抗体包被

抗体包被

原理

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好。

方法

1.双抗体夹心法测抗原

是检测抗原最常用的方法。

只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物。常用的组合：单克隆抗体＋多克隆抗体

单克隆抗体＋单克隆抗体

后一组合是两种单克隆抗体针对抗原上不同的相距较远的两个抗原决定簇，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。

用途：测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。例如各种细胞因子的检测。

双抗体夹心法测抗原的方法：

捕获抗体包被→封闭（3％BSA）→待测抗原→洗涤（含0.1％Tween的PBS)→酶标单抗或多抗→洗涤→显色→检测

2.竞争法测抗原

1）抗体固相测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。

其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。

方法：抗体包被→封闭→同时加入待测抗原和酶标抗原→洗涤→酶底物→显色→ELISA reader检测

配置20uL 1mg/mL 包被抗体

抗体抗原配对

胶体金的制备

时间：2015年 4 月 8 日 地点：国声研究室 温度：17℃ 湿度：43 实验名称：胶体金的制备 实验目的：制备胶体金溶液

实验材料：1%氯金酸、超纯水、柠檬酸三钠、电热套、磁力搅拌器、搅拌子、三角瓶 实验步骤：

1.配制1%浓度的氯金酸溶液。（已配制好，待使用）

2.取1L 烧杯加500 mL 超纯水，在磁力搅拌器上加热搅拌（500℃）。水沸腾后清洗烧杯及量筒。时间：16：45

3.取柠檬酸三钠0.16g （每500 mL 叫0.16g ）溶解于4 mL 纯水中。时间：16：48

4.量取500mL 超纯水，500℃加热至沸腾后，开始时间：17：00 加入1%氯金酸10mL （每500mL 加10mL 氯金酸），至沸腾10s 后加柠檬酸三钠。时间17：16 变色后温度、转速减半，沸腾10min 后，停止加热，搅拌至冷却。时间17：26

5.检金 次日08：4

抗体代码

总量/mg 体积/mL 初始浓度mg/mL 抗体体积/uL PBS 体积/uL 111 4 0.812 4.9 4.08 15.92 112 10.8 3 3.6 5.55 14.45 212 3.5 0.6 5.8 3.44 16.56 312 3 0.87 3.4 5.81 14.19 511 3 0.456 6.5 3.04 16.96 513 10

9.4 2.12 17.88

抗体代码 111 112 212 312 511 512 111 112 212 312 511 513

常用抗体标记荧光染料的特性及其应用

常用抗体标记荧光染料的特性及其应用 1、FITC：激发波长488nm，最大发射波长525nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL1通道检测； 3）可用于荧光显微镜技术 4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。 2、Alexa Fluor 488：激发波长488nm，最大发射波长519nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL1通道检测； 3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术； 4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4～10）。 3、Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL2通道检测； 3）适用于荧光显微镜技术； 4）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于P E。 4、Cy5：激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL4通道检测；

3）适用于荧光显微镜技术； 4）同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。 5）与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。 5、PE：激发波长488nm，最大发射波长575nm。 1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪； 2）在流式细胞仪的FL2通道检测； 3）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。 6、PE-TR：激发波长488nm，最大发射波长615nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测； 2）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。 7、PE-Alexa Fluor 610：激发波长488nm，最大发射波长628nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测； 2）荧光强度高； 3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。 8、PE-Alexa Fluor 647：激发波长488nm，最大发射波长668nm。 1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测； 2）不易湮灭；

荧光素标记抗体方法

荧光素标记抗体技术 (一) 原理 目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocy nate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC 的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。 (二) 操作步骤 将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜， 透析后抗体液移入小烧杯中 ↓ 称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO) 使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFI TC／mgIgG； 如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG 在10ml小烧杯中先放入抗体 ↓ 按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中 ↓ 将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h ↓ 用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G2 5柱 ↓

