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阿维菌素的研究进展_何焕君

阿维菌素的研究进展

何焕君,邱丽娜,姚伟芳,弓爱君*

,宋晓春,刘丽君

(北京科技大学应用科学学院,北京100083)

摘要:阿维菌素作为一种占主导地位的生物农药具备一般生物农药的特点,并且它的化学结构新颖,作用机制独特,杀虫活性强,杀虫谱广,但是药效慢、杀虫谱相对较窄、稳定性差和生产成本高则是其明显的缺点。该文主要从阿维菌素B1提取的研究、发酵培养基的研究、高产菌株的选育的研究这三个方面对阿维菌素目前研究的成果及其存在的问题进行了详细的阐述,并对其未来一段时间内的研究前景进行了展望。参考文献18篇。

关键词:阿维菌素;生物农药;发展状况

中图分类号:S482.2+8 文献标识码:A 文章编号:1004-311X(2006)06-0084-02

Study on the Development of Avermectins

HE Huan-jun,QI Li-na,Y AO Wei-f ang,G ON G Ai-jun *

,SO NG Xiao-chun

(Universi ty of Science and Technol ogy B eijing,Beijing 100083,C hina)

Abstr act :Avermectins (AV Ms),as a bio-pesticide,no t only possesses characters o f general bio-pesticide,but also has i ts o w n merits such as:novel chemistry structure,special functio n mechanis m,go od effect,safety to hu man and animals.As an i mpo rtant bio-pesticide,A vermec 2ti ns develops greatly.A t the same time,slo w action,lo w li ght stabili ty and high co st are i ts obvious disadvantages.In this paper,study on the distill of A vermectins B1,s tudy on the fermentatio n culture and study on the selection o f high yield bacterium were reviewed with 18references.The study stress in the near future was also mentio ned in the paper.Key wor ds :Avermectins (A V Ms);bio-pesticide;review

收稿日期:2006-04-28;修回日期:2006-09-07

作者简介:何焕君(1983-),男,本科生在读;*通讯作者:弓爱君(1964-),男,博士,教授,研究方向:微生物发酵、产品的检测及后处理,E-m ail:gongaijun2468@s https://www.wendangku.net/doc/4511664268.html, 。

农药是与人类生存活动密切相关的一类重要的农用化学品,农药安全性的各项标准趋于严格化,并不断淘汰、限制高残留农药,因而农药工业一直处于不断更新的动态发展中。在这种背景下,谁能率领新农药开发的新潮流,谁就能主宰农药市场[1]。

随着社会的进步,人们对绿色食品的需求不断增加,登记管理政策比较倾斜,生物农药有了足够的发展空间。阿维菌素(avermectins;A V Ms)又称阿佛曼菌素,是一种具有抗寄生虫活性的抗生素,其产生菌是阿维链霉菌(Stre pto myces av ermiti 2lis ),最初是1975年日本北里研究所(Ki tasato Insti tute)从日本静冈川奈市的一个土壤样品中分离得到的。阿维菌素作为生物农药的一种,自发现以来,已经受到越来越多的重视。阿维菌素不但具备一般生物农药的特点,并且它的化学结构新颖,作用机制独特,杀虫活性强,杀虫谱广,被誉为20年来抗寄生虫药物研究的重大突破。同时它也是目前生物农药中最受欢迎和较具市场竞争的产品之一[2]。阿维菌素应用至今,有关该生物农药的综述很多,内容涉及其理化特性、剂型、衍生物品种介绍、作用机理、抗药性及复配制剂的应用等。本文主要就该生物农药的优缺点、研究进展作了阐述,并对其研究前景进行了展望。

1 阿维菌素生物农药的优缺点

阿维菌素(A verm ectin),是一种新型农畜两用抗生素,属大环内酯抗生素类杀虫杀螨剂,它对多种农作物的害螨和害虫具有很高的生物活性,它是一种优良的抗生素杀虫、杀螨剂[3]

。

阿维菌素的优点很明显,它具有广谱、高效、低残留和对人畜及环境安全等特点。由于它的作用机制独特,可有效防治对常用的杀虫、杀螨剂产生抗性的害虫和害螨,是当前农业害虫综合防治中较理想的农药品种之一。

