一起鸭甲肝病毒1型和3型混合感染的研究报道
收稿日期：2014-05-22
中图分类号：S858.32文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2014）07-0015-04
随着集约化养鸭业的迅猛发展，鸭肝炎的危害日趋严重，尤其近年来，许多地区出现了传统1型鸭肝炎病毒的主动免疫或被动免疫均不能有效地控制鸭肝炎的爆发，给养鸭业造成了较大的经济损失[1-4]。该病主要由鸭甲型肝炎病毒（DHAV ）引起，DHAV 包括三个血清型，即DHAV -1、
DHAV-2和DHAV-3，三者均具有典型小RNA 病毒的基因组结构，但三者之间存在显著的序列差异，遗传进化关系表明三者属于三个不同的基因型，即基因A 型、基因B 型和基因C 型，血清学试验证明三者之间无交叉反应[5-6]。迄今为止，国内
鸭肝炎的流行以DHAV -1和DHAV -3为主，
DHAV-2仅在台湾发生过[7]。2013年12月，山东某鸭场12日龄樱桃谷鸭出现大批死亡，病死率达
80%以上，发病鸭呈典型的角弓反张，剖检可见肝脏明显的出血点或出血斑。为探明其发病原因，本文对该病的病原进行了研究。
1材料与方法
1.1
病料来源疑似鸭肝炎病死鸭肝脏组织：
2013年采集于山东某鸭场12日龄樱桃谷鸭，病死率达80%以上。
1.2试验动物及主要试剂3日龄无鸭肝炎母源抗体雏鸭：购于山东临清种鸭场。反转录酶(M-
MLV)，Promega 公司产品；Trizol 试剂，Invitrogen 公司产品。
1.3病毒分离取病鸭肝脏组织匀浆捣碎，加双抗作用，离心取上清，分别与等量DHAV -1和
DHAV-3阳性血清混合，37℃作用30min ，经尿囊一起鸭甲肝病毒1型和3型
混合感染的研究报道
*
孙晓军1，任建亭2，刘金凤3，杨胜富4，马秀丽
1**
(1.山东省农业科学院家禽研究所，山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室，济南250023；2.东营市广饶县职业中等专业学校，广饶
257300；3.沂南县畜牧局，沂南
276300；
4.贵州省余庆县农牧局，余庆
564400)
摘
要：自山东省某疑似鸭肝炎发病鸭肝脏中分离到两株病毒，命名为TA1和TA2，分离
毒分别回归3日龄雏鸭，可复制出鸭肝炎的典型症状和病理变化。利用鸭甲肝病毒1型（DHAV-1）和3型（DHAV-3）特异性引物进行RT-PCR 扩增，结果为阳性，经测序证实为
DHAV-1和DHAV-3。分别扩增分离毒的VP1基因，经序列测定及遗传进化关系分析发现，
分离毒TA1和DHAV-3毒株之间有较高的核苷酸序列相似性，与DHAV-3遗传距离最近，属于基因C 型；分离毒TA2和DHAV-1毒株之间有较高的核苷酸序列相似性，与DHAV-1的遗传距离最近，属基因A 型。
关键词：鸭甲肝病毒1型；鸭甲肝病毒3型；分离；RT-PCR ；混合感染
*基金项目：山东省优秀中青年科学家科研奖励基金
（BS2009YY019）;山东省现代农业产业技术体系项目
(SDAIT-13-011-01)。
作者简介：孙晓军（1978-），男，助理研究员，硕士，从事家禽流行病学研究。E-mail ：sxj-bs@https://www.wendangku.net/doc/4b11844318.html, 。
**通讯作者。E-mail ：maxiuli1978@https://www.wendangku.net/doc/4b11844318.html, 。
腔分别接种11日龄非免鸭胚5枚，0.2ml/枚，另设生理盐水对照。37℃温箱培养，观察7d，记录结果，收取死亡胚的尿囊液，按同样方法继代2次。
1.4RT-PCR鉴定参考GenBank中收录的DHAV-1和DHAV-3基因序列，利用Primer premier 5.0软件设计合成2对引物，即：DHAV-1上游引物5 'AGCACAACACTCGTCCAA3'和下游引物5' CAACAAGGCGTCCTCTAT3'，扩增片段465bp；DHAV-3上游引物5'GTTGCGATTCTTTGCCTAT
3'和下游引物5'TTGCGAGACCATTTCTTCAT3 '，扩增片段456bp。Trizol方法提取病毒RNA，进行RT-PCR扩增。回收的PCR产物送北京博尚生物有限公司完成测序。
1.5动物回归试验选择无鸭肝炎母源抗体的3日龄雏鸭18只，分为三组，6只/组，其中两组取收获的疑似DHV尿囊液与胚体混合物以颈背部皮下注射方式进行攻毒，攻毒量为0.5ml/只；另一组为对照组，以相同的方式注射生理盐水。隔离饲养，观察并记录发病和死亡情况。
1.6VP1基因的扩增及序列分析利用RT-PCR 分别扩增分离毒TA1和TA2的VP1基因，回收目的片段克隆至pMD18-T载体中，双酶切法鉴定正确后送北京博尚生物有限公司完成测序。将测序的分离毒与本实验室测定的12个毒株及GenBank中公布的DHAV-1毒株（R85952，DRL-62）、DHAV-2毒株（90D，04G）及DHAV-3毒株（AP-03337，AP）进行核苷酸序列分析，用Boot-strap法(Replication 值为1000)计算基因遗传距离并绘制进化关系发生树，其中Bootstrap值小于50%的数值未显示，分析分离毒与参考毒株之间的遗传距离。
2结果
