苯乙炔自身偶联法制备共轭二炔

苯乙炔自身偶联法制备共轭二炔

及其定性、定量分析

一、实验目的

1.了解偶联反应的定义、分类及其应用

2.了解并掌握如何完成简单目标化合物的合成、分离及性质测定

3.了解气相色谱中以内标法定量测定产率的方法

4.掌握萃取、薄层层析、柱层析、重结晶、抽滤等基本操作

5.掌握熔点、紫外-可见光谱、红外光谱的测定方法

二、实验原理

偶联反应（Coupling Reaction）是有机化学中的一类重要反应，是指两个有机单元之间通过某种化学反应，形成新的化学键，从而得到一个新的有机分子的过程。传统意义上的偶联反应一般涉及到金属有机化合物（Organometalic Compounds）参与的碳-碳键的形成；但是现代意义上的偶联，其范围相应地由碳原子扩展到各类杂原子（Heteroatoms）；并且其过程既可能是金属有机化合物催化或参与的，也有可能是其它的有机物催化或参与的。

因为偶联反应可以看做是两个有机单元相互连接得到一个新的有机单元，所以偶联反应是有机合成（Organic Synthesis）中一类非常重要的增长碳链的方法。一类典型的反应就是亲核性的（Nucleophilic）金属有机化合物，如格氏试剂、芳基硼酸、有机锌试剂等，在催化剂作用下和亲电性的（Electrophilic）有机部分，如各类卤代烃等发生反应；亲核性的有机部分和亲电性的有机部分相结合，得到更长的碳链。例如下图所示，在钯配合物催化下，亲核性的对甲基苯基锌试剂和溴苯发生偶联反应，得到4-甲基联苯。

由此可见，偶联反应可以看做是有机合成中的“浆糊”，能够把各种有机部分结合起来，因此在有机合成中占据着非常重要的地位。20世纪60年代起，有机化学家发现钯、铑、镍等过渡金属的配合物可以催化许多偶联反应的进行，并且将亲核试剂和亲电试剂的种类进行了扩展，得到系列人名反应，如Negishi反应、Heck反应、Suzuki反应、Stille反应等。其中，Heck、Negishi和Suzuki还因此而荣获2010年诺贝尔化学奖。

按照发生反应的两个有机单元的种类，可以把偶联反应分为自身偶联（Homo-coupling）和交叉偶联（Cross-coupling）反应两大类：当两个有机单元各不相同时被称为为交叉偶联，而当两个有机单元相同时被称为自身偶联。

本项目的合成部分是从末端炔烃出发，在Ni、Cu催化剂作用下，以空气为氧化剂发生自身偶联反应，得到1,3-二炔。1,3-二炔是一类结构特殊的化合物。

从空间结构上来看，它包含四个sp杂化的碳原子，四个碳原子呈线性排列，且整体结构呈现一定的刚性；两个叁键之间可以形成共轭结构，因此也被称为共轭二炔（conjugated diyne），如下图所示。

共轭二炔本身存在于许多天然化合物中，还可以作为某些染料的前体；其刚性、共轭的结构也得到了材料化学家的注意，许多新型有机功能材料中就包含了这一结构。最近还有报道发现这类二炔还表现出光活杀虫的特性，是一类潜在的高效低毒的生态光活农药的关键结构。

本项目以苯乙炔为起始原料，以六水合氯化镍、碘化亚铜、四甲基乙二胺为催化剂，以空气为氧化剂，制备1,4-二苯基丁二炔，如下图所示。

反应过程中用薄层层析色谱来进行监测；反应结束后，可以用气相色谱法分析产物，并使用内标法计算产率；产品用柱层析方法进行分离并重结晶后，分别测定其熔点和紫外-可见光谱吸收。

气相色谱内标定量法是指向反应体系中加入定量的某种内标物（internal standard），然后对体系取样，用气相色谱进行分析，通过对比产物和内标的峰面积，从而得到产物的含量的一种分析方法。由于其简便易行，准确度、可靠性较高，因此广泛应用于各类探索性有机反应的产率的迅速测定。

假设某反应体系中待测组分的质量为m x1，加入的内标质量为m s1，相应的GC峰面积为A x1和A s1；则存在等式：

错误！未找到引用源。（式1）

其中，k为系数。在相同的仪器、相同的条件下，k值是一个常数。

另取定量（m x2）的待测组分和定量的内标（m s2）配成溶液并在相同条件下进行GC分析，其峰面积为A x2和A s2；则同样存在一个等式：

错误！未找到引用源。（式2）

从式2可以算出k的值，将其代入式1，就可以算出待测组分的质量m x1，进而推测出反应的产率。

一般，内标化合物的选择遵循几个基本原则：首先，不和反应体系发生反应，且自身有一定的稳定性；其次，一般和待测化合物的结构类似；并且，内标化合物在GC上应该有明显的峰，且可以和待测化合物明显分开；最后，对于需要最终分离出产品的体系而言，内标化合物应该可以用较简便的方式和待测化合物分离。

