MTT法( MTT Assay)检测细胞活力与细胞密度的关系

MTT法（MTT Assay）检测细胞活力与细胞密度的关系一、实验目的

学习用MTT的方法检测细胞活力的原理。

二、实验原理

活细胞的线粒体脱氢酶可以还原黄色的MTT溶液为紫色甲臜（formazan）颗粒，沉积在细胞中；用DMSO等试剂溶解甲臜后的溶液在一定波长下比色测定的吸光值与活细胞数量及代谢活性成正比。

三、实验试剂及仪器

a)材料：小鼠腹水瘤小鼠

b)试剂：

i.D-Hanks液。

ii.0.4％台盼蓝生理盐水染液。

iii.含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液。

iv.5mg/ml 的MTT：用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液配制，溶解后（0.22 μm滤膜）过滤消毒，4℃避光保存。

v.盐酸-异丙醇裂解液：量取盐酸14mL、Triton X-100溶液50mL，加异丙醇至500mL。

c)用品：酶标仪、CO2培养箱、10mL低速离心机、血球计数板、96孔培

养板、小剪刀、镊子、10mL带盖刻度离心管、100μL枪及枪头等

四、实验步骤

（常规操作流程：计数细胞调浓度→将细胞悬液加样于96孔细胞培养板→（加药刺激）→加MTT反应（4h）→溶解甲臜→测定溶液吸光值。

权宜操作流程：MTT与细胞作用→计数细胞调浓度→将细胞悬液加样于96孔细胞培养板→溶解甲臜→测定溶液吸光值。）

a)加MTT，37℃温育（上课前2h，助教完成）

b)计数细胞调浓度（血球计数板、含0.5mg/mL MTT的培养液）。

106个/mL系列8×、4×、2×、1×、0.5×

105 个/mL系列8×、4×、2×、1×、0.5×

104个/mL系列8×、4×、2×、1×、0.5×

c)加样：空白对照（培养液+MTT+裂解液）和实验，每孔100μL ，2个重

复孔。

d)加裂解液：MTT作用4h后，加裂解液，混匀。

e)比色：酶标仪，570nm波长

f)吸光值计算：实测OD值-空白对照孔OD平均值

g)分析：OD值与细胞浓度的线性关系范围

五、实验结果

六、实验分析

本实验，我一共做了四个图，其中包括：一个以菌液浓度从0.5*10^4个/ml到1*10^5个/ml的图；一个以菌液浓度从1*10^5个/ml到1*10^6个/ml的图；一个以菌液浓度从1*10^6个/ml到8*10^6个/ml的图；以及一个包括所有菌液浓度的图。

从第一个图中可以看出，在菌液浓度从0.5*10^4个/ml到1*10^5个/ml 的范围内，MTT培养液组的R^2=0.3188,，所以其线性关系极差，而MTT缓冲液组的R^2=0.7747，所以它的线性关系也不是非常好。

从第二个图中可以看出，在菌液浓度从1*10^5个/ml到1*10^6个/ml 范围内，MTT培养液组的R^2=0.9824,，所以其线性在这个浓度范围内应该是非常好的啦，MTT缓冲液组的R^2=0.9658，所以它的线性关系在这个浓度范围内也是非常明显。

从第三个图中可以看出，在菌液浓度从1*10^6个/ml到8*10^6个/ml 范围内，MTT培养液组的R^2=0.7175,，所以其线性在这个浓度范围内不是很好，MTT缓冲液组的R^2=0.986，所以它的线性关系在这个浓度范围内也是非常明显。

从第四个图中可以看出，在整个浓度范围内，MTT培养液组的线性关系明显没有MTT缓冲液组好。

最后基本可以得出结论：对于MTT培养液当中的菌活力检测，基本上是在菌液浓度在1*10^5个/ml到8*10^5个/ml的范围内线性关系较好，检测较为准确。而在MTT缓冲液当中的菌的活力检测，在1*10^5个/ml到8*10^6个/ml的范围内的线性关系都比较好，用于检测比较可靠。

七、实验注意事项

a)MTT致癌、见光易分解，操作应注意。

b)细菌对MTT敏感，注意无菌操作。

c)材料细胞来源的一致性。

d)鼠腹腔白细胞对实验结果的系统影响。

e)甲臜溶解应完全并减少气泡的产生。

细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA 的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，