2.1病毒分离及RT-PCR鉴定将疑似病料分别用DHAV-1和DHAV-3阳性血清中和后接种鸭胚，第1代出现鸭胚零星死亡，第2代后出现规律性死亡，死亡多集中于48～72h之间；死亡鸭胚主要表现为全身水肿、充血，肝脏出血或边缘坏死。利用自行设计的两对引物分别对分离毒的RNA模板进行RT-PCR扩增，结果分别获得大约465bp和456bp的目的片段（图1和图2），经测序分析正确，将分离毒命名为TA1和TA2。
图1分离毒株RT-PCR扩增(DHAV-3引物
)
100bp
250bp
500bp
750bp
1000bp
2000bp
M12
M：Marker DL2000；1：分离毒TA1；2：分离毒TA2
465bp
图2分离毒株RT-PCR扩增(DHAV-1引物)
100bp
250bp
500bp
750bp
1000bp
2000bp
M12
M：Marker DL2000；1：分离毒TA2；2：分离毒TA1
456bp
2.2动物回归试验将分离毒回归3日龄雏鸭，TA1分离毒48h内死亡率达8
3.3%，TA2分离毒60h内死亡率达66.7%，死亡鸭病变与DHAV引起的症状和病变相同，主要表现为典型的角弓反张，肝脏明显的出血点或出血斑。
2.3VP1基因的扩增与克隆采用RT-PCR方法分别扩增分离毒TA1和TA2的VP1基因，结果获得720bp和714bp的目的片段，将PCR产物纯化后克隆至pMD18-T载体中，经酶切鉴定均正确（图3和图4）。
图3重组质粒pMD-TA1的酶切鉴定
100bp
250bp
500bp
750bp
1000bp
2000bp
M1
M：DNA Marker DL2000；1：重组质粒pMD-TA1
720bp
图4重组质粒pMD-TA2的酶切鉴定
M
1
M ：DNA Marker DL2000；1：重组质粒pMD-TA2
714bp
100bp
250bp 500bp 750bp 1000bp 2000bp 2.4序列分析序列分析发现，分离毒TA1与
DHAV-1和DHAV-3毒株之间的核苷酸序列相似性分别为71.4%~72.8%和92.8%~98.5%，而分离毒TA2与DHAV-1和DHAV-3毒株之间的核苷酸序列相似性分别为为94.7%~95.5%和70.4%~
72.3%，两者与DHAV-2之间的核苷酸序列相似性较低，仅为69%~72.5%。进化关系分析结果进一步表明分离毒TA1与DHAV-1之间的遗传距离最近，处于同一个分支；TA2与DHAV-1之间的遗传距离最近，处于同一个分支（图5）。
图5分离毒株与其他DHV
进化关系分析
DHAV-3
DHAV-2
DHAV-1
3讨论
3.1
RT-PCR 方法是病原快速诊断的首选方法，
因此，我们首先设计引物对病料进行核酸检测，结合常规病毒分离及动物回归试验结果，确诊该病例为DHAV-1和DHAV-3混合感染，两个分离毒均不能被不同血清型的阳性血清中和，进一步证实DHAV-1和DHAV-3之间无血清交叉反应。
3.2为进一步研究分离株的特性，我们对分离毒
TA1和TA2的VP1基因进行了序列测定及进化关系分析，结果发现，分离毒TA1与DHAV-3毒株之
间的核苷酸序列相似性较高，遗传距离较近，分布在相同的遗传谱系，属于基因C 型；而TA2与
DHAV-1毒株之间的核苷酸序列相似性较高，处于同一遗传谱系，属基因A 型。结合血清中和试验，进一步证实基因型和血清型之间存在的对应关系[8-9]。
3.3目前鸭肝炎疫苗只有DHAV-1疫苗获得批
准文号，DHAV-3疫苗尚在研制中，然而，DHAV-3给养鸭业造成的危害越来越严重，鸭肝炎的防控不容乐观。因此，有必要加快鸭肝炎多价疫苗的深入研究，为今后鸭肝炎的有效防控奠定基础。
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Study on combind infection of Duck Hepatitis Virus type1and type3 SUN Xiao-jun1，REN Jian-ting2，LIU Jin-feng3，YANG Sheng-fu4，MA Xiu-li1**
(1.Institute of Poultry Science of Shandong Academy of Agricultural Sciences,Jinan,250023；
2.Guangrao vocational secondary specialized schools,Guangrao,257300;
3.Yinan animal husbandry bereau,Yinan276300；
4.Department of Yuqing Agriculture and Animal Husbandry bureau,Yuqing564400)
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Two stains of duck hepatitis virus isolated from Shandong province were named TA1and TA2.Clinical symptom and pathological lesion could be reproduced in3-day ducklings challenged by the isolated strain.Two pairs of primers were designed and a reverse transcriptase polymerase chain reaction method was developed for strains TA1and TA2.