三、试剂和仪器

1.试剂

苯乙炔（98%）、六水合氯化镍（A.R.）、碘化亚铜（A.R.）、四甲基乙二胺

（A.R.）、四氢呋喃（A.R.）、二苯甲酮（A.R.）、石油醚（30-60o C）、乙酸

乙酯（A.R.）、稀盐酸（2mol/L）、甲醇、碳酸氢钠、二氯甲烷、柱层析硅

胶（200-300目）、薄层层析硅胶（GF254）、无水硫酸钠、石英砂、脱脂

棉、羧甲基纤维素钠

2.仪器

烧瓶、烧杯、锥形瓶、层析缸、载玻片、分析天平、层析柱、试管、试

管架、熔点管、蒸馏装置、移液管、容量瓶、量筒、毛细管（内径0.5mm）、50mL分液漏斗、抽气头、双联球、长颈漏斗、洗耳球、干燥器

气相色谱仪、熔点测定仪、254nm紫外灯、磁力搅拌器

四、实验步骤

1.合成1,4-二苯基丁二炔

用分析天平称取0.36g六水合氯化镍、0.28g碘化亚铜于50mL圆底烧瓶中，并加入一个干净的磁子。量取25mL四氢呋喃并加入到圆底烧瓶

中，加入0.45mL（0.34g，3mmol）N,N,N’,N’-四甲基乙二胺。搅拌5分钟

后，取3.06g（30mmol，3.4mL）苯乙炔加入到体系中。在瓶口塞上一团

棉花，并室温搅拌。

搅拌1小时后、5小时后、24小时后，分别用毛细管点样，薄层层析1，监测反应进行情况。待苯乙炔基本反应完全后（最长不超过30小

时），停止反应。记录并描绘此时薄层层析的结果。

向反应体系中加入10mL稀盐酸、25mL水和10mL乙酸乙酯，搅拌10分钟后静置分层。分液，收集上层有机相。剩余水溶液以10mL乙酸

乙酯萃取，合并有机相。将有机相用碳酸氢钠水溶液和清水各洗涤一次

后，以无水硫酸钠干燥至少8小时，除去固体物质，保留液相，并以石

油醚为展开剂，进行薄层层析，记录层析结果。

2.柱层析

本实验采用干法填柱、干法上样。

向有机相中加入约3-4g硅胶，震荡均匀后，置于85o C水浴中浓缩，蒸走大部分溶剂。然后在50o C水浴中抽真空约30分钟2，至硅胶变成松

散的粉末状。小心撤去真空，用刮勺小心地将附在瓶壁上的硅胶刮下后，再抽真空约10分钟，得到的吸附了样品的硅胶应该是呈松散、干燥状态

的粉末，无结块、颗粒。

取一根层析柱（内径约30-40mm），底部塞上一小团棉花，并用长玻棒压实，再用长颈漏斗加入少量石英砂，把底部填平（如果层析柱下端

有多孔板或砂芯，则底部可不需加石英砂）。通过长颈漏斗加入层析硅胶，填充高度约为8cm。加入石油醚，使液柱高度超过10cm。打开层析柱阀

门，并使用双联球加压，石油醚液面将下降，至液面高出硅胶层1cm左

右。然后将流出的石油醚倒回层析柱，继续加压使石油醚流出，如此反

复5次，将硅胶层均匀压实。最后一次结束时，保持液面高出硅胶层约

1-2cm；轻晃层析柱，使硅胶面平整。至此，填柱阶段完成。

通过长颈漏斗小心将吸附有样品的硅胶加入柱中。用洗耳球轻敲柱体，尽量使样品层均匀沉积3。静置1分钟，保证硅胶层上面液柱的高度

不少于1cm，然后小心地加入石英砂，石英砂层的厚度保持在1cm，轻

轻晃动层析柱，使石英砂层上缘平整。

打开底部活塞，使柱内液面下降至和石英砂层平齐，关闭活塞。补加约10mL石油醚，再打开活塞，令液面下降至和石英砂层平齐。至此，

上样阶段完成。

向层析柱内加入石油醚至低于柱口5cm，打开底部活塞，使用小锥瓶接收淋洗剂并给锥瓶编号，并用紫外灯随时监测淋洗剂至无紫外吸收

4。然后将淋洗剂换成体积比为20:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶液，继

续淋洗至收集的淋洗剂中无紫外吸收。TLC检测各锥瓶中物料成分，并与

1,4-二苯基丁二炔的标准溶液进行对照。收集只含有二炔组分的溶液，合

并。

3.浓缩纯化产物

将产品溶液合并后，使用80-90o C水浴常压蒸馏浓缩至约15-30mL（此部分蒸出的石油醚可回收）。余下部分转入一已称重的50mL小烧瓶5，在

80-90o C水浴中浓缩至不再有液体蒸出（此部分溶剂不回收）。将烧瓶连

接水泵6，置于60o C水浴中抽真空约10-20分钟至干燥。冷却称重，计算

产率。

4.重结晶并表征产品

搭建磁力搅拌回流装置，磁力搅拌下，将上述产品溶解于尽量少的热甲醇中，再加入1-2mL甲醇，自然冷却，塞上塞子静置。待晶体充分

析出后，抽滤，将产品尽量抽干，得到白色粉末状或针状晶体。产品置

于表面皿中干燥7。小心收集产品并称重，记录重结晶后产品的质量及性

状，计算精制产率。将重结晶后的精制产品分别测熔点、紫外可见吸收

光谱（记录最大吸收波长λ1）。

五、实验结果讨论及思考题：

1.比较三次得到的产率，并分析其存在差异的原因。

2.查阅资料，指出柱层析中常见的装柱方法和上样方法。

3.为什么在反应结束后要向体系中加入稀盐酸？

4.思考柱层析中石英砂的作用。请注意层析柱中有两个部分用到了石英砂。

5.使用GC分析体系的产率有什么优点？存在哪些局限性？

6.记录最终产品的熔点、紫外-可见光谱、红外光谱，并分析。

六、部分化合物参数

注释：

(1) 薄层层析方法：首先配置标准样品，取1滴苯乙炔，稀释于1mL四氢呋喃中；另取1,4-二苯基丁二炔晶体少许，溶于约0.2mL四氢呋喃中。苯乙炔和1,4-二苯基丁二炔的标准样品即已配置好。在层析板上点样时，从左至右点三个点，分别为苯乙炔、样品、1,4-二苯基丁二炔。迅速将层析板置于层析缸中，展开剂为石油醚。注意展开剂不要没过样品点。薄层层析结束后，迅速拿出层析板，并置于紫外灯下检测。由于苯乙炔沸点较低，因此须在1分钟内进行观测，并将结果记录下来，以防苯乙炔挥发。