所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。 图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书） 在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。 Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一

细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检 测方法 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA 链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。 Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。 采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。

细胞活性测定

细胞活性测定方法 细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。核酸染料有多种，如EB带有单个自由正电荷，能通过完整细胞膜。而PI，TO—PRO—1，TO-PRO-3等等带一个有四铵基团和两个或两个以上正电荷的染料是不能通过完整细胞膜进入细胞内的。因而吸收了这些多电荷染料的细胞被认为是非活性的。另外，一些酸性染料，如上面提到的台盼兰，曙红等都是膜非通透性。 代谢活性是另一重要指标，它通过细胞内的酶的活性来判定。使用细胞某种酶的底物，它能通过（或是不能通过）完整细胞膜，在细胞内被酶切而产生荧光性，膜不通透性产物，能在细胞膜完好的细胞内存留，在细胞膜不完整的细胞内散失很快。通过检测荧光强度就可知细胞代谢活性。FDA(fluorescein diacetate)和CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）是常用的两种底物。前者虽然透过细胞膜的速度较慢，但它的产物基本不往外通透。后者经细胞内脱氢酶催化而具有荧光性，能提供细胞呼吸代谢系统活性和细胞膜完整性信息。 正常细胞的细胞膜两侧维持着一个胞内为负的膜电位为梯度，带正电的亲脂性染料，如Cyanines类能因电梯度而通过细胞的脂双层膜聚积在活细胞内，带负电的亲脂性染料如oxonols会被排除在外。不再维持着膜电位梯度的细胞里，则会吸收更多Oxonols类染料。 用流式细胞仪测量的方法优点是，灵敏，荧光强度精确定量，快速高通量的检测逐个细胞，可同时检测细胞的多个活性指标，提高可信度，结果具有统计意义。缺点是，实验较MTT等复杂，费用较高。 常用的细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。 1．MTT法 MTT：化学名：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有损害。

细胞活性测定方法介绍和使用探讨

细胞活性测定方法介绍和使用探讨 细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。 现就这三种四氮唑盐类方法作一个简单介绍： 1、 MTT 法 MTT：化学名：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。 2、 XTT 法 XTT，化学名： 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-tetrazolium hydroxide，作为线粒体脱氢酶的作用底物，被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲瓒产物。当XTT与电子偶合剂（例如PMS）联合应用时，其所产生的水溶性的甲瓒产物的吸光度与活细胞的数量成正比。 优点：1、使用方便，省去了洗涤细胞；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT。 缺点：XTT水溶液不稳定，需要低温保存或现配现用。

死活细胞鉴定及细胞活力测定

死活细胞测定及细胞活力测定 【实验原理】 （一）染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。实验是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异来进行的。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要体现在： （1）死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。 （2）死活细胞在代谢上的差异：由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原 能力，而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱。 常见的细胞染料有：中性红（细胞器的专有染料）、台盼蓝、甲基蓝、美蓝、荧光素双醋酸 酯（FDA等。 ①中性红染色：常用染料之一，是细胞器的专有染料。利用细胞膜的通透性差异，用来染 原生动物和显示动植物组织中活细胞的内含物等。中性红无毒，常做活体染色的染料。 ②台盼蓝染色：当细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA 结合， 使其着色。而活细胞能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与活细胞。严格来说，台盼蓝染色检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。通过显微镜很容易就能识别出死亡的被台盼蓝染色的细胞，并可使用细胞计数器进行计数。 ③美蓝染色法：美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对活细 胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞. ④甲基蓝染色法：甲基蓝染色与台盼蓝类似的染色机理。 （二）植物细胞质壁分离法及活体染色测定细胞死活 （1 ）质壁分离法：成长的植物细胞一般具有中央液泡，在中央液泡和细胞壁之间为细胞质的薄层及其内外膜——液泡膜和质膜。液泡中的胞液具有一定的溶质势（或称渗透势），而活的原生质特别是液泡膜和质膜则具有半透性。所以，当细胞与外界溶液接触时，便与外液构成渗透系统，并可能发生水分的移动。若外液的水势低于胞液的溶质势，则水分外渗的结果可使原生质随着液泡一起收缩而脱离细胞壁，发生质壁分离，质壁分离的细胞与水或水势较高的溶液接触时，可重新吸水而是质壁分离复原。 （2 ）活体染色法：活体染色是利用某种对植物无害的染料稀溶液对活细胞进行染色技术。