收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P 比值。第二个荧光素峰为游离荧光素 计算: 2.87×A495 F／P＝──────── A280-0.35×A495 合适的F／P值为2～4。 (三) 试剂器材 1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。 2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。 3. PBS、DMSO 4. PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na 2CO 3 4.3g，NaHCO 3 8.6g加蒸馏水至500ml。 5. PD10柱(Sephadex G25柱) 6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等 (四) 注意事项 1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。 2. FITC-DMSO液要临用时配制。 3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。 如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！

免疫标记技术讲解

课程名称：临床免疫学检验技术课题名称：免疫标记技术 组员：朱恩鹏拉巴卓嘎 张燕培汪婷婷

免疫标记技术 免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学（或生物）发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。藉助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。近年来，随着分子生物学、细胞生物学、基础免疫学和免疫化学等学科的发展以及现代高新技术建立的仪器分析的应用，免疫标记技术也不断完善和更新。各种新技术和新方法不断涌现，至今已成为一类检测微量和超微量生物活性物质的免疫生物化学分析技术，在医学和其他生物学科的研究领域及临床检验中应用十分广泛。 根据试验中所用标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术分为免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫酶技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定等。 第一节放射免疫技术 放射免疫标记技术是将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法，由于此项技术具有灵敏度高（可检测出毫微克（ng）至微微克（pg），甚至毫微微克（fg）的超微量物质，特异性强（可分辨结构类似的抗原）、重复性强、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化等多个优点。因此，在医学及其他生物学科的研究领域和临床实验诊断中广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。 （一）放射免疫测定（RIA） 放射免疫测定（Radio immunoassay , RIA）是1959 年Yalow 和Berson 首先创建的经典放射免疫分析技术，用于血清中胰岛素含量的测定。30 多年来，由于此项技术灵敏、特异、并已制成多种标准试剂盒，使用方便，应用范围十分广泛。目前国外已成功地应用RIA检测的物质多达300余种，国内研究的被测物质也达百余种，试制的RIA试剂盒已有60余种，是测定各种微量物质不可缺少的手段。 （二）免疫放射测定（IRMA）

标记抗体技术

标记抗体技术 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗 体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。目前，使用的免疫标记物还有化学发光物质、铁蛋白和胶体金等。 一、辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体 a. 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP ） HRP广泛分布于植物界，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同功酶组成，分子量为40,000,等电点为pH3～9，酶催化的最适PH因供氢体不同而稍有差异，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白最大吸收光谱分别为403nm和275nm，一般以OD403nm ／OD275nm 的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。 HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料，通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。 HRP DH2＋H2O2──────→D＋2H2O b. 辣根过氧化物酶标记方法 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。 辣根过氧化物酶的标记常用过碘酸盐氧化法，这种方法法只适用于含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基，醛基与抗体分子上的氨基形成Schiff 碱而结合。后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。 在酶标过程中一般都混有未结合的酶和抗体。游离酶理论上不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此需要对制备的酶结合物进行纯化，去除游离的酶和抗体。纯化的方法很多，