阿维菌素除了用于防治农业害虫外,亦广泛应用于治疗多种家禽体内外寄生虫病,是一种高效广谱和安全的家禽驱虫剂,对线虫、昆虫和害螨均有驱杀活性[4]。

目前用于杀虫剂生产的阿维菌素菌株多为从自然界筛选的天然菌株,虽然经过一些诱变异化,但其基因产物表达水平受到细菌自身调节系统及毒素基因拷贝数的限制,仍存在药效慢、杀虫谱相对较窄和稳定性差等制约。目前虽然已经实现了阿维菌素的工业化生产,但工业化过程中还存在菌株的

选择以及生产成本高的问题,大大限制了阿维菌素的推广应用。

2 阿维菌素的研究现状

2.1 对阿维菌素B1提取的研究

阿维菌素是由阿维链霉菌产生的一类结构相似的混合物,共有8个组分,分别命名为A1a 、A1b 、A 2a 、A2b 、B1a 、B1b 、B2a 和B2b 。其中A1a 、A2a 、B1a 和B2a 为4个大量组分,含量在80%以上;A1b 、A2b 、B1b 和B2b 为4个少量组分,含量在20%以下。其中B1的杀虫活性最高,而毒性最小。近些年众多科研工作者通过诱变等手段改造菌种的遗传特性,提高阿维菌素有效组分B1比例。其中大村智及Ikeda 在这方面做出了很多杰出的贡献[5]。目前阿维菌素B1a (大于80%)和B1b (小于20%)混合物(A bamectin)阿维菌素等用于畜牧抗虫和农业上的杀螨及选择性的杀虫剂。

阿维菌素是一种胞内产物,它的提取一般是首先通过发酵得到菌丝,再用萃取剂萃取后结晶得到[6]。工业上常用95%的乙醇、甲苯溶液、乙酸已酯等做萃取剂浸提干菌丝,然后浓缩、结晶。结晶是阿维菌素精制工艺的关键。Bagner Oarl 等介绍了一种直接用甲苯提取发酵液中阿维菌素的方法。发酵液不需过滤,直接用硫酸调节到p H 为2.5再用2B 1左右的甲苯B 发酵液于加热中提取。收集甲苯提取液,经浓缩即得阿维菌素粗品,然后再进行精制。宋渊[7]等建立了一种直接结晶法,可以使总浸提率达到97.3%;经二次结晶,纯度95%的B1提取率达到61.5%。

田益民[8]等将一次粗粉95%的热乙醇溶液4e 下静置结晶需96h;室温补水工艺(常温常压下搅拌,按溶液:水=3B 1(v P v)比例,连续流加补水)结晶需18h;真空流加补水(恒温水浴,真空条件下,隙漏搅拌,按溶液:水=3B 1(v P v)比例,连续流加补水)结晶需8h;常温静置(常温常压下静置)结晶需24h 。从实验结果可以看到,流加补水结晶法的收率明显高于静置结晶法,但B1a 含量以4e 静置结晶法最高。谢智[9]等通过程序降温结晶,晶格含杂质量降低,并且在相对过饱和度为1.2~1.4时加入晶种,则结晶产品中的B1含量最高。中科院过程工程研究所和北京科技大学采用冷却结晶法,在采用程序降温,搅拌速率为120r P min,在相对过饱和度S=1.2~1.4时加入的晶体可以获得averm ectin B1含量最高的结晶产品[10]。华东交通大学以硅胶为固定相的层析柱分离阿维菌素B1,以石油醚:异丙醇=7B 1,硅胶柱容量400g,加样量12ml 时层析柱分离B1最适宜[11]。

除了使用结晶的方法提取阿维菌素以外,蒋琳等采用层析法分离制备阿维菌素,以石油醚B 异丙醇=7B 1为洗脱液,以硅胶柱为固定相对阿维菌素B1具有良好的分离性能[12]。这

第16卷第6期:842006年12月生物技术BIO TECHN OL OG Y

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种方法较为复杂成本很高,不适合工业生产。

2.2阿维菌素发酵培养基的研究

发酵培养基是一个发酵产品工业化中非常重要的一环。发酵培养基的组分直接影响着阿维菌素的产量和生产成本。目前用于工业发酵的培养基种类有许多种。由于各种培养基成分产地不同,特别是天然组分,对发酵产量的影响很大,因此选择一种较好的培养基组合及培养条件是非常必要的。