细胞活性鉴定

1、细胞活性的鉴定：死细胞对许多抗体均有很强的非特异性染色，这就使样本细胞活性检测变得非常重要，尤其是经过长时间运输和储存的样本。检测的方法通常有两种：（1）实时的流式检测：利用荧光染料PI、7-AAD或EMA 进行死细胞染色，而活细胞拒染这些染料。此方法的优势是细胞表面标志和活性分析可同时进行。尤其适用于高度坏死的样本。7-AAD最常用，因为在488nm激发下，其最大发射光在670nm左右，适合与FITC或PE进行多色标记。但随着时间延长，7-AAD会在固定的细胞群体重新分配，死活细胞的区分变得困难。因此，对于染色并在固定后12小时以上分析的标本，最好用EMA。EMA与死细胞DNA稳定的共价结合保证了长时间固定后仍能很好的区分固定前的死活状态。（2）手工检测：使用Trypanblue或其他细胞活性染料。（3）使用专门的仪器进行检测。如Vi-cell。 2、7-AAD （7-amino-actinomycin D）是一种核酸染料，在流式细胞术中用于鉴定死细胞，这种作用与PI相似。它不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对7-AAD的通透性逐渐增加，结合细胞凋亡中DNA的有控降解，在合适波长激发光的激发下可发出明亮的红色荧光，通过7-AAD标记DNA的强弱，将细胞分为三群：7-AAD 强为死亡细胞，7-AAD弱是凋亡细胞，7-AAD-为正常活力细胞。7-AAD同PI 有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，PI检测时同时占据FL-2和FL-3通道，而7-AAD只占FL-3通道，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI 的最佳替代品，可与Annexin V-EGFP/FITC/PE联合使用。 3、Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒是用红色荧光染料PE（Phycoerythrin）标记的AnnexinV作为探针，来检测细胞早期凋亡的发生，可用荧光显微镜、流式细胞仪或其他荧光检测设备进行检测。 其检测原理为：在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。 另外，本试剂盒中提供的7-AAD可用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。7-AAD是一种核酸染料，同PI 有着相似的荧光特性，但其发射光谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品，可与Annexin V联合使用。该染料不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可穿透晚期凋亡细胞或者坏死细胞并与其内的DNA结合。因此将AnnexinV-PE与7-AAD联合使用时，7-AAD则被排除在活细胞（AnnexinV-/7-AAD-）和早期凋亡细胞（AnnexinV+/7-AAD-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被AnnexinV-PE 和7-AAD结合染色呈现双阳性（AnnexinV+/7-AAD+），可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。。 操作方法 样品染色 1）悬浮细胞：300g，4℃离心5 min收集细胞。 贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4℃离心5 min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。2）用4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需300g，4℃离心5 min。 3）加入250μl 1×Binding Buffer重悬细胞，调节其浓度为1×106细胞/ml。 4）取100 μl细胞悬液于5ml流式管中，加入5μl Annexin V/PE和10 μl7-AAD，轻轻混匀。 5）避光、室温反应15 min。 6）加入400μl1×Binding Buffer，混匀，样品在1小时内检测。 4、CFSE (carboxyfluoresceindiacetate, succinimidyl ester 羧基荧光素双乙酸盐，琥珀酰亚胺酯) 被动扩散进入细胞，其本身是无色无荧光的，被细胞内的酯酶分解后产生高强度的绿色荧光，定位于细胞膜、细胞质和细胞核，在细胞核的荧光染色最强，该荧光产物与胞内的氨基结合长时间留存于细胞内并可被乙醛固定。未结合的试剂与副产物扩散至胞外基质中，被洗去。 传代或胚胎分裂分析，CFSE与赖氨酸侧链或其他氨基基团反应，共价偶联至细胞内和细胞表面的蛋白，细胞分裂时被平均分配至子代细胞，荧光强度降到母代细胞的一半。适合用于胞内示踪，在细胞分裂或融合后分配至子代细胞中，并不会被转移至邻近的细胞。在小鼠淋巴细胞迁移实验中，CFSE注射进入小鼠体内后，标记的淋巴细胞的检测可长达8周。肝内注射荧光显微镜定位检测可长达20天。