抗体标记技术汇总

第1章抗体分子标记技术 第一节抗体的I125标记法 基本原理 有多种方法可用于蛋白质的碘标记，如应用化学法或酶促法通过氧化对蛋白质分子进行碘化是常用的方法。当应用化学氧化法时，碘化钠（NaI）遇强氧化剂，碘离子被氧化为碘分子，所生成的自由碘分子可与某些基团进行卤化反应。蛋白质分子可进行卤化反应的基团主要为酪氨酸残基，某些组氨酸残基也可能进行碘化。在应用氯胺T(Chloramine T)法的实验中，所用的氧化剂（1，3，4，6-tetrachloro-3α, 6α -diphenyl-glucoluril）是溶于强挥发性的有机溶剂中。该溶剂加入试管后，先让其挥发（即让氧化剂将试管包被），然后把Na125I和蛋白质液加入包被好的试管中，反应完成即将混合液移入他管，以终止反应。 试剂及仪器 ●经亲和层析纯化的多克隆抗体或单克隆抗体 ●0.5 mol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.5 (配法见附录1) ●无载体的Na125I 3.7GBq/ml ( 100 mCi/ml ) 的NaOH液 ●凝胶过滤柱 ●γ-记数器 ●100g/L 三氯醋酸 ●70% 乙醇 ●玻璃纤维滤 ●氯胺T (Chloramine T)反应用 * 新鲜制备的含2mg/ml氯络胺T的 0.5 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.5）； * 氯胺T 反应终止缓冲液： 2.4mg/ml 偏重亚硫酸， 10mg/ml 酪氨酸, 10%甘油, 1g/L Xyene cyanol 的PBS 液。 操作步骤 *注意：125I 对健康有害，需要保护措施。在应用125I 应先有关同位素知识，及在有关部门的监测下，按放射线同位素的应用及处置要求进行。 （一）氯胺T法 1．用1.5ml Ependof 管，加10μl 抗体及pH 7.5的0.5 mol/L磷酸钠缓冲液总体积至25μl； 2．加500 μCi 的Na125I ，混匀； 3．加25μl 2mg/ml 氯胺T液，混匀； 4．在室温下培养1分钟； 5．加入50μl氯胺T 反应终止缓冲液（以饱和的酪氨酸来捕获游离的 Na125I）； 6．通过凝胶过滤层析分离将碘化抗体与碘化酪氨酸分离。将反应混合液上1ml的凝胶过滤层析柱，分部收集洗脱液100μl/管，碘化抗体在开始的组分排出。应用γ-记数器监测各组分； 7．收集、合并含碘化抗体的各管；

几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记

几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、 生物素标记 抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。 一、酶标记 1、辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG 后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。这里介绍两种程序。 程序一： (1)将5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中;加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。 (2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混匀。 (3)加入0.75ml小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等 (15mg/ml)，混匀。 (4)称取Sephadex

G25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4℃过夜。 (5)用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加 1/20V体积新鲜配制的5mg/ml NaBH4溶液，混匀，室温作用30分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4℃过夜)。 (6)将交联物过Sephadex g200或Sepharose 6B(2.6×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。 (7)酶结合物质量鉴定： 克分子比值测定 酶量(mg/ml)=OD403×0.4 IgG量(mg/ml)=(OD280-OD403×0.3)×0.62 克分子比值(E/P)=酶量×4/IgG量，一般在1-2之间。酶结合率=酶量×体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280等于0.4时，E/P约为1。 标记率=OD403/OD280 酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB-H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效

第十六章 标记抗体技术

第十六章标记抗体技术 1、免疫荧光标记技术的概念/所用荧光素的要求/基本原理/操作步骤/注意事项/实际应用 （一）概念：免疫荧光标记技术是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法（二）荧光素要求：作为蛋白质标记用的荧光素须具备①有与蛋白质分子形成稳定共价键的化学基团，而不形成有害产物②荧光效率高，与蛋白质结合的需要量很小③结合物一般在储存条件下稳定，结合后不影响抗体的免疫活性④作为组织学标记，结合物的荧光必须与组织的自发荧光有良好的反衬，以便能清晰地判断结果⑤结合程序简单，能制成直接应用的商品，可长期保存。可用于标记的荧光素有FITC,RB200,四甲基异硫氰酸罗丹明。 （三）基本原理：将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应 （四）操作步骤：

①标本制备： 涂片或压印片：细菌培养物、感染动物的组织或血液、脓汁、粪便、尿沉渣 冰冻切片或低温石蜡切片：组织学、细胞学和感染组织 盖玻片：上面培养单层细胞 首要要求是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。标本要相当薄，有适当的固定处理方法 ②固定：常用丙酮和95%乙醇，室温固定15-30min后，用PBS反复冲洗，干后即可染色。 目的：防止被检材料从玻片上脱落，消除抑制抗原抗体反应的因素。检测细胞内的抗原，用有机溶剂固定可增加细胞膜的通透性而有利于荧光抗体渗入。 ③检测： A、直接法：直接滴加2-4个单位的标记抗体于标本区，置湿盒中，于37度染色30min左右，然后置大量ph7-7.2PBS中漂洗15min，干燥、封载，显微镜镜检 B、间接法：将标本先滴加特异性的抗血清，置湿盒中，于37度作用30min，PBS漂洗5min后，再加入FITC标记的抗抗体，置湿盒中，37度作用30min，PBS漂洗5min，干燥、封载，显微镜观察