阿维菌素的发酵时一个典型的休止-增值动态曲线,菌种在第2~3d停止增长,而后开始合成阿维菌素。由于阿维菌素是多组分的,所以不同的菌株和不同的发酵条件,各个组分的比例也不同。阿维链霉菌可以利用的碳源很多,常用的碳源有糖类、油脂、有机酸和低碳醇等。可以利用的氮源有酵母水解物、黄豆粉等。需要的无机盐包括钙盐、镁盐、磷酸盐、硫酸盐等,另外还有一些微量元素对菌丝体的生长有很大影响,如钴、锌、铁、锰等[13]。

Averm ectin是目前最有效的抗动物体内外及植物体表寄生虫的抗生素,为十六元大环内酯类物质/由链霉菌Strentom yces ave rmitilis产生,为胞内产物0,广西大学经实验研究发现, averm ectins产生菌的最佳培养条件以野生型PA)12804为出发菌,选择最佳碳源(小麦粉及最佳氮源)黄豆粉,设计发酵单位较高的培养基LE,测得最佳发酵时间为96h,发酵培养基最佳初始p H值为7.4等进行了研究,以便对该产生菌的开发提供依据[14]。

黑龙江大学以Strentom yces av ermitilis为实验菌株,通过均匀设计方法优化柞蚕生产用averm ectins发酵培养基,通过实验以玉米淀粉9%、黄豆饼粉0.5%、花生饼粉0.7%、酵母粉

0.8%、酵母膏0.1%、玉米浆0.3%、CoCl

2#6H

O0.003%、

(N H

0.02%的培养基配方可使averm ecti ns发酵产量最

高[15]。

2.3高产菌株的选育的研究

近些年众多科研工作者通过诱变等手段改造菌种的遗传特性,提高阿维菌素有效组分B1比例。其中大村智及Ikeda 在这方面做出了很多杰出的贡献。

自阿维链霉菌(Strentom yces ave rmitilis A TCC31272)中分离出了3种不同类型的菌株,其中只有产灰色孢子的菌株能产生阿维菌素(A verm ectins),摇瓶发酵单位约100Lg P mL/经高频电子流诱变和对发酵培养基的改进,选育出Sa

76菌株,其摇瓶发酵单位可达1000L g P mL0从其菌丝体中提取纯化了阿维菌素B1晶体,其紫外吸收光谱、红外吸收光谱、核磁共振谱

(1H2N MR和13C2N MR)和质谱与国外报道的一致/Sa

76菌株又经2次亚硝基胍诱变,筛选出发酵单位2000L g P mL以上的

276

8菌株0在此基础上,再次用亚硝基胍对Sa

8菌株进

行了诱变,获得Sa27629菌株,结合发酵条件的优化,其发酵单位可高达3500~4000Lg P mL[16]。

沈阳药科大学制药工程学院以S.av erm itilis Y20为出发菌株,考察该菌株的菌落特征的发酵特性,分别利用紫外线(UV)、亚硝酸(HNO

)及亚硝基胍(N T G)并结合L)异亮氨酸(L-Ile)诱导等手段对出发菌株Y20进行诱变处理,获得高产阿维菌素变异株H336,发酵单位达到852Lg P m L,与出发菌株相比,突变株阿维菌素的产量稳定,发酵单位提高了10倍以上[17]。

攸德伟等[18]人发现,由Strento myces avermitilis初始菌株经过自然分离可以得到三种不同类型的菌株,即灰色粉末型、白色和光秃型。其中灰色粉末型产毒素水平最高,摇瓶发酵效价达到6835.1Lg P mL,B1组分达到56.3%。经过紫外线和亚硝基胍对初始菌株的孢子的诱变及对其原生质体的诱变再生,并且经过异亮氨酸和链霉素的定向筛选,得到的高产菌株摇瓶发酵效价达到8542.9L g P mL,B1组分达到64.9%;同时通过对高产菌株进行传代培养检验其传代稳定性,发现传代3代后,菌株开始退化,并且其发酵效价有比较显著的下降。由于大多数突变菌株的不稳定性,经多次传代培养后会很快丧失高产特性。在菌种选育中注意选择生长强壮的菌株,并配合发酵培养基的改进,提高菌丝体干重,才能达到提高发酵单位的目的。