(2) 在烧瓶口接上一个抽气头，并一定要在抽气头内塞入一团脱脂棉，以免将硅胶抽入到真空泵中。

(3) 如果有硅胶附在层析柱壁上，用尽量少的石油醚将其冲下来，但是如果少量硅胶难以冲下，则可以将其忽略。

(4) 可使用毛细管蘸取淋洗剂后，在GF254硅胶板上点样，自然风干后，直接使用紫外灯照射。出现蓝紫色斑点的则表示存在产物；如果无斑点或非常淡，则表示基本无产物。

(5) 可使用少量二氯甲烷帮助转移。

(6) 连接水泵时需要相应大小的抽气头，并在抽气头内塞一小团棉花，以防将产品抽入水泵。

(7) 有条件的话，可以使用红外干燥。

参考文献：

石炜，李宜航，徐作满，郭双双，师瑶，李雪刚。1，4 －二苯基－ 1，3 －丁二炔的温和条件合成及分离[J].广州化工，2013,41（8）：212-214

尹坤，铜催化的均相偶联反应，有机化学，2010

酶偶联法测定血清血管紧张素转换酶

中华医学检验杂志 CHINESE JOURNAL OF MEDICAL LABORATORY SCIENCES 1998年 第6期 No.6　November 科技期刊酶偶联法测定血清血管紧张素转换酶 金化民　张茨　陈葳　陈谦 【摘要】　目的　建立一种测定血管紧张素转换酶(ACE)的酶偶联法。方法　血清与底物马尿酸双甘肽(Hip-Gly-Gly)混合温育30分钟，生成马尿酸(Hip)与双甘肽(Gly-Gly)，再加入L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺(GGCN)和γ-谷氨酰基转移酶(GGT)，催化GGCN与Gly-Gly偶联，产生的3-羧基-4-硝基苯胺于410 nm波长测定其吸收度。结果　当底物pH8.0，GGCN1.0 mmol/L，GGT 6.7 kU/L时，ACE活性与吸收度值有良好线性。55份健康人血清ACE(±s)289±83 U/L，CV：批内4.6%；批间4.8%。10份肉样瘤患者血清ACE(±s)748±34.9 U/L，批内CV3.9%，回收率96%～103%。结论　酶偶联法测定ACE活性具有操作简便、迅速、重复性好，适用于手工操作或自动化分析，可用于诊断早期肺损伤和人类免疫缺陷病毒感染。 【关键词】　酶偶联法 γ-谷氨酰基转移酶 血管紧张素转换酶 活性 Determination of serum angiotensin-converting enzyme by enzyme coupling spectrophotometry Jin huamin Zhang Ci, Chen Wei, et al. First Affiliated Hospital ， Hubei Medical University, Wuhan 430060 【Abstract 】　Objective To establish a new method to measure ACE activity using the coupled reaction which is catalyzed by γ-glutamyl-transferase (GGT). Methods GGT was added as catalyts after the mixture of serum and substrate hippurylglycyl-glycine had been incubated for 30 minutes at 37℃, it participated from as receptor substrate for a γ-glutamyl group transfered from a donor substrate, L-γ-glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilide was measured at 410 nm. Results The ACE activity and absorptance was linearly related when pH was 8.0, GGCN was 1.0 mmol/L, and GGT was 6.7 U/L. The mean value (±s) of serum ACE in 55 normal and 10 sarcoid specimens was 289±83 U/L, and 748±34.9 U/L respectively, and the within-run and between-run CV was 4.6% and 4.8% respectively. The later within-run CV was 3.9%, and the recovery rate was 96%～103%. Conclusion ECS is a simple, quick, and reliable method, and it can be used for early detection of the infection of HIV and the damage of the lung. 【Key words 】　Enzyme coupling spectrophotometry Gamma-glutamyltranspeptidase Angiotensin-converting enzyme Activity 血管紧张素转换酶(Angiotensin-Converting Enzyme, ACE∶EC为3.4∶15.1)，又名激肽酶Ⅱ，按系统命名法为肽酰二肽水解酶，属于羧基外肽酶。它的生理功能是催化血管紧张素Ⅰ(ATⅠ)水解成为血管紧张素Ⅱ(ATⅡ)，释放出组-亮二肽；也可水解缓激肽，释放出苯丙-精二肽。 ACE是一种血管内膜细胞核膜糖蛋白，在体内分布很广，几乎遍布人体各个脏器，归纳起来分为血管内和血管外两类。血管内ACE主要分布在肺血管床；血管外ACE主要分布在肾近曲小管和小肠绒毛的刷状缘。在某些疾病，一些由单核细胞分化而来的细胞可产生大量的ACE并释放入血，引起血清ACE活性升高，在临床上具有诊断意义。国外已将ACE测定列为结节病上皮样肉芽肿，高雪病的诊断和预后估计的常规项目［1］。血清ACE活性变化在诊断急性肺损伤及人类免疫缺陷病毒(HIV)感染方面已受到极大重视。相继建立了荧光光度法、放射性同位素法、高效液相色谱法和分光光度法。这些方法都是基于ACE水解基质马尿酸-组氨酰-亮氨酸或马尿酸双甘肽(Hip-Gly-Gly)，产生马尿酸(Hip)和组氨酰亮氨酸或双甘肽(Gly-Gly)，然而这些方法有的要用有机溶剂提取［2］，有的需要衍化或去除血清蛋白，还有的需要特殊设备或接触放射性试剂［3］，因而推广应用受到限制。近年来，Groff等［4］报告一种由γ-谷氨酰基转移酶(GGT)作指示酶的酶偶联法测定血清ACE，认为是目前测定ACE的理想方法。该法操作简单，重复性好，既可用于手工操作，又可用于自动化分析。我们根据国内条件作了一些改进和探讨，报告如下。 材料与方法 一、试剂 1.HEPES缓冲液(50 mmol/L)：取HEPES(Sigma产品)1.191 g加双蒸水100 ml溶解，用于配制GGT、GGCN和基