HRP标记抗体的方法

HRP标记抗体的方法 酶与抗体交联的方法有许多种，根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP 结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠发。尤以简易过碘酸钠法更为常用。 戊二醛二步法 1、原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶—戊二醛—免疫球蛋白结合物。 2、标记步骤 （1）称取HRP25mg溶于12.5mL/L戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 （2）反应后的酶溶液经SephadexG-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1mL/min，收集棕的流出液。如体积大于5mL，则以PEG浓缩至5mL。放置25mL小烧杯中，缓慢搅拌。 （3）将待标记的抗体112.5mg用生理盐水稀释至5mL，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 （4）用1M pH9.5碳酸盐缓冲液0.25mL，继续搅拌3~4小时。 （5）加0.2M赖氨酸0.25mL，混匀后，置室温2小时。 （6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。 （7）3000rpm/min离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M、pH7.4的PBS中。 （8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15M、pH7.4的PB缓冲液透析，去除铵离子后（用萘氏试剂检测），10000rpm/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。 3、结果判定 （1）定性及效价测定：用特异性抗原（或抗体）同酶标记抗体（或抗免疫球蛋白抗体）作双向琼脂扩散实验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA（或正式实验系统里）对酶结合物进行滴定（见（三）工作浓度的选择）。 （2）本法标记步骤比较简单，重复性好，缺点是酶的利用率低，一般只有2%~4%的酶与蛋白质结合。 4、试剂和器材 （1）0.1M、pH6.8磷酸盐缓冲液（PBS）：取0.2M Na2HPO4 49mL ，0.2M NaH2PO4 51mL, NaCl 1.8g，加蒸馏水至200mL。 （2）12.5mL/L戊二醛液：取250mL/L戊二醛50mL与pH6.8的PBS确？mL混合。 （3）1M、pH9.5碳酸盐缓冲液（PBS）：取1M Na2CO3 3mL 与1M NaHCO3 7mL混合。 （4）0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M、pH9.5碳酸盐缓冲液1mL中。 （5）0.15M、pH7.4的PBS及生理盐水。 （6）pH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。 （7）萘氏试剂及聚乙二醇（PEG、MW2000）。 （8）纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。 （9）HRP（RZ>3.0）。 （10）SephadexG-25层析柱（2cmX50cm）。 （11）搅拌器、分光光度计、离心机。 （12）透析袋、大小烧杯，试管，吸管等。

胶体金标记的全定量免疫层析技术的原理

胶体金标记的全定量免疫层 析技术的原理 -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII

胶体金标记的全定量免疫层析技术的原理 从定性、半定量向全定量是即时检验（POCT）技术发展的一个趋势。全定量的POCT检测技术有多种原理。本文主要介绍胶体金标记的全定量免疫层析技术的原理。 一、胶体金标记的全定量免疫层析POCT试剂装置结构示意图及作用 1、吸收垫：吸收多余液体。 2、 PVC底板：提供试剂封装外壳。 3、 C1、C2：标准质控区。羊抗鼠抗体结合于硝酸纤维膜上。 4、 T：检测区。鼠源性单克隆二抗。 5、硝酸纤维素膜：提供抗原抗体反应的固相载体。 6、胶体金垫：含胶体金标记的鼠源性单克隆抗体。 7、样品吸收垫：吸收样品液体。 二、原理 该方法的免疫学原理是一个双抗体夹心法。 样品加入样品吸收垫，样品中的液体首先溶解胶体金垫中含有的胶体金标记的鼠源性单克隆抗体。其次样品中待测抗原与胶体金颗粒标记的鼠源性单克隆抗体结合，形成抗原-抗体*胶体金复合物，并靠毛细作用向检测线移动。在硝酸纤维薄膜的检测线上固定有另一鼠源性单克隆二抗。当样品层析至检测线时，可以进一步形成抗体-抗原-抗体*胶体金双抗体夹心复合物，并在检测线上聚积显现出一条可见的显色反应。无显色反应则表示样品中无抗原存在。而胶体金的量反应了待测抗原的量。从加样垫中泳动过来的过量胶体金标记的单克隆抗体是鼠源性的，无论携带抗原与否，均可被固定于标准的羊抗鼠抗体所捕获，形成显色反应，这种显色反应，既代表了整个反应体系是正确的，同时C1、C2区的显色反应的深浅，与检测区中被测抗原的量呈对应关系。胶体金颗粒在特定波长下，对光的吸收和散射与胶体金颗粒的量相关，通过光电感应器检测胶体金颗粒对光的吸收和散射，从而获得待测抗原的量。 三、讨论 全定量是POCT的发展趋势，采用两点定标法是全定量的一个重要标志，只有两点定标才有可能实现真正的全定量。 2