3发展前景

阿维菌素是一种无公害的生物农药,它具有广谱、高效、低残留和对人畜及环境安全等特点,它的独特杀虫机理,引起了国内外众多学者的广泛关注。阿维菌素的分离纯化是进一步深入研究其结构改性及产业化应用的前提,然而国内外关于阿维菌素B1分离纯化的文献报道较少。发酵培养基是发酵工业化中非常重要的一环,发酵培养基的组分直接影响着阿维菌素的产量和成本。目前用于工业发酵的培养基种类有许多种,由于各种培养基成分产地不同,特别是天然组分对发酵产量的影响很大,因此探索性能良好,廉价的培养基是非常必要的。在实验室和发酵生产中阿维菌素的原始菌株发酵单位非常低,采用单一的诱变技术,其发酵单位提高不多,而几种诱变方法配合使用,则可增大获得高产菌种的几率。此外,由于阿维菌素主要存在于菌丝体中,因此在进行高产菌株选育时,需要配合发酵培养基和通气条件的改进,才能满足新菌株获得较高菌丝干重和发酵单位。

综上所述,对阿维菌素B1提取、发酵培养基及高产菌株的选育的进一步研究,仍然是现在以及将来一段时间内研究的一个热点。

参考文献:

[1]贺红武,刘钊杰.国外农药开发的现状与发展趋势[J].湖北化工, 1999,6:1- 3.

[2]童建华,庄占兴.阿维菌素的生产和研究现状[J].农药科学与管理, 1999,20(3):36-37.

[3]吴国荃,孙诗敏,王金台等.生物农药阿维菌素[J].精细与专用化学品,2003,(14):8-10.

[4]苑金岐.阿维菌素市场调研报告[J].化工科技市场,2004,(7):42-44.

[5]扈洪波,朱蓓蕾,李俊锁.阿维菌素药物的研究发展[J].畜牧兽医学报,2000,31(6):520-529.

[6]Sven-Eric W ohlert,Natalia Lom ovs kaya,Kerry Kulo wski,e t al.Insi ghts about the bios ynthesis of the averm ectin deoxys ugar L-oleandrose through het2 erol ogus expres sion of Sreptomyces deoxysugar genes in Streptom yces lividans [J].Chemistr y&Biology,2001,8:681-700.

[7]宋渊.阿维菌素的工业化生产研究[J].精细与专用化学品,2002, 21:57-60.

[8]田益民,杨红,李艳芳.阿维菌素结晶工艺的改进[J].中国医药工业杂志,2002,33(9):432-434.

[9]谢智,常志东,孙兴华,等.Averm ecti n冷却结晶工艺的研究[J].中国抗生素杂志,2005,1(30):57-59.

[10]金亚旭.柱层析分离制备阿维菌素B1的研究[J].上饶师范学院学报,2005,3(25):55-58.

[11]蒋琳,马承铸,王少鸥,等.硅胶柱层析分离制备阿维菌素B2的效果[J].上海农业学报,2002,18(1):81-83.

[12]刘,崔明洁.高效液相色谱法测定avermectin发酵液中B1组分的含量[J].中国抗生素杂志,2002,27(4):232-233.

[13]A.L.Valenzuela,D.S.Popa,M.J.Redondo,J.Manes.C omparis on of va2 fious liquid chrom atogr-aphic methods for the anal ysis of averm ectin residues i n citrus furits[J].Journal of chromat-ography A,2001,918:59-65. [14]汪嵘,赵颖怡,梁红玉,等.Averm ec tins产生菌的最佳培养条件[J].广西师范学院学报:自然科学版,2002,19(2):4-8.

[15]田亚新,李奕.均匀设计方法优化柞蚕生产用Averm ectins发酵培养基[J].辽宁丝绸,2004,2:23-26.

[16]宋渊,曹贵明,陈芝,等.阿维菌素高产菌株的选育及阿维菌素B1的鉴定[J].生物工程学报,2000,16(1):31-35.

[17]阎浩林,何汉洲,梁丽丽.阿维菌素高产菌株的选育I[J].生物技术,2002,12(4):16-17.

[18]攸德伟,谌颉,储炬,等.复合诱变筛选averm ectins高产菌株[J].中国抗生素杂志,2005,30(3):143-147.

2006年12月阿维菌素的研究进展