生物氧化习题 (2)

第六章生物氧化 复习测试 （一）名词解释 1. 生物氧化 2. α-脱羧 3. 氧化脱羧 4. 呼吸链 5. 氧化磷酸化 6. 底物水平磷酸化 7. P/0比值 8. 氧化磷酸化解偶联9. 递氢体和递电子体 10．苹果酸-天冬氨酸穿梭 （二）选择题 A型题： 1．生物氧化CO2的产生是： A．呼吸链的氧化还原过程中产生 B. 有机酸脱羧 C. 碳原子被氧原子氧化 D. 糖原的合成 E. 以上都不是 2．生物氧化的特点不包括： A. 遂步放能 B. 有酶催化 C. 常温常压下进行 D. 能量全部以热能形式释放 E. 可产生ATP 3. 可兼作需氧脱氢酶和不需氧脱氢酶的辅酶是： A. NAD+ B. NADP+ C. FAD D. CoQ E. CytC 4. NADH氧化呼吸链的组成部份不包括： A．NAD+B．CoQ C．FAD D．Fe-S E．Cyt 5. 下列代谢物经过一种酶脱下的2H，不能经过NADH呼吸链氧化的是：A．苹果酸B．异柠檬酸C．琥珀酸D．丙酮酸E．a-酮戊二酸6．丙酮酸转变成乙酸辅酶A的过程是： A．α-单纯脱酸，B．β-单纯脱酸C．α-氧化脱酸D．β-氧化脱酸E．以上都不是 7．下列关于呼吸链的叙述哪项是错误的： A．复合体Ⅲ和Ⅳ为两条呼吸链共有 B．可抑制Cytaa3阻断电子传递 C．递氢体只递氢，不传递电子 D．Cytaa3结合较紧密 E．ATP的产生为氧化磷酸化 8．各种细胞色素在呼吸链中传递电子的顺序是： A．a → a3→ b → C1→1/2 O2 B．b →C1→C →a →a3→1/2 O2 C．a1→b →c →a →a3→1/2 O2 D．a → a3→ b → c1→ a3→1/2 O2 E．c →c1→b →aa3→1/2 O2

SMCC法抗体定向偶联技术的优化与应用研究介绍

华中科技大学 硕士学位论文 SMCC法抗体定向偶联技术的优化与应用研究 姓名：冯燕 申请学位级别：硕士 专业：生物医学工程 指导教师：杨祥良 2011-05-24

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 摘要 蛋白质偶联技术是采用一定的技术手段将具有生物活性的蛋白质与其它载体分子或标记物结合在一起的一种方法，在生命科学和医学领域有着广泛的应用。在标记免疫分析方法中，抗体与酶等标记物的偶联效果会直接影响到免疫方法的灵敏度和可靠性。 常用的偶联方法如戊二醛法、碳二亚胺法、过碘酸钠氧化法法等不可避免地会产生酶或抗体的自身交联产物或多聚物，致使偶联效率降低、结合物活性减弱。在此基础上发展起来的异性双功能偶联剂虽然可以克服这一不足，但酶在抗体上的连接位点具有随机性，导致抗体和酶的活性会受到影响。因此，在实际应用中，需建立一种能定向偶联的抗体偶联技术。 本研究采用SMCC法，研究优化了免疫球蛋白IgG与辣根过氧化物酶HRP的偶联条件，主要研究内容包括： 1) 采用体内诱生腹水法制备氯霉素单克隆抗体，并对其活性进行测定，建立竞 争曲线。 2) 从投料比、反应温度、反应时间三个方面对抗体的DTT还原反应过程进行 了研究，探讨了还原条件对免疫球蛋白的结构、活性等方面的影响。 3) 采用SMCC法将抗体与HRP偶联，并对其活性进行鉴定，并将其用于酶联 免疫吸附实验。 研究结果表明，DTT还原反应的温度和时间对抗体结构和活性影响不大，而DTT 的加入量则有明显影响：在封闭巯基的条件下，投料比小于为600时，还原产物以大分子片段居多，当投料比大于600后，产物主要为小分子片段，且抗体活性开始下降，到6000时活性几乎完全丧失；在未封闭巯基条件下，由于游离巯基会重新聚合，当投料比在600～12000之间，抗体活性与产物的组成差异均不明显。在将其应用于羊抗小鼠二抗与HRP的偶联中，确定优化的SMCC法偶联条件为DTT与抗体

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介 （一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）、NaN3 0.02%(w/v)的缓冲液中。 碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液） 2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液） 4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下0.5ml） 5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、 4度搅拌12小时 7、静置10小时（4度） 8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。 孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。 2、加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用pH7.4，浓度50 m mol/L 的磷酸缓冲液溶解）中。 5、 （二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、用0.1 mol/L HCl溶液配制4 m mol/L浓度的半抗原。 2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。 3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。 4、用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。 5、边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。