Nucleotide sequence identity of VP1gene between strain TA1and DHAV-3strains was higher than DHAV-1.However,it was lower between strain TA2and DHAV-3than DHAV-
1.Phylogenetic and evolutionary analysis showed that isolated strain TA1belonged to genotype
C,which were on different branches from strain TA2belonged to genotype A.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：DHAV-1；DHAV-3；isolation；RT-PCR；Combind infection□
□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□
目前，舍饲鸡场清粪方式大致有三种：一是大型养鸡场，一般用清粪机定时清粪，但成本较高，一般中小养殖户难以接受；二是蓄粪沟一次性清粪，这种清粪方式解决不了鸡粪含水量大、鸡舍有害气体含量过高、蛆蝇孳生等严重问题；三是鸡舍笼架下水平地面定时清粪，这种清粪方式存在污水、鸡粪横溢、走道污染严重、劳动强度大、鸡舍不卫生等问题。现介绍一种清粪新方法，不仅解决鸡舍污染问题，而且具有投资小、便于操作、劳动强度低等特点。具体方法如下：改进方法在鸡舍过道的两侧，以鸡笼下层底网外侧缘和地面的垂直点处与走道平行开一条宽25~30cm的集粪沟(与清粪用的平头铁锹等宽)，沟长与鸡笼长度相等，集粪沟深度20cm，沟底坡度3~5°，鸡舍入门端沟底稍高，另一端的沟底稍低，与集粪沟对应的鸡舍房山墙处留一出粪口，以便粪水流到舍外。通道及笼下地面相应要有一定弧度，中间稍高，两侧稍低，坡度为3°。
地面、通道与集粪沟均用水泥硬化成光滑地面。
使用工具及操作方法使用工具有集粪刮板、平头铁锹。如果集粪沟的长度大于15m时，可以使用推粪车。
操作方法用集粪刮板将笼下鸡粪刮入集粪沟，用平头铁锹将粪沟内的鸡粪分段多次推至舍外，或将鸡粪装入粪车内经出粪门处推至舍外。清粪完毕后，用水清洗走道、笼下地面，污水经集粪沟流至舍外。
优点①鸡粪入沟推至舍外，减少了地面污染和下层笼底、鸡蛋、水槽和料槽的污染；②鸡粪内含水量大，粪水经具有一定倾斜度的笼下地面渗出至集粪沟而排出舍外，使鸡粪较干燥，便于清理、运输及加工增值；③鸡笼下的污水不会流到通道上，便于走道和地面冲洗，保证了工作通道的卫生，减少了鸡舍与鸡舍之间的疫病传播。鸡舍无陈旧鸡粪，避免了蛆蝇孳生；④鸡粪处理可以舍外操作，减少了鸡的应激反应。
甲肝病毒
甲肝病毒英文名为Hapatitis A virus,HAV，是一种寄生于肝脏上的病毒，首先在急性期患者的粪便中发现。 编辑摘要 甲肝病毒- 甲肝病毒概述 1973年Feinslone 首先用免疫电镜技术在急性期患者的粪便中发现甲型肝炎病毒(Hapatitis A virus,HAV ) 。属微小RNA病毒科，新型肠道病毒72型。人类感染HAV后，大多表现为亚临床或隐性感染，仅少数人表现为急性甲型肝炎。一般可完全恢复，不转为慢性肝炎，亦无慢性携带者 甲肝病毒 甲肝病毒- 生物学性状 （一）形态与结构 病毒呈球形，直径约为27nm。无囊膜。衣壳由60个壳微粒组成，呈20面体立体对称，有HAV的特异性抗原(HAVAg)，每一壳微粒由4种不同的多肽即VP1、VP2、VP3和VP4所组成。 在病毒的核心部位，为单股正链RNA。
除决定病毒的遗传特性外，兼具信使RNA的功能，并有传染性。 HAV的单股RNA，其长度相当于7400个核苷酸。在RNA的3′末端有多聚的腺苷序列，在5′末端以共价形式连接一由病毒基因编码的细小蛋白质，称病毒基因组蛋白（Viral protein ,genomic,VPG）。 它在病毒复制过程中，能使病毒核酸附着于宿主细胞的核蛋白体上进行病毒蛋白质的生物合成。 （二）病毒感染模型与培养 黑猩猩和狨猴对HAV易感，且能传代，经口或静脉注射可使动物发生肝炎，并能在肝细胞冻中检出HAV。在潜伏期和急性期的早期，HAV可随粪便排出。恢复期血清中能检出HAV的相应抗体。 1979年Provost 等首次成功地将已适应在狨猴传代的毒株培养于原狨猴肝细胞或恒河猴胚肾细胞FPhK6株中。我国学者也先后成功地使HAV在肝癌细胞株中增殖。病毒在组织培养细胞中虽可增殖。但不引起细胞病变，且增殖与细胞释放均甚缓慢。应用免