抗体HRP标记方法

HRP标记抗体的方法(戊二醛二步法和简易过碘酸钠法) 一、戊二醛二步法戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成 酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。 二、简易过碘酸钠法本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再与Ig上的氨基相结合，所获酶标记抗体的产率高，将近70%的 HRP和Ig结合，99%的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失， 是目前最常用的方法。 1. 原理 戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。 2. 标记步骤 （1）称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 （2）反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。 （3）将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 （4）用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。 （5）加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。 （6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。 （7）3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

（8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。 3. 结果判定 （1）定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节(三)工作浓度的选择)。（2）定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。 酶量(mg/ml)＝OD403nm×0.4 IgG量(mg/ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62 （3）本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2-4%的酶与蛋白质结合。 4. 试剂及器材 （1）0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO449ml, 0.2M NaH2PO451ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。 （2）1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50ml与PH6.8的PBS 1ml混合。 （3）1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。 （4）0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。 （5）0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。 （6）PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。 （7）萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。

I标记单克隆抗体技术

125I标记单克隆抗体技术 同位素标记是一种重要的抗体标记技术，牨977年Yalow等在放射免疫测定法所作突出贡献而获得医学和生理学诺贝尔奖。McAb标记同位素后除应用于放射免疫测定外，还可用于竞争结合试验、体内肿瘤定位等。 (一) 原理 氯胺桾即对甲苯碘氯胺钠，在水溶液中生成次氯酸，为一种温和氧化剂，当加入到有蛋白质和碘的弱碱水溶液中，可将I２氧化为I＋并结合到氨基酸上。如标记条件温和，标记后的McAb仍具有良好的结合活性，通过放射性同位素强度的测定可反映相应抗原的含量。 (二) 方法 在细胞冻存管内加入纯化的McAb100μg／100μl， 再加入10μl 0.05M磷酸缓冲液 再加入10μl(含1mCi)125I ↓ 加入10μl氯胺-T(5mg／ml溶于0.05M 磷酸盐缓冲液)，孵育时间不超过30秒 ↓ 加入100μl偏重亚硫酸钠(1.2mg／ml溶于 0.05M磷酸缓冲液) ↓ 加入200μl KI溶液(少许结晶KI溶于0.05M 磷酸缓冲液＋4％牛血清白蛋白) ↓ 用PD10柱(Sephadex G25)除去游离125I 用4％BSA PBS洗脱 ↓ 分部收集，0.5ml／管 每管取5μl进行γ计数，计算标记抗体的比活性和标记率 结合于McAb１２５I放射性强度(cpm) 标记率(％)＝─────────────────── 总放射性强度(cpm) 结合于某一管McAb上的放射性强度 比活性(μCi／μgMcAb)＝──────────────── 某一管McAb总量

(三) 试剂器材 1. 纯化后的McAb 2. 0.05M磷酸缓冲液，氯胺桾，偏重亚硫酸钠，KI，BSA 3. 125I 4. 有通风装置的超净台，γ计数仪 5. PD10柱(Sephadex G25) (四) 注意事项 1. 严防同位素污染，工作人员必须穿着工作衣，戴口罩、帽子、手套。必须在严密的通风橱或通风超净台中操作。操作前后对实验室环境进行监测。所用125I和标记物应妥善保管。 2. 如标记细胞因子、激素等，应选用更温和的标记方法，使保持更好的生物学活性。

