 农业生产中常用的药剂浓度表示法有百分浓度、百万分浓度和倍数浓度等。百分浓度(%)是指在一百份药液中含有药物有效成分的份数。如80%敌敌畏乳油内含有敌敌畏80%,有机溶剂及乳化剂20%;百万分浓度(ppm)是指在一百万份药液中含药物有效成分的份数,常用于使用浓度较低的植物激素等药物的表示;倍数浓度即药液中稀释剂的量为原药品加工品量的倍数,一般不能直接反映出药品的有效成分的稀释倍数。在100倍以下浓度的稀释计算中,应减去药剂所占的一份,如50倍稀释时,即用原药1份加水49份而成;在100倍以上稀释时,不必减去原药的份数,如1000倍稀释,即用原药1份加水1000份而成。 在生产中常常要涉及到几种浓度之间的换算问题。 百分浓度和百万分浓度的换算 百万分浓度(ppm)=百分浓度(%)×10000,即百分之几有效成分的药剂就是几万个ppm的药剂。 倍数与百分浓度、ppm之间的换算 原药剂浓度 百分浓度(%)=×100 稀释倍数 例25%的多菌灵稀释至500倍,稀释后药剂的百分浓度和ppm 浓度各是多少?
25×100=0.05%,百分浓度为0.05%;5000.05×10000=500,百万分浓度为500ppm。 药剂浓度稀释的计算方法有按成分计算、按倍数计算和十字交叉法计算等。 按有效成分计算 求稀释剂的用量 原药剂重量×原药剂浓度 稀释剂用量=所配药剂浓度 例:用40%矮壮素水剂50克,稀释成500ppm药液,应加多少水? 50×400000(PPM) 400000(克)400公斤,即应加水400公斤. 求用药量 所配药剂重量×所配药剂浓度 原药剂用量=原药剂浓度 例:用40%乐果配制400ppm的药液100公斤,要原药量多少? 100×400=0.1公斤,即需40%乐果0.1公斤。 400000 按倍数法计算 求稀释剂用量 稀释剂用量=原药重量×稀释倍数(-原药重量)
涂料和油漆稀释剂配方公司内部编号:(GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-
涂料、油漆稀释剂配方 配方1涂料、油漆的无苯稀释剂 脂肪烃 40%~60% 脂肪醇 15%~20% 有机酸酯 25%~40% 脂肪酮 3%~6% 描述配方中的脂肪烃为200#溶剂汽油和沸点小于100℃的直馏汽油 [1:(4~],脂肪醇为丁醇和乙醇[1:(2~3)],有机酸酯为乙酸乙酯和乙酸丁酯[1:(3~6)],脂肪酮为丙酮。本配方的最佳配比为脂肪烃:脂肪醇:有机酸酯:脂肪酮=1:::。工艺流程:溶剂油(脂肪烃)一脂肪醇~搅拌一有机酸酯一脂肪醇~脂肪酮一搅拌一静止~成品。本剂毒性低,有利于劳动保护和环境保护,采用本剂的涂料在施工过程中具有良好的抗潮性能,涂膜光洁度较好。本剂的通用性好,能作各种溶剂型涂料(硝基、氨基、过氯乙烯、环 配方2香蕉水 甲苯 54份 丁醇 10份 乙酸杂酯 37份 描述本配方即60L稀释剂,为无色透明液体,有类似香蕉的气味,主要用作硝基清漆的溶剂、某些油漆的稀释剂或溶剂,还可用作某些电器具焊接前的表面清洁剂。配制时,将上述各组充分混匀即成。如作为产品出售,则酸值应≤g。配
方中的乙酸杂酯是酯类生产中的低沸物,但也可用下述方法制取:取戊醇低沸物(88~92℃)加乙酸静置酯化,弃去酸水即可。配比为低沸物15份,乙酸份。 配方3硝基漆稀释剂(一) 乙酸丁酯 20份 乙酸乙酯 20份 丁醇 16份 甲苯 44份 配方4硝基漆稀释剂(二) 乙酸丁酯 25份 乙酸乙酯 18份 丙酮 2份 丁醇 10份 甲苯 45份 配方5硝基静电喷漆稀释剂(一) 乙酸丁酯 30份 二丙酮醇 13份 二甲苯 20份 甲苯 8份 丁醇 27份 配方6硝基静电喷漆稀释剂(二) 乙酸乙酯 15g 乙酸丁酯 24g
免疫荧光技术的实验方法及其分类 一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮,检测产物发出的荧光,荧光强度与Mb浓度呈正比,可在8min 内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好,线性范围宽,具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例,首先将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体。除去未结合抗体,然后加受检标本,使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物,接着加入荧光标记的抗体,使之与抗原特异性结合,形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度,即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大,时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕,作为标记物,加入正常液后激发测定,能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法 放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原,竞争性地与抗体结合,形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物,并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法,将抗原—抗体复合物与游离抗原分离,分别测定其放射性强度与标准曲线比较,即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强,可准确定量到ng/ml 水平。