MTT检测细胞活性的操作方法

MTT检测细胞活性的操作方法 一、MTT是什么 MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 二、MTT法用来做什么 简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。 MTT主要有两个用途 1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定； 2．细胞增殖及细胞活性测定。 三、为何MTT可以用来做上述工作 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。 四、实验所需材料 1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。 市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g 1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。具体做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。 1.2对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。 注意事项： 1. 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。 配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感 MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。 MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套. 2．MTT甲瓒溶解液 2.1二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。 2.2三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液，该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。 该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时

活性氧检测试验方案

活性氧检测试验方案 一：实验原理 活性氧检测试剂盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。 本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物(compound mixture),浓度为50mg/ml。二：实验步骤 ⑴取20 ul DCFH-DA（试剂盒有100ul)按照1:1000用无血清培养液即20ml稀释DCFH-DA，使 终浓度为10微摩尔/ 升。 ⑵吸取12ml细胞培养液（细胞浓度为一百万至二千万/毫升）加入24孔板中（设3个阳性对照， 3个浓度梯度分别做3个重复，每孔加入1ml细胞培养液），放入细胞培养箱中培养。 ⑶培养24小时后去除细胞培养液，每孔加入稀释好的DCFH-DA 1ml （加入的体积以能充分 盖住细胞为宜）。 ⑷ 37℃细胞培养箱内孵育20分钟。

⑸去除孵育后的DCFH-DA稀释液，每孔加入1ml无血清细胞培养液洗涤细胞（重复洗涤三次， 以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA）。洗涤完后每孔加入1ml细胞培养液。 ⑹在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前荧光的强 弱即OD值。 ⑺实验组中每孔加入已配制好的松茸多糖20ul(浓度分别为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml), 对照组中加入阳性对照物Rosup 20ul，放入细胞培养箱内继续培养。 ⑻4小时后，在酶标仪下使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激后 荧光的强弱即OD值。 三：数据处理 实验组：癌细胞活性氧降低率=（刺激前OD值－刺激后OD值)/刺激前OD值×100% 阳性对照组：癌细胞活性氧升高率=（刺激后OD值－刺激前OD值)/刺激前OD值×100% 四：注意事项 ⑴探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

DCFHDA活性氧检测方法.pdf

ROS活性氧检测试剂盒-DCFHDA法 产品组成： 产品编号BB-47053 规格200-1000T DCFHDA100ul 活性氧阳性对照诱导剂1000ul 储存条件： -20℃保存。 有效期： 一年。 注意事项： ● 本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。 ● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管 底，避免开盖时试剂损失。 ● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。 ● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。 ● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清 洗并彻底清除残留清洁剂。 ● 避免皮肤或粘膜与试剂接触。 产品简介： 活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。 贝博活性氧检测试剂盒是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被标记到细胞内。在活性氧存在的条件下，DCFH被氧化生成荧光物质DCF，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比，检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。 在激发波长502 nm，发射波长530 nm附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测DCF 荧光，从而测定细胞内活性氧水平。 本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的检测。本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂，以便于活性氧的检测。 产品特点： ● 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测； ● 背景低，灵敏度高； ● 线性范围宽，使用方便。