AP标记技术

碱性磷酸酶（AKP）标记抗体（戊二醛法） 1．取0.2ml AKP（含2mg），与0.1ml纯化的IgG（含1mg）混合，加PBS到0.5ml。2．在0.5ml AKP/抗体混合液中加4μl 25％戊二醛，室温放置2小时。 3．向反应物中加PBS到2ml，4℃中对PBS透析过夜。透析物用Tris缓冲液 （0.5mol/L Tris-HCl pH7.4，1mmol/L MgCl 2，0.04％ NaN 3 ，5％ BSA）稀释 到5ml，4℃可保存1年以上。 辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（过碘酸钠法） 1．取5mg HRP溶于0.5ml双蒸水中，加0.5ml新鲜配制的60mmol/L NaIO 4 水溶液，4℃中避光搅拌30分钟，加0.5ml 160mmol/L乙二醇水溶液，室温中继续搅拌30分钟。 2．加1ml纯化的IgG（5mg）水溶液，混匀后置透析袋中，对50mmol/L pH9.5的碳酸钠缓冲液透析6小时或过夜。 3．向透析物中加0.2ml 5mg/ml NaBH 4 水溶液，4℃搅拌2小时。继续4℃搅拌，20分钟内逐渐加入等体积饱和硫酸铵，再4℃搅拌30分钟。 4．4000×g离心30分钟，去上清液。用1ml 20mmol/L pH7.4磷酸缓冲液溶解沉淀物，对20mmol/L pH7.4磷酸缓冲液透析过夜。4000×g离心20分钟，除去不溶物。加上述磷酸缓冲液到5ml。鉴定标记物。 5．分装后冻干保存或加甘油到40％（v/v）分装后4℃或－20℃保存。1～2年活性不变。 6．测定标记物的OD 403和OD 280 。 标记率＝OD 403/OD 280 标记率应是0.3～0.6，即每个IgG结合1～2个HRP分 子。 酶含量（mg/ml）＝OD 403 ×0.4 IgG含量（mg/ml）＝（OD 280－OD 403 ×0.42）×0.94×0.62 标记物的克分子比值＝酶含量×4/IgG含量比值应在1～2之间。 用半乳糖苷酶标记抗体 1．取1mg纯化的抗体蛋白，溶于1ml含50mmol/L NaCl的0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液中。立即加入10μl含0.25mg MBS的四氢呋喃，30℃水浴1小时。

荧光素标记抗体方法

荧光素标记抗体技术 (一)原理 目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocy nate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200)。在硷性条件下FITC 的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。 (二) 操作步骤 将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜， 透析后抗体液移入小烧杯中 ↓ 称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1ml DMSO) 使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFI TC／mgIgG； 如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／ml IgG 在10ml小烧杯中先放入抗体 ↓ 按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中 ↓ 将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h ↓ 用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素，先用25ml PBS淋洗G2 5柱 ↓ 收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P 比值。第二个荧光素峰为游离荧光素

计算: 2.87×A495 F／P＝──────── A280-0.35×A495 合适的F／P值为2～4。 (三) 试剂器材 1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。 2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。 3. PBS、DMSO CO34.3g，NaHCO3 8.6g加蒸馏水至500ml。 4. PH9～9.5碳酸盐缓冲液: Na 2 5. PD10柱(Sephadex G25柱) 6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等 (四) 注意事项 1. FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。 2. FITC-DMSO液要临用时配制。 3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。