但早期的方法操作麻烦,耗时长,且有放射性污染。近年来,随着单克隆抗体的应用,RIA的灵敏度又有了较大提高,且操作大为简化,并已有商品试剂盒供应,使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立,该法的最低检测限为10μg/L,线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA 法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高,特异性强,精密度好,操作简单,适用于多份标本的检测,不需特殊仪器设备等优点,易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
石蜡切片免疫荧光染色方 法 Prepared on 22 November 2020
对于石蜡切片: 1、烤片:60℃ 60分钟 2、脱蜡:二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70%乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复:高压修复,事先烧开锅中的水,修复盒中加入l柠檬酸钠,(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中),上汽后加热10分钟,关火。修复盒取出,放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶:玻片取出放入湿盒,加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏 水中,现配现用,避光),室温孵育10分钟,PBS洗3次,每次5分钟。(也可不用去除内源性酶)。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清(原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子),室温孵育封闭30分钟。如果背景较高,可以4℃封闭过夜。不用洗,用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤,一定要注意样品的保湿,避免样品的干燥,否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书,按照适当比例用(10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS)稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗, 4℃过夜,第二天取出复温45分钟。PBS洗3次,每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用稀释荧光标记的二抗,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
涂料、油漆稀释剂配方 配方 1 涂料、油漆的无苯稀释剂 脂肪烃 40%~60% 脂肪醇 15%~20% 有机酸酯 25%~40% 脂肪酮 3%~6% 描述 配方中的脂肪烃为 200#溶剂汽油和沸点小于 100℃的直馏汽油 [1:(4~6.5)],脂肪醇为丁醇和乙醇[1:(2~3)],有机酸酯为乙酸乙酯和乙酸 丁酯[1:(3~6)],脂肪酮为丙酮。本配方的最佳配比为脂肪烃:脂肪醇: 有机酸酯:脂肪酮=1:0.4:0.6:0.1。工艺流程:溶剂油(脂肪烃)一 脂肪醇~搅拌一有机酸酯一脂肪醇~脂肪酮一搅拌一静止~成品。本剂毒性 低, 有利于劳动保护和环境保护,采用本剂的涂料在施工过程中具有良好 的抗潮性能, 涂膜光洁度较好。 本剂的通用性好, 能作各种溶剂型涂料 (硝 基、氨基、过氯乙烯、环 配方 2 香蕉水 甲苯 54 份 丁醇 10 份 乙酸杂酯 37 份 描述 本配方即 60L 稀释剂,为无色透明液体,有类似香蕉的气味,主要用作硝 基清漆的溶剂、 某些油漆的稀释剂或溶剂,还可用作某些电器具焊接前的表面清 洁剂。配制时,将上述各组充分混匀即成。如作为产品出售,则酸值应 ≤0.5mgKOH/g。配方中的乙酸杂酯是酯类生产中的低沸物,但也可用下述方法
制取:取戊醇低沸物(88~92℃)加乙酸静置酯化,弃去酸水即可。配比为低沸物 15 份,乙酸 10.05 份。 配方 3 硝基漆稀释剂(一) 乙酸丁酯 20 份 乙酸乙酯 20 份 丁醇 16 份 甲苯 44 份 配方 4 硝基漆稀释剂(二) 乙酸丁酯 25 份 乙酸乙酯 18 份 丙酮 2 份 丁醇 10 份 甲苯 45 份 配方 5 硝基静电喷漆稀释剂(一) 乙酸丁酯 30 份 二丙酮醇 13 份 二甲苯 20 份 甲苯 8 份 丁醇 27 份 配方 6 硝基静电喷漆稀释剂(二) 乙酸乙酯 15g 乙酸丁酯 24g