MTT检测细胞活性的操作方法

检测细胞活性的操作方法 一、是什么 是一种粉末状化学试剂，全称为() ()，汉语化学名为(，二甲基噻唑)，二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 二、法用来做什么 简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。 主要有两个用途 ．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定； ．细胞增殖及细胞活性测定。 三、为何可以用来做上述工作 检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（值），来判断活细胞数量，值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。 四、实验所需材料 ．溶液的配制通常配成的终浓度为,须用或生理盐水做溶剂。 市面上一般的包装为或 对于这样的小包装，厂家都是将放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如用来溶解。具体做法：预先在离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入，从中先吸取装入含的小管中，吹打若干次后将其移入离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的不残留于管内。将完全混匀后，用μ滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于度。按细胞培养板每孔需加计算，一般每孔板约需，所以分装时可考虑每管分装。 对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在管里，用的时候现配，直接往培养板中加。 注意事项： . 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。 配成的需要无菌，对菌很敏感 一般最好现用现配，过滤后度避光保存两周内（个人曾做过度避光保存周的溶液，效果仍然不错）有效，或配制成保存在度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当变为灰绿色时就绝对不能再用。 有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套. ．甲瓒溶解液 二甲基亚砜，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。 三联溶解液：，异丁醇，用双蒸水溶解配成溶液，该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。 该溶解液因含有，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将结晶全部溶解后再使用。

细胞活力快速检测试剂盒(

细胞活力快速检测试剂盒细胞活力快速检测试剂盒（（Luminescent ） 说明书修订日期说明书修订日期：：2015.07.13 Cat number ：KGA369 Store at -20 for ℃ 6 months, protected from light For Research Use Only （科研专用） 一、试剂盒说明 本试剂盒是通过对ATP 进行定量测定来检测培养物中活细胞数目的一种均质检测方法。ATP 是活细胞新陈代谢的一个指标。细胞活力快速检测试剂盒为多孔板而设计，是进行自动化高通量筛选(HTS)、细胞增殖和毒性分析的理想选择。均质检测步骤就是将单一试剂直接加入含有血清的培养细胞中，无需洗涤细胞、去除培养基或进行多步加样操作。在384孔板上，加入试剂并混合后，10 分钟内，该系统可检测到的每个孔内的细胞数最低为15个。 均质检测的" 加样-混合-检测" 的操作方案使得细胞裂解和产生的发光信号与存在ATP 量成正比，而ATP 量直接与培养物中的细胞数量成正比。细胞活力快速检测试剂盒产生一种"辉光型" 的发光信号，半衰期一般大于5小时，因细胞类型和培养基而异。由于信号半衰期长，不需要使用试剂自动进样器，就可灵活地进行连续的或批量的多孔板处理。独特的均质检测方案避免了那些需要多个步骤的ATP 检测方法可能会引入的误差。 二、试剂盒组份 组 份 Cat: KGA369 500 assays 储存储存条件条件 细胞活力快速检测液 13ml/瓶 避光，-20℃，半年有效 本试剂盒可以提供384孔板至少500T 的量的量。。 三、试剂盒以外自备仪器和试剂 低速离心机 、荧光闪烁计数仪、平板摇床、微量移液器、不透明壁多孔板，用于细胞培养物。 四、注意事项 1. 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待检测体系中存在较多的还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。 3. 用酶标仪检测前请确保孔内没有气泡，否则会干扰测定。 4. 为保证您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 五、操作方法 A. 细胞活性检测的操作步骤 1. 在一块壁不透明的多孔板上准备好带培养基的哺乳动物细胞，96孔板100μl/孔，384孔板25μl/孔。多孔板应与将使用的萤光发光计匹配。

MTT法测定细胞相对数和相对活力

MTT法测定细胞相对数和相对活力 一、原理 噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。 二、试剂材料准备与实验仪器 1）对数生长期细胞 2）受试因素（药物） 3）MTT：以PBS配制成5mg /ml，抽滤除菌，保存在4?C 4）DMSO（二甲基亚砜） 5）96孔板 6）酶联免疫检测仪 7）细胞培养箱 三、实验步骤（适用于贴壁细胞） 1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，1×104/孔，细胞浓度可以调整。2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。 3）加入不同浓度的药物，如1、5、10、40、50、80、160、320mg/ml的药物，时间依据实验需要，一般3天。 4）小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。 5）每孔加入180 ul新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。

6）终止培养（可离心，1000 rpm，10 min），小心吸去孔内培养液。 7）每孔加入150 ul二甲基亚砜（也可以用酸化异丙醇，10%SDS代替），置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。8）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。 三、结果统计学处理 所有数值以x±s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p<0.05时为相差显著，p<0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。或计算抑制率。 四、注意事项与常见问题 1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。 2）每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太少观察不到差异。 3）贴壁细胞加MTT前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液，再加入0.5%MTT，量为20ul/孔。 4）如果不使用96孔板，培养基超过100 ml，MTT按照10%的比例加入。 5）MTT一般4度保存两周，注意避光保存，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后可过滤一下。