免疫标记：四大免疫标记原理介绍

免疫标记：四大免疫标记原理介绍！ 为提高抗原和抗体检测的敏感性，将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物，反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。常用的标记物有酶、荧光素、放射性同位素、胶体金及电子致密物质等。这种抗原或抗体标记上显示物所进行的特异性反应称为免疫标记技术(immunolabelling technique)。 免疫标记不仅大大提高了试验敏感性，若与光镜或电镜技术相结合，能对组织或细胞内的待测物质作精确定位，从而为基础与临床医学研究及诊断提供方便。免疫标记技术大致分为两大类：一类属于免疫组织化学技术(immunohistochemical technique)，用于组织切片或其他标本中抗原的定位。另一类称为免疫测定(immunoassay)，用于液体标本中抗原或抗体的测定。 一，免疫酶技术(immunoenzymatic technique) 最早应用的免疫酶技术是免疫酶组织化学染色，即用标记的抗体与标本中的抗原发生特异性结合，当加入酶的底物时，在酶的作用下经一系列生化反应产生有色物质，借助光镜作出定位判断。目前，应用最广泛的是酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。该法特异性强，敏感性高，既可检测抗体，又能测定可溶性抗原。主要方法及操作要领见图18.5，除了图示的两种方法外，还有抗原竞争法，现较少应用。ELISA常采用的酶为辣根过氧化物酶(hosradish peroxidase，HRP)，其底物是二氨基苯胺(DAB)，

底物被分解则呈棕褐色，可目测或借助酶标仪比色。ELISA为非均相免疫测定，另外还有均相法，在此不作介绍。 由于酶免疫测定无需特殊仪器和试剂，且操作简便，利于普及。因此，在免疫标记技术中，该法应用最为广泛，并在原有方法基础上加以改良，使得众多新的，更敏感的方法应运而生。 ①生物素-亲和素放大系统(biotin-avidin system，BAS)，建立于70年代后期，通过将酶标记在生物素或亲和素上，借助生物素与亲和素的高度亲力和生物素能与抗体结合的特点应用于ELISA，显著提高了检测的敏感性。 ②双表位ELISA(two-site ELISA)，其方法同双抗体夹心法，只是将包被的抗体和酶标抗体换成针对两个不同抗原决定簇的单抗，用于检测单抗的亲和性及表位特异性，亦可用于标本中抗原的快速检测，即在试验时可将待测抗原与酶标单抗同时加入反应体系，减少检测步骤。 ③斑点免疫渗滤试验(dot immunofiltration assay，DIFA)，其原理与ELISA相同，但以微孔膜(如硝酸纤维素膜、尼龙膜等)代替聚苯乙烯板作载体。试验时，将包被有抗原或抗体的微孔滤膜贴置于吸水材料上，依次滴加的标本、酶结合物、底物，分别进行洗涤，多余的标本和酶标抗体及洗涤液等可渗滤入吸水材料中，最后阳性标本在膜上呈现着色斑点。 ④酶联免疫电转移印渍法(enzyme linked immunoelectrotransferblot，ELIB)，该法将免疫转印技术与酶标技术相结合，有利于分析和检测更加复杂的抗原成分。ELIB分三阶段进行。第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，先将抗原分成不同的区带(肉眼不可见)；第二阶段为转移电泳，即将凝胶上的电泳