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抗体偶联药物研发中的生物分析 李秀立, 陈笑艳, 钟大放* (中国科学院上海药物研究所, 上海药物代谢研究中心, 上海201203) 摘要: 抗体偶联药物(antibody-drug conjugates, ADCs) 是一类单克隆抗体通过一段连接臂共价偶联细胞毒性小分子化合物而成的复合物, 可以提高抗肿瘤药物的靶向性并减少毒副作用。ADCs结构具有异质性并且其药物?抗体比值(drug-to-antibody ratio, DAR) 在体内呈动态变化, 其生物分析面临着巨大的挑战, 常用的定量分析包括酶联免疫吸附反应(ELISA)和液相色谱?质谱分析(LC-MS)。ADCs同其他生物制品一样, 在体内可能会产生抗药抗体(anti-therapeutic antibody, ATA), 影响其药效、药动学及安全性, 因此有必要评价其免疫原性。本文综述了在ADC研发过程中常见的基于ELISA和LC-MS方法的待测物分析, 包括DAR分布、总抗体、结合型抗体、结合型药物、游离药物以及ATA分析, 可为我国的ADCs研发提供参考。 关键词: 抗体偶联药物; 药物?抗体比值; 免疫原性; 酶联免疫吸附反应; 液相色谱?串联质谱 中图分类号: R917 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2016) 04-0517-12 Bioanalysis in the development of antibody-drug conjugates LI Xiu-li, CHEN Xiao-yan, ZHONG Da-fang* (Shanghai Center for Drug Metabolism and Pharmacokinetics Research, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China) Abstract: Antibody-drug conjugates (ADCs) are complex molecules with cytotoxic small molecular drugs covalently bound to monoclonal antibodies via a linker and can improve the targeted drug delivery with minimizing the systemic toxicity. ADCs are heterogeneous mixtures with different drug-to-antibody ratios (DARs) and the DAR distribution is dynamically changing in vivo, therefore the bioanalysis of the ADCs is challenging. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and LC-MS have been widely used in the ADCs bioanalytical assays. Just like other biotherapeutics, ADCs may elicit the host immune response and produce the anti-therapeutic antibody (ATA), which could affect its efficacy, pharmacokinetics, and safety. It is thereby important to investigate its immunogenicity in the ADC development. In this review, we summarized the ELISA- and LC-MS-based bioanalysis strategies for the development of ADCs, including DAR distribution, the determination of total antibody, conjugated antibody, conjugated drug, free drug, and ATA, with the expectation of providing insights and reference for the ADC development in China. Key words: antibody-drug conjugate; drug-to-antibody ratio; immunogenicity; enzyme-linked immunosorbent assay; LC-MS 抗体偶联药物(antibody-drug conjugates, ADCs) 是一类单克隆抗体通过一段连接臂(linker) 共价偶 收稿日期: 2015-09-08; 修回日期: 2015-10-11. *通讯作者 Tel / Fax: 86-21-50800738, E-mail: dfzhong@https://www.wendangku.net/doc/4512301911.html, DOI: 10.16438/j.0513-4870.2015-0792联细胞毒性小分子化合物而成的复合物, 用于治疗恶性肿瘤。单克隆抗体可以靶向结合肿瘤细胞表面的抗原, 通过细胞内化作用进入细胞。进入细胞后, 其结构中的小分子药物在溶酶体低pH环境或蛋白酶作用下释放出来, 发挥细胞毒作用。由于单克隆抗体的靶向性, 正常组织细胞内药物浓度较低。因此与传统

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介

常用的半抗原与蛋白偶联 方法简介 Last revision date: 13 December 2020.

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介 （一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。 碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液） 2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III液） 4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下） 5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、4度搅拌12小时 7、静置10小时（4度） 8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。 孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。 2、加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和 DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用，浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。 5、 （二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、用 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。 2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。 3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。

抗体偶联药物

抗体偶联药物（ADC的涅槃重生 抗体偶联药物（antibody-drug conjugate, ADC ）是将抗体与细胞毒性药物连接起来，通过抗体的靶向作用将细胞毒药物靶向肿瘤，进而降低化疗中常见的 药物非特异性的全身毒性。抗体偶联药物（antibody-drug conjugate, ADC ）的研究可以追溯到1980s，，但是直到2000年，首个抗体偶联药物gemtuzumaboz ogamicin （商品名Mylotarg，Pfizer研发）才被FDA B准用于治疗急性粒细胞白血病，但由于偶联技术、靶向性、有效性等受限，完整的抗体偶联药物在血液不稳定，导致致死性毒性的产生，于2010年撤市。这使得本就不明朗的ADC药物研究，更蒙上了一层阴影。 但是随着Takeda/Seattle Genetics 通过对原有技术的改进，利用自己的 新型抗体偶联技术开发了brentuximabvedotin （SGN-35商品名Adcetris ，） 新型抗体偶联药物，并与2011年被FDA批准用于治疗霍奇金淋巴瘤和系统性间变性大细胞淋巴瘤。2013年抗体偶联药物再次取得突破，Ge nen tech/Immu noGen 联合开发的Ado-trastuzumabemtansine （T-DM1,商品名Kadcyla ）被FDA批准用于HER2阳性乳腺癌，这是首个针对实体瘤的抗体偶联药物。随着这两个药物的研发成功，ADC药物再次以火热的状态进入人们的研究视野。 1、进入临床阶段ADC药物 截至目前大概有30多种ADC药物进入临床开发阶段（表1），统计表中30 种药物针对适应症发现，其中仅有4种药物针对实体瘤。主要原因：抗体难于透过毛细管内皮层和穿过肿瘤细胞外间隙到达实体瘤的深部。而使用抗体片段，如Fab,制备分子量较小的偶联物，可能提高对细胞外间隙的穿透性，增加到达深部肿瘤细胞的药物量。因此“抗体的小型化或适度的小型化将会是研制ADC药物 的重要途径”。同时我们还能看到ImmunoGe、Seattle Genetics 在现有ADC 药物研发中占有绝对的统治地位，这得力于他们成熟的抗体偶联技术一一利用天然抗体自身的赖氨酸和半胱氨酸中的巯基偶联药物（non-specific ）。 2、如何才能成功开发出一种ADC药物？