对于石蜡切片: 1、烤片:60℃ 60分钟 2、脱蜡:二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70%乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复:高压修复,事先烧开锅中的水,修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠,pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中),上汽后加热10分钟,关火。修复盒取出,放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶:玻片取出放入湿盒,加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏水 中,现配现用,避光),室温孵育10分钟,PBS洗3次,每次5分钟。(也可不用去除内源性酶)。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清(原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子),室温孵育封闭30分钟。如果背景较高,可以4℃封闭过夜。不用洗,用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤,一定要注意样品的保湿,避免样品的干燥,否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书,按照适当比例用免疫染色一抗稀释液(10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS)稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗, 4℃过夜,第二天取出复温45分钟。PBS洗3次,每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 PBS洗涤3次。每次5分钟。如果结果背景较高,可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
对于石蜡切片: 1、烤片:60C 60分钟 2、脱蜡:二甲苯中I脱蜡15分钟—二甲苯H脱蜡15分钟—无水乙醇 I 5分钟 —无水乙醇H 5分钟—90%乙醇I 5分钟—90%乙醇H 5分钟—70%乙醇5分钟 —蒸馏水5分钟—蒸馏水5分钟。 3、抗原修复:高压修复,事先烧开锅中的水,修复盒中加入0.01mol/l 柠檬酸钠,pH6.0(柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g加入1000ml蒸馏水中),上汽后加热10分钟,关火。修复盒取出,放入装有自来水的瓷 缸中缓慢冷却至室温。 2.去除内源性酶:玻片取出放入湿盒,加3%HO2 (2ml H 202加入 18ml蒸馏水中,现配现用,避光),室温孵育10分钟,PBS洗3次, 每次5分钟。(也可不用去除内源性酶)。 3.封闭(Blocking) 加10%E常驴血清(原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子),室温孵育封闭30分钟。如果背景较高,可以4C封闭过夜。不用洗,用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤,一定要注意 样品的保湿,避免样品的干燥,否则极易产生较高的背景。 4.一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考- -抗的说明书,按照适当比例用免疫染色一抗稀释液(10%山羊血清PBS或1%BSA-PB)稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗,4 C过夜,第二天取出复温45分钟。PBS洗3次,每次5分钟。 5.二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗, 立即加入稀释好的二抗,室温或4C在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小 时。 PBS洗涤3次。每次5分钟。如果结果背景较高,可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 6.蛋白检测(Detection of proteins) 对于免疫荧光染色,此时已经可以直接到荧光显微镜下观 察。 7.复染 用DAPI对细胞核进行染色,室温10分钟,PBS中洗5分钟X 3次,封片(封片剂或分析纯的甘油与0.5molpH9.5碳酸缓冲液1:1混合) 显微镜观察,染色后为蓝色荧光。 多重荧光染色:可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色。例如用免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Cy3(P0193)进行红色荧光染色,随后可以用免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC(P0186) 进行绿色荧光染色,在完成上述两种染色后可以使用Hoechst染色试剂盒(C0003)对细胞核进行染色,染色后为蓝色荧光。 0.5molpH9.5碳酸缓冲液配方: NaHC03 3.7g Na2CO3 0.6g 双蒸水溶解至100ml,调节pH至9.5