第六节 免疫标记技术

第十一章血清学试验 第六节免疫标记技术 免疫标记技术是利用抗原抗体反应的特异性和标记分子极易检测的高度敏感性相结合形成的试验技术。免疫标记技术主要有荧光抗体标记技术、酶标抗体技术和同位素标记抗体技术。它们的敏感性和特异性大大超过常规血清学方法，现已广泛用于传染病的诊断、病原微生物的鉴定、分子生物学中基因表达产物分析等领域。其中酶标抗体技术最为简便，应用较广。这里主要介绍荧光抗体标记技术和酶标抗体技术。 一、荧光抗体标记技术 荧光抗体标记技术（fluorescent-labelled antibody technicque）是用荧光色素标记在抗体或抗原上，与相应的抗原或抗体特异性结合，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。 （一）原理荧光素在10-6的超低浓度时，仍可被专门的短波光源激发，在荧光显微镜下可观察到荧光。荧光抗体标记技术就是将抗原抗体反应的特异性、荧光检测的高敏性、以及显微镜技术的精确性三者结合的一种免疫检测技术。 （二）荧光色素荧光色素是能产生明显荧光，又能作为染料使用的有机化合物。主要是以苯环为基础的芳香族化合物和一些杂环化合物。它们受到激发光(如紫外光)照射后，可发射荧光。 可用于标记的荧光色素有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明(RB 200)和四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC）。其中FITC应用最广，为黄色结晶，最大吸收光波长为490～495nm,最大发射光波长520～530nm，可呈现明亮的黄绿色荧光。FITC分子中含有异硫氰基，在碱性(pH9.0～9.5)条件下能与IgG分子的自由氨基结合，形成FITC-IgG结合物，从而制成荧光抗体。 抗体经荧光色素标记后，不影响与抗原的结合能力和特异性。当荧光抗体与相应的抗原结合时，就形成了带有荧光性的抗原抗体复合物，从而可在荧光显微镜下检出抗原的存在。 （三）荧光抗体染色及荧光显微镜检查 1．标本片的制备标本制作的要求首先是保持抗原的完整性，并尽可能减少形态变化，抗原位置保持不变。同时还必须使抗原标记抗体复合物易于接受激发光源，以便很好地观察和记录。这就要求标本要相当薄，并要有适宜的固定处理方法。 根据被检样品的不同，采用不同的制备方法。细菌培养物、血液、脓汁、粪便、尿沉渣及感染的动物组织等，可制成涂片或压印片。感染组织最好制成冰冻切片或低温石蜡切片。也可用生长在盖玻片上的单层细胞培养作标本。 标本的固定有两个目的，一是防止被检材料从玻片上脱落，二是消除抑制抗原抗体反应的因素。最常用的固定剂是丙酮和95%的乙醇。固定后用PBS反复冲洗，干后即可用于染色。 2．染色方法荧光抗体染色法有多种类型，常用的有直接法和间接法两种。

抗原、抗体酶标记技术

抗原、抗体酶标记技术-转自博升生物 酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体，酶标记的抗原或抗体称为结合物（conjugate）。抗原由于化学结构不同，可用不同的方法与酶结合，如为蛋白质抗原，基本上可参考抗体酶标记的方法。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，作为抗体标记的酶常用的有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP），不同的酶标记方法也不相同。 1、辣根过氧化物酶（HRP）标记 辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉（辅基）构成一种糖蛋白（含糖18%）。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff氏碱。 标记步骤： (1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。 (2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。 (3)将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。 (4)加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立 即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小 时。 (5)加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混匀，再置4℃2小时。 (6)将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。 (7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。 (8)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。 (9)将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。 2、碱性磷酸酶（AP）标记 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP），是小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶，由多个同功酶组成。常用的酶底物有对硝基本磷酸盐（PNP）、β-甘油磷酸钠。、碱性磷酸酶（AP）用于标记抗体，常用戊二醛一步法，戊二醛是一种双功能团试剂，可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过它而偶联。戊二醛交联可用一步法（如连接AP），将酶、抗体、戊二醛按一定比例混合，经透析除去标记物中剩余的戊二醛，制得酶标抗体。也可用二步法（如连接HRP）。戊二醛一步法操作简便、有效，而且重复性好。缺点是交联时分子间的比例不严格，大小也不一，影响效果。制备HRP抗体结合物也可用二步法，即先将HRP与戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。此法的效率可高于一步法10倍左右。

HRP标记抗体的方法

HRP标记抗体的方法 抗体 酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结合物，可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易 过碘酸钠法更为常用。 戊二醛二步法 1. 原理：戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。 2. 标记步骤： (1) 称取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 (2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则 以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。 (3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 (4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。 (5) 加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。 (6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。 (7) 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。 (8) 将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去 除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。 3. 结果判定： (1) 定性及效价滴定：用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色，可初步鉴定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选 择)。 (2) 定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。 酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4 IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62 酶量(mg／ml) IgG量(mg／ml) 酶量 克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝─── × 4 40,000 160,000 IgG量 (3) 本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有2～4%的酶与蛋白质结合。 4. 试剂及器材： (1) 0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。 (2) 1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。 (3) 1M PH9.5碳酸盐缓冲液：取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。 (4) 0.2M赖氨酸溶液：称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。 (5) 0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。 (6) PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。