创新医药抗体偶联药物发展分析

广州创亚企业管理顾问有限公司 创新医药抗体偶联药物发展分析

已获FDA批准上市的ADC药物（截至2019.11）抗体偶联药物（Antibody–Drug Conjugates，ADCs）已经成为当前全球抗体药 物研发的热门方向。截至2019.11，FDA共批准 了6款ADC药物上市，包括Seattle的Adcetris、 Genentech的Kadcyla和Polivy、Wyeth的 Besponsa和Mylotarg，其中的代表产品——抗 CD30的Adcetris在2018年实现销售收入4.77 亿美元（+55%），抗HER2的Kadcyla则实现销 售收入9.79亿瑞士法郎（+8%）。 该类药物的优点是能够将抗体的高特异性 与细胞毒药物的高杀伤力相结合，对部分肿瘤 展现出优秀的疗效，具有独特的临床价值。

ADC类药物结构示意图抗体偶联药物的设计思路是将抗体 与细胞毒药物进行偶联，从而同时发挥 抗体高特异性与细胞毒小分子的高毒性， 利用抗体-抗原的高度靶向结合将药物 输送至肿瘤部位，将细胞毒药物强大的 细胞杀伤能力集中于肿瘤细胞，降低正 常组织的毒副作用。

ADC药物作用机制 上世纪60年代便已经有了在动物模型中试 验ADC的尝试，80年代推进了临床，首个获批的 ADC是由Wyeth研发的Mylotarg（Gemtuzumab Ozogamicin），于2000年被FDA批准上市。但是 该药物在上市后的临床研究中联用化疗未能延 长生存期且增加了毒性，因此2010年由企业主 动撤市。Mylotarg上市后的10余年间未再有新 的ADC获批。

碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)

碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法) 简介： 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase ，简称ALP 或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH 9.2~9.8。碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)是采用偶氮偶联法(又称同时偶联法)，细胞内碱性磷酸酶可使AB-BI 磷酸盐水解，释放出磷酸与萘酚，后者与偶联重氮盐生成有色产物，定位于细胞质中, 碱性磷酸酶活性部位呈红色，位于胞桨。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、 血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片、石蜡切片入ALP 固定液固定，水洗。 2、滴加配制好的ALP 孵育液，放入湿盒中，避光孵育，水洗。 3、Lea 苏木素染色液复染或甲基绿染色液复染。 4、水洗、镜检或甘油明胶封固后镜检。 染色结果： 临床意义： 1、 类白血病反应积分明显增高，未经治疗的慢性粒细胞白血病积分明显减低。 2、 急性细菌性感染积分明显增高，病毒性感染积分多正常或减低。 3、 再生障碍性贫血积分常增高，PNH 、MDS 积分常减低。 编号 名称 DE0004 4×2ml DE0004 4×10ml DE0004 4×20ml Storage 试剂(A): ALP 固定液 2ml 10ml 20ml RT 避光 试剂(B): ALP 孵育液 B1: AS-BI 染色液 1ml 5ml 10ml -20℃ 避光 B2: FBB 染色液 1ml 5ml 10ml -20℃ 避光 临用前，按B1:B2=1:1比例混合，即为ALP 孵育液，即配即用。 试剂(C): Lea 苏木素染色液 2ml 10ml 20ml 4℃ 避光 试剂(D): 甲基绿染色液 2ml 10ml 20ml RT 避光 使用说明书 1份 ALP 活性部位 红色 细胞核 蓝色(苏木素)或绿色(甲基绿)

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介

常用的半抗原与蛋白偶 联方法简介 公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介 （一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。 碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、??取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液） 2、??取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、??取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III 液） 4、??将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下） 5、??室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、??4度搅拌12小时 7、??静置10小时（4度） 8、??有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。 孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、??用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L 的溶液。 2、??加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和 DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、??用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、??按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用，浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。 5、?? （二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、??用 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。 2、??滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。

干货抗体偶联药物(adc)深度研究报告

干货抗体偶联药物（adc）深度研究报告 目录一、行业背景 针对病症 历史沿革基本原理介绍二、核心技术抗体部分（1）靶点选 择（2）抗体选择（3）抗体修饰（4）抗体内吞连接物部分 （1）连接物（Linker）选择（2）连接方式及DAR（3）新技术Abzena的ThioBridge毒素部分核心专利-连接物与毒素排序三、效果对比：Kadcyla对比Herceptin四、核心公司竞 争情况1.领先公司（1）Seattle Genetics （2）ImmunoGen （3）Immunomedics 2.规模较大公司 （1）Abzena （2）Agensys （3）Celldex （4）Progenics Pharmaceuticals （5）Genmab （6）Sorrento旗下Concortis 3.大型药企在ADC领域的布局（1）Abbvie 及其旗下Stemcentrx （2）Roche旗下Genetech的情况（3）武田旗下Takeda Oncology （4）辉瑞ADC 产品Mylotarg （5） 复星、药明、浙江医药与Ambrx （6）三生制药及三生国健（7）丽珠医药集团旗下丽珠单抗 （8）