病理免疫组化染色方法质量控制应注意 的问题 (作者:_________ 单位:___________ 邮编:___________ ) 【关键词】免疫组化;质量;染色 免疫组化可以辅助病理诊断、指导治疗、评估预后,所以在做免疫组化过程中的质控问题处理尤其重要[1 ]。随着免疫组化试剂新种类不断出现及方法的改进,特别是即用型试剂盒的出现,使抗体的标记更加简便、快捷,更加规范化。免疫组化标准化染色技术是一项实验性很强的技术,任何一个环节出现问题,都可以直接影响免疫组化结果 :2]。因此,本文就免疫组化标准化染色质量的应注意的问题报告如下。 1组织固定 及时、恰当、完好的固定是制作好的组织切片的基础。组织固定的好坏是影响免疫组化结果的关键因素。固定的目的之一是最大限度地保存组织细胞的抗原性。组织标本离体后30 min内应进入固定液或低温保存,固定时间为8?24 h。固定液为10%中性缓冲甲醛溶液,固定液的
2抗原修复 物质所具有的抗原性主要由分布在抗原表面的抗原决定簇决定。固定液的固定对免疫组化的正确结果极其重要,此液能使抗原保存良好。抗原修复的好坏直接影响着免疫组化检测结果的可靠性。在进行免疫组化时并非所有的抗原都要进行抗原修复,抗原性保存良好或基 本保存者不需要修复。目前抗原修复的方法主要有蛋白酶消化法、硼氢化钠(NaBH4修复法和热修复法。最常用的是热修复法,尤其是细胞核抗原经热修复后,其染色效果特别好。热修复包括单纯加热、高压加热和微波加热3种,其原理是以热效应来引导抗原决定基重新暴露。热修复法影响抗原修复的关键因素有两个:一是温度,至少要达到100 C ,时间3?15 min;二是修复液的pH值为7.5?8.5。所以我们必须清楚影响抗原的因素及各种抗原修复的方法,严格按照抗体说明书进行抗原修复。鉴于抗原修复的方法较多,在实际工作中,究竟选用何种抗原修复,应根据抗体种类予以选择,必要时可以多种方法同时使用,这样使其更具有针对性,标记结果更理想。组化染色结果有很大影响。 3 免疫组化 免疫组化技术是利用已知的特异性抗体或抗原特异性结合的特点,通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂通过借助显微镜的
https://www.wendangku.net/doc/4410990127.html, 稀释剂及稀释剂参考配方 建筑涂料在生产过程中为了某些性能的要求,在工厂生产时可能将黏度调整得较高,需要稀释后才能适合于涂装。例如,为了防止沉淀分层,合成树脂乳液涂料都是将黏度调整得很高,在施工时必须加水稀释。此外,某些涂料经过较长时间的贮存后,其黏度也可能会提高,在涂装时也需要进行稀释。因而,许多涂料都配套有稀释剂或在其产品说明书中说明使用何种稀释剂进行稀释,以便将涂料的黏度调整得符合涂装要求。对于水性涂料来说,稀释剂就是水,但要求所使用的水要清洁、无杂质和化学成分;对于溶剂型涂料来说,稀释剂一般需要与涂料配套。对稀释剂的性能要求是色泽要浅,以便不会影响涂料的颜色,毒性要小,不会对施工人员造成健康危害,成本相对要低。不同的涂料往往要求不同的稀释剂,没有通用的稀释剂。常用的商品类稀释剂有松香水,香蕉水、天那水等。因而,稀释涂料时,或者使用涂料的配套稀释剂,或者按照涂料说明书中指定的稀释剂品种进行稀释。下面介绍一些常用稀释剂的组成。 (1) 硝基漆用稀释刺硝基漆用稀释剂通常称为香蕉水,是因其组成中含有气味类似于香蕉气味的醋酸丁酯而得名。 ①配方1 醋酸丁酯25%;醋酸乙酯18%;丙酮2%;丁醇10%;甲苯40%。 ②配方2 醋酸丁酯18%;醋酸乙酯14%;乙醇8%;丁醇10%;甲苯50%。 ③配方3 醋酸丁酯20%;醋酸乙酯20%;丁醇16%;甲苯44%。 (2)油基漆稀释剂一般采用200#溶剂汽油或松节油即可。若涂料中的树脂含量较高而油含量低,则可以将200#溶剂汽油和松节油混合使用,并加入少量的二甲苯或醋酸丁酯。 (3)酵酸树脂漆稀释剂酵酸树脂漆稀释剂主要是200#溶剂汽油和二甲苯。长油度的醇酸树脂漆可以使用200#溶剂汽油稀释;中油度的醇酸树脂漆可以使用200#溶剂汽油和二甲苯按l:l混合进行稀释;短油度的醇酸树脂漆可以使用二甲苯稀释。 (4)氨基漆稀释剂 ①配方1 丁醇50%;二甲苯50%。 ②配方2 醋酸丁酯10%;丁醇10%;二甲苯80%。 (5)环氧树脂涂料稀释剂 ①配方1 环己酮10%;丁醇30%;二甲苯60%。 ②配方2 丁醇30%;二甲苯70%。 ③配方3 丁醇25%;二甲苯75%。 (6)聚氨酯漆稀释剂 ①配方1 无水环己酮50%;无水二甲苯50%。 ②配方2 无水环己酮20%;无水二甲苯70%;无水醋酸丁酯1 0%。 (7)过氯乙烯漆稀释剂 ①配方l 环已酮5%;醋酸丁酯20%;甲苯65%;丙酮1 0%。 ②配方2 醋酸丁酯28%;二甲苯50%;丙酮12%。 (8)乳胶漆稀释刺乳胶漆是水性涂料,水性涂料以水为稀释剂。用于稀释剂的水,应无电解质离子,无杂质等。通常为可饮用的水。 原文地址中国新型涂料网https://www.wendangku.net/doc/4410990127.html,/sites/tl.html
石蜡切片免疫荧光染色 方法 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