细胞活力检测celltiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay system protocol

Revised 12/12 TB245 T E C H N I C A L B U L L E T I N CellTiter 96? AQ ueous One Solution Cell Proliferation Assay Instruc? ons for Use of Products G3580, G3581 and G3582

Promega Corpora ? on · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 USA · Toll Free in USA 800-356-9526 · 608-274-4330 · Fax 608-277-2516 1 https://www.wendangku.net/doc/4e11431160.html, TB245 · Revised 12/12 All technical literature is available at: https://www.wendangku.net/doc/4e11431160.html,/protocols/ Visit the web site to verify that you are using the most current version of this Technical Bulletin. E-mail Promega Technical Services if you have questions on use of this system: techserv@https://www.wendangku.net/doc/4e11431160.html, CellTiter 96? AQ ueous One Solution Cell Proliferation Assay 1. Description .........................................................................................................................................1 2. Product Components and Storage Conditions ........................................................................................4 3. Protocols .. (5) 3.A. General Protocol ........................................................................................................................53.B. Example of a Protocol for Bioassay of IL-6 Using B9 Cells ..............................................................5 4. General Considerations .. (6) 4.A. Background Absorbance ..............................................................................................................64.B. Optional Wavelengths to Record Data ..........................................................................................74.C. Lymphocyte Assays .....................................................................................................................74.D. Reagent Optimization .................................................................................................................84.E. Cell Number Optimization ...........................................................................................................8 5. References ..........................................................................................................................................9 6. Related Products . (10) 1. Description The CellTiter 96? AQ ueous One Solution Cell Proliferation Assay (a) is a colorimetric method for determining the number of viable cells in proliferation or cytotoxicity assays. The CellTiter 96? AQ ueous One Solution Reagent contains a novel tetrazolium compound [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS (a)] and an electron coupling reagent (phenazine ethosulfate; PES). PES has enhanced chemical stability, which allows it to be combined with MTS to form a stable solution. This convenient “One Solution” format is an improvement over the ? rst version of the CellTiter 96? AQ ueous Assay, where phenazine methosulfate (PMS) is used as the electron coupling reagent, and the PMS Solution and MTS Solution are supplied separately. The MTS tetrazolium compound (Owen’s reagent) is bioreduced by cells into a colored formazan product that is soluble in tissue culture medium (Figure 1, 1). This conversion is presumably accomplished by NADPH or NADH produced by dehydrogenase enzymes in metabolically active cells (2). Assays are performed by adding a small amount of the CellTiter 96? AQ ueous One Solution Reagent directly to culture wells, incubating for 1–4 hours and then recording the absorbance at 490nm with a 96-well plate reader (3,4).

实验六细胞计数及活力测定

实验6 细胞计数及活力测定 【实验原理】 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。 用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。 【实验目的】 1．练习进行细胞计数，并用细胞计数法绘制生长曲线，以了解培养细胞的生长发育特性。 2．掌握测定细胞活力的方法。 【仪器、材料与试剂】 1．仪器：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计）。 2．材料：细胞悬液。 3．试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇 【操作步骤】 1．细胞计数 ①将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 ②将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 ③静置3分钟。 ④镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算： 细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000 注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

2．细胞活力 ①将细胞悬液以0.5ml加入试管中。 ②加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。 ③吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。 ④镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。另外，活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。 3．MTT法测细胞相对数和相对活力 活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。 ①细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。 ②沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成悬液。 ③37℃下保温2小时。 ④加入4—5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。 ⑤1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。 注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。 附： 1．0.4%台盼兰染液配制：台盼兰0.4克加双蒸水至100 ml。 2．MTT配制：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4℃下保存。 3、酸化异丙醇配制：异丙醇中加入HCl使最终达0.04mol/L。 【注意事项】 1．细胞计数时的注意事项 ①消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单个细胞悬液。否则会影响细胞计数结果。 ②取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤应注意这一点。否则，前后计数结果会有很大误差。 ③镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计数。如细胞团占10%以上，说明消化不充分。 ④细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液。