江苏恒瑞医药（9）四川恒康旗下上海美雅珂生物 （10）其他药企五、行业市场规模六、ADC成功要素分 析独家技术优秀团队研发方向 一、行业背景抗体偶联药物Antibody-drug Conjugate (ADC)是拥有强细胞毒性的化疗药物通过连接物与单抗偶联形成的，兼具小分子药物强大的杀伤力和纯单抗高度的靶向性，因而成为肿瘤靶向治疗的研究和发展热点。但是，ADC 本身并非在各方面强于纯单抗。其疗效的显著提升是通过牺牲药品的均一性与稳定性实现的。现在比较成熟的两种偶联技术分别侧重均一性与稳定性，有一些新式偶联技术能够在两方面同时改善。1、针对病症ADC药物被用于癌症治疗，其针对病症由其中抗体所针对的靶点决定，能够对将该靶点高表达的肿瘤细胞进行针对性DNA破坏或抑制微管。由于 其针对性很高，其可以使用化疗中不能使用或剂量不能提高的高毒性药物［1］。ADC药物相对于化疗药的治疗安全窗口therapeutic window会更大，相对更加安全［2］。下表为可供使用的各种靶点及其针对的癌症种类。其中，目前已经上市的两款药物中，Kadcyla使用HER2靶点，针对HER2阳性的肺癌；Adcetris使用CD30靶点，针对CD30阳性的霍奇金淋巴瘤Hodgkin Lymphoma (HL)与间变性大细胞淋巴瘤anaplastic large cell lymphoma (ALCL) ［3］。靶向药物中不同抗原及其针对癌症种类，以及相应在研的ADC药物数量抗

抗体偶联药物

抗体偶联药物（ADC）的涅槃重生 抗体偶联药物（antibody-drug conjugate, ADC）是将抗体与细胞毒性药物连接起来，通过抗体的靶向作用将细胞毒药物靶向肿瘤，进而降低化疗中常见的药物非特异性的全身毒性。抗体偶联药物（antibody-drug conjugate, ADC）的研究可以追溯到1980s，，但是直到2000年，首个抗体偶联药物gemtuzumab o zogamicin（商品名Mylotarg，Pfizer研发）才被FDA批准用于治疗急性粒细胞白血病，但由于偶联技术、靶向性、有效性等受限，完整的抗体偶联药物在血液不稳定，导致致死性毒性的产生，于2010年撤市。这使得本就不明朗的ADC药物研究，更蒙上了一层阴影。 但是随着Takeda/Seattle Genetics 通过对原有技术的改进，利用自己的新型抗体偶联技术开发了brentuximab vedotin（SGN-35，商品名Adcetris，）新型抗体偶联药物，并与2011年被FDA批准用于治疗霍奇金淋巴瘤和系统性间变性大细胞淋巴瘤。2013年抗体偶联药物再次取得突破，Genentech/ImmunoGen 联合开发的Ado-trastuzumab emtansine（T-DM1，商品名Kadcyla）被FDA批准用于HER2阳性乳腺癌，这是首个针对实体瘤的抗体偶联药物。随着这两个药物的研发成功，ADC药物再次以火热的状态进入人们的研究视野。 1、进入临床阶段ADC药物 截至目前大概有30多种ADC药物进入临床开发阶段（表1），统计表中30种药物针对适应症发现，其中仅有4种药物针对实体瘤。主要原因：抗体难于透过毛细管内皮层和穿过肿瘤细胞外间隙到达实体瘤的深部。而使用抗体片段，如Fab，制备分子量较小的偶联物，可能提高对细胞外间隙的穿透性，增加到达深部肿瘤细胞的药物量。因此“抗体的小型化或适度的小型化将会是研制ADC药物的重要途径”。同时我们还能看到ImmunoGen、Seattle Genetics在现有ADC 药物研发中占有绝对的统治地位，这得力于他们成熟的抗体偶联技术——利用天然抗体自身的赖氨酸和半胱氨酸中的巯基偶联药物（non-specific）。 2、如何才能成功开发出一种ADC药物？

碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)使用说明

碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)使用说明 自备材料： 1、载玻片、湿盒 2、普通光学显微镜 产品简介： 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，简称ALP或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH9.2~9.8。此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌之细胞膜。

碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)不是采用金属沉淀法来显示碱性磷酸酶活性，而是采用偶氮偶联法(又称同时偶联法)，其原理是在pH9.2～9.8的碱性条件下，细胞内碱性磷酸酶可使AB-BI磷酸盐水解，释放出磷酸不萘酚，后者不偶联重氮盐生成有色产物，定位于细胞质中。该染液可用于血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片、梯度入水后的石蜡切片等的碱性磷酸酶染色，碱性磷酸酶活性部位呈蓝色，位于胞桨，结果较金属盐沉淀法可靠。 操作步骤(仅供参考)： 一、涂片或切片 1、血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片、石蜡切片入ALP固定液固定3min(梯度入水后的 石蜡切片无需固定)，水洗。 2、滴加配制好的ALP孵育液，放入湿盒中，避光孵育15～20min，水洗。 3、入核固红染色液或甲基绿染色液复染3～5min。 4、水洗、镜检或甘油明胶封固后镜检。 二、贴壁培养细胞 1、取6孔板或其他容器培养的细胞，弃液，PBS清洗干净。 2、加入ALP固定液固定3min或4%多聚甲醛固定10～15min，PBS清洗。 3、滴加配制好的ALP孵育液，放入湿盒中，避光孵育15～20min，PBS清洗。 4、入核固红染色液或甲基绿染色液复染3～5min。 5、PBS清洗、镜检。