对于石蜡切片: 1、烤片:60℃ 60分钟 2、脱蜡:二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70%乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复:高压修复,事先烧开锅中的水,修复盒中加入l柠檬酸钠,(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中),上汽后加热10分钟,关火。修复盒取出,放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶:玻片取出放入湿盒,加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏水 中,现配现用,避光),室温孵育10分钟,PBS洗3次,每次5分钟。(也可不用去除内源性酶)。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清(原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子),室温孵育封闭30分钟。如果背景较高,可以4℃封闭过夜。不用洗,用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤,一定要注意样品的保湿,避免样品的干燥,否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书,按照适当比例用(10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS)稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗, 4℃过夜,第二天取出复温45分钟。PBS洗3次,每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用稀释荧光标记的二抗,立即加入稀释好的二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。 PBS洗涤3次。每次5分钟。如果结果背景较高,可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。 6. 蛋白检测(Detection of proteins)
一、515-稀释剂 1、稀释剂外观:无色透明液体。 2、稀释剂性能:丝网油墨标准稀释剂,略带清香味,挥发速度较快。 3、稀释剂用途:稀释丝印油墨、移印油墨及清洗网版用。 二、616-慢干稀释剂 1、稀释剂外观:无色透明液体。 2、稀释剂性能:丝网油墨慢干稀释剂,干燥速度较慢,有助于油墨的消泡,流平及增加亮光,有效防止堵网。 3、稀释剂用途:稀释丝印油墨、移印油墨。 三、UV-SG稀释剂 1、UV-稀释剂外观:无色透明液体。 2、UV-稀释剂性能:属UV类稀释剂,可有效降低UV油墨的粘度。 3、UV-稀释剂用途:UV油墨通用稀释剂,加入量为油墨重量的5-10%。 4、UV-稀释剂UV固化速度:中等。 四、B-5固化剂 1、固化剂外观:无色透明液体。 2、固化剂性能:和UV油墨及金属油墨可以发生化学反应,从而进一步提高油墨的耐化学性及附着力。 3、固化剂用途:UV油墨及金属油墨固化剂。 五、PP-50快干水;PP-80慢干水 1、外观:无色透明液体。
2、用途:PP、PPE油墨专用稀释剂。 六、PP-处理水 1、PP处理水外观:无色透明液体。 2、PP处理水性能:通过对PP及PP和PE混合材料的表面擦拭处理,可明显提高油墨的附着力。代替火焰处理方式。 3、PP处理水用途:PP及PP和PE混合材料的表面擦拭处理 七、680-消泡剂 1、消泡剂外观:乳白色液体。 2、消泡剂性能:添加入油墨里有明显的消泡作用。 3、消泡剂用法:在油墨内加入0.5-1%搅拌均匀后印刷。 八、416-开油水436-开油水 1、开油水外观:无色透明液体。 2、开油水用途:YPS和PS油墨专用稀释剂,防止油墨烧面。 九、UV-SL稀释剂 1、UV稀释剂外观:无色透明液体。 2、UV稀释剂性能:属UV类稀释剂,可有效降低UV油墨的粘度。 3、UV稀释剂用途:UV油墨通用稀释剂,加入量为油墨重量的5-10%。 4、UV稀释剂UV固化速度:中等。 十、UV-SB稀释剂 1、UV稀释剂外观:无色透明液体。 2、UV稀释剂性能:属UV类稀释剂,可有效降低UV油墨的粘度。
贴壁细胞的免疫荧光染色方法 Materials: 1. PBS solution 2. 4% Paraformaldehyde (PFA fixative): Dissolve 4g paraformaldehyde in 100ml PBS solution, stir at 70℃to dissolve; 3. PBS-T solution: (0.1% Triton X-100 in PBS solution) 4. PBS-B blocking solution: (4% BSA in PBS solution) 5. Primary antibody: Dilute with PBS-B solution, dilution factors should refer to manual, or, test from 1:50~200, should be more concentrate than application in Western blot; 6. Secondary antibody: Dilute with PBS-B solution, dilution factors should refer to manual Procedure: 1. Cultured cells, let it attach to the coverslips in 6-well plate; 2. Remove medium, rinse with PBS twice; 3. Add 2ml 4% paraformaldehyde, incubate at room temperature for 20 minutes; 4. Rinse with 2ml PBS three times, rinse for 5 minutes every time; 5. Permeabilize cells with 2ml PBS-T solution at 4?C for 10 minutes; 6. Remove PBS-T solution, rinse cells with PBS for 5 minutes at room temperature; 7. Block non-specific interaction with PBS-B solution at 37?C for 30 minutes; 8. Add primary antibody solution, incubate at 4?C overnight; 9. Remove primary antibody solution, wash with PBS for 5 minutes; 10. Add secondary antibody solution, incubate at room temperature for 1 hour; 11. Wash with PBS three times, 5 minutes each; 12. Add anti-fade DAPI solution if needed; 13. Observation. 细胞免疫荧光步骤 1.细胞爬片; 2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮); 3.PBS漂洗5min;
组织切片免疫荧光染色的具体步骤 1 直接免疫荧光法的操作步骤 标本的处理: 石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后,进行抗原修复,然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次; ?2%BSA或10%BSA 37 C湿盒内封闭30min ?抗体染色: C孵育30min;–在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体(1:8或1:16稀释),放在湿盒中,37 ?0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次,不时震荡(洗去多余游离的荧光素标记的抗体)。 ?缓冲甘油封片 –分析纯无荧光的甘油9份+ pH 9.2,0.2M碳酸盐缓冲液1份配制。 ?镜检:在荧光显微镜下观察。 ?优点:方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少。 ?缺点:敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。若检测多种抗原需制备多种相应的荧光标记抗体。 直接免疫荧光法的注意事项 ?对荧光标记的抗体的稀释:要保证抗体的蛋白有一定的浓度; ?一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。 ?染色温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化; –染色时间:从10 min到数小时,一般30 min; C的低温,延长染色时间。C可加强染色效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2C),高于37–染色温度:多采用室温(25 C 30 min效果好的多。–低温染色过夜较37 ?试验时需设置下列对照: –自发荧光对照(空白对照):标本加0.01mol/L,pH7.4的PBS代替一抗。 –阳性对照:用已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 –特异性对照(抑制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性抗体。 ?若标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光,则为特异性阳性染色。 ?一般标本在高压汞灯下照射超过3min,就有荧光减弱现象; ?经荧光染色的标本最好在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。 2 间接法又称为荧光抗-抗体法 需要两种抗体参与,即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用,但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。 –可用来检测标本中未知抗原,也可检测血清中未知抗体。 间接免疫荧光法操作步骤 ?标本的处理及非特异染色的封闭同直接法; ?一抗染色: C过夜。C作用30min或4–加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释,用0.01MpH7.4的PBS稀释),37 ?0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗); C湿盒避光作用30min。?加荧光标记的二抗抗体,37 ?0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸,在摇床上漂洗); ?甘油缓冲液封片 ?镜检