干货抗体偶联药物(adc)深度研究报告

干货抗体偶联药物（adc)深度研究报告 目录一、行业背景 针对病症 历史沿革基本原理介绍二、核心技术抗体部分（1）靶点选择（2）抗体选择（3）抗体修饰（4）抗体内吞连接物部分（1）连接物（Linker）选择（2）连接方式及DAR（3）新技术Abzena的ThioBridge毒素部分核心专利-连接物与毒素排序三、效果对比：Kadcyla对比Herceptin四、核心公司竞争情况 1. 领先公司（1）Seattle Genetics （2）ImmunoGen （3）Immunomedics 2. 规模较大公司 （1）Abzena （2）Agensys （3）Celldex （4）Progenics Pharmaceuticals （5）Genmab （6）Sorrento旗下Concortis 3. 大型药企在ADC领域的布局（1）Abbvie及其旗下Stemcentrx （2）Roche旗下Genetech的情况（3）武田旗下Takeda Oncology （4）辉瑞ADC产品Mylotarg （5）复星、药明、浙江医药与Ambrx （6）三生制药及三生国健（7）丽珠医药集团旗下丽珠单抗（8）江苏恒瑞医药（9）四川恒康旗下上海美雅珂生物（10）其他药企五、行业市场规模六、ADC成功要素分析独家技术优秀团队研发方向

一、行业背景抗体偶联药物Antibody-drug Conjugate (ADC) 是拥有强细胞毒性的化疗药物通过连接物与单抗偶联形成的，兼具小分子药物强大的杀伤力和纯单抗高度的靶向性，因而成为肿瘤靶向治疗的研究和发展热点。但是，ADC 本身并非在各方面强于纯单抗。其疗效的显著提升是通过牺牲药品的均一性与稳定性实现的。现在比较成熟的两种偶联技术分别侧重均一性与稳定性，有一些新式偶联技术能够在两方面同时改善。1、针对病症ADC药物被用于癌症治疗，其针对病症由其中抗体所针对的靶点决定，能够对将该靶点高表达的肿瘤细胞进行针对性DNA破坏或抑制微管。由于其针对性很高，其可以使用化疗中不能使用或剂量不能提高的高毒性药物[1]。ADC药物相对于化疗药的治疗安全窗口therapeutic window会更大，相对更加安全[2]。下表为可供使用的各种靶点及其针对的癌症种类。其中，目前已经上市的两款药物中，Kadcyla使用HER2靶点，针对HER2阳性的肺癌；Adcetris使用CD30靶点，针对CD30阳性的霍奇金淋巴瘤Hodgkin Lymphoma (HL)与间变性大细胞淋巴瘤anaplastic large cell lymphoma (ALCL) [3]。靶向药物中不同抗原及其针对癌症种类，以及相应在研的ADC药物数量抗原对应在研ADC数量主要针对适应症在肿瘤细胞表面表达的靶向抗原GPNMB1乳腺癌及黑素瘤CD561小细胞肺癌（SCLC）TACSTD2

医院检验中心中性粒细胞碱性磷酸酶染色偶氮偶联法

医院检验中心中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP) 染色偶氮偶联法[ 原理] 中性粒细胞胞浆中的碱性磷酸酶在碱性环境中，能水解磷酸萘酚钠，释放的萘酚与重氮盐作用生成不溶性有色的偶氮染料，定位于胞浆中。 [ 试剂] (1)固定剂，为40 %甲醛25m1,加无水乙醇至100m1。 (2)丙二醇缓冲液。①贮备液(0 . 2mol/L 2—氨基-2-甲基 -1 ，3- 丙二醇液) 为2- 氨基-2- 甲基-1 ，3- 丙二醇10 ．5g，蒸馏水加至500ml。②应用液(0.05mol/L pH9.75)，为0．2mol/L 贮备液25m1，o.1mol/L 盐酸5m1 ，蒸馏水加 至100m1。 (3)基质孵育液pH9.5-9 . 6(用前临时配制)，a—磷酸萘 酚钠20mg溶于0.05mol/L丙二醇缓冲液20m1,再加坚 牢蓝RR(或坚牢紫酱)20mg，混合后用滤纸过滤，立即应用

(4)10g/l 亮绿 [ 操作] (1)新鲜血片或骨髓片用4- 10C的固定剂固定30秒 (2)在涂片上滴加新配过滤的孵育液，在室温下作用 10-15 分钟。 (3)水洗，10g/L 亮绿复染 2 分钟。 (4)水洗，晾干镜检。 [ 结果观察] (-) ：阴性反应。 (+) ：胞浆中含少量紫黑色，无紫黑色颗粒或红色物质。 (++) ：胞浆中含有中等量紫黑色颗粒或呈弥漫红色。 (+++) ：胞浆中有丰富的紫黑色颗粒或弥漫较深红色。 (++++) ：有极丰富的大紫黑色颗粒或弥漫深红色。 [ 参考值] 中性粒细胞碱性磷酸酶活性积分值为10—50 分。

[ 临床意义] 基本同改良Gomo;氏钙钻法。 [ 附注] (1)若涂片不能及时测定，可固定干燥后放冰箱4C保存。 (2)在甘油磷酸钠和巴比妥钠应临用前称取，分别为0．38 和 0. 28,再加蒸馏水20m1即配成。配制后的B -甘油磷酸钠 不宜久放。 (3)涂片从孵育液拿出可不用水洗，直接加硝酸钻，但与硝酸 钴作用后，应反复水洗，以免残留的硝酸钻与硫化胺作用后使整个涂片变黑，造成假阳性。 (4)每次染色时，应同时做 1 份感染思者的血片为阳性对照， 以增加结果的可靠性。对照片可 1 次涂几十片，固定干燥 后，放冰箱可保存几个月。 (5)硫化胺试剂本身黄色很谈，若变深黄色，应及时更换。 试剂放置时间越长黄色越深。这说明硫大量析出，硫 离子浓度大大减少。易引起假阴性。这是试验成功与