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PCR和定量PCR的引物和探针设计

引物和探针设计 –

PCR 和定量PCR

基本原理

引物设计的重要因素

针对特殊应用的其他提示

引物的质量和纯度目录

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基本原理

引物是短的寡核苷酸，充当DNA复制的起始点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3'-羟基作为DNA合成的起始点。这个3'-羟基由相配的引物提供。引物在体内由RNA聚合酶（称为引物酶）生成。这些引物（在此为小RNA）由DNA聚合酶用作延长的起始点。在延长过程中，RNA引物降解并由DNA取代。

体外扩增反应，如聚合酶链反应（PCR）或逆转录（RT），需要引物。通过选择特异的引物序列，DNA 片段的所需区域可得到扩增。

对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。

在开始引物设计之前，必须弄清以下几点：

PCR的目的（例如定量检测、克隆、基因分型）

PCR类型（定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)

样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）

可能的问题（例如假基因、SNP)

引物设计的重要因素

有一些不同的软件工具可用于引物设计和序列分析。它们能简化相配引物对的搜索，一般考虑以下标准。最流行的软件为Primer 3(https://www.wendangku.net/doc/4a3714429.html,)，它是大多数基于网络引物设计应用的基础。典型的引物长度为18-30个碱基。短的引物（15个核苷酸以下）能非常高效地结合---但是它们的专一性不够。非常长的引物能提高专一性，但是退火效率低，从而导致PCR 产物量低下。应避免编码单一序列和重复序列的引物。

引物长度和专一性

引物的GC 含量应介于40%和60%之间。应避免聚-（dC ）-或聚（dG ）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。聚-（dA ）-和聚（dT ）-也应避免，因为这会生成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。

平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域

退火温度是基于引物的解链温度（Tm ）计算。最常用的解链温度计算公式显示如下。“2+4”法则，亦称华莱士法则，对于极短的寡核苷酸（最多14个碱基）有效，该法则提出每个AT 对能将双链DNA 的解链温度提高2°C ，每个GC 对则能提高4°C 。

GC 法则（适用于长于13个碱基的序列）也是一种简单但同时相当不准确的方法。

两种法则都假设退火发生于以下标准条件下：

50 nM 引物、50 mM Na + 和pH 7.0。

“盐调整”法稍微准确一些，考虑到了反应缓冲液中的Na+离子浓度。

最复杂的方法称为“碱基堆积”法。这里的计算中包括了杂交期间的焓（H ）和熵（S ）。

计算出的解链温度可用于估算最佳退火温度。但是，经常需要经验性地估算最佳温度。

所选引物的解链温度应允许退火温度介于55°C 和65°C 之间。一个引物对的两条引物都应具有相同或极相近的解链温度。

退火温度

Tm = 2 °C ? (A + T) + 4 °C ? (G + C)

Tm = 64.9 °C + 41 °C ? (G + C -16.4)(A + T + G + C)

Tm = 100.5 °C + 41 °C ? ? 16.6 ? log 10([Na +

])

C + G A + C + G + T 820A + C + G + T 提示

3引物设计应避免一条引物内的互补性超过3个碱基。如果不遵循这个法则，那么可能出现使引物不能与其目标序列结合的二级结构。引物之间的同源性也应避免，尤其在作为扩增起始点和关键区域的3'端。同源性将导致强引物二聚体形成，后者将与所需要的PCR 反应竞争资源，导致PCR 效率降低，在极端情况下，甚至导致完全无特异性PCR 产物生成（图1）。

避免互补的引物序列

应小心避免在退火步骤期间将PCR 引物的3'端错配。3'端为G-或C-核苷酸较好，因为能增加结合强度。同时它将提高PCR 效率，因为引物-模板符合物的开放将达到最小。但是，超过3个G/C 碱基将会具有负面效果，因为会降低反应的专一性。

3’-序列

A B

5’ ACGGATACCA TGCC T A T G 3’

5’ ACTTGCATGTCTA GTCAC 3’

3’ CAGTG AGTTACATGACTG 5’5’ ACGGATAC CA TGCCTA TG 3’

图 1 因一条引物内（A ）和两条引物之间（B ）的互补性而形成引物二聚体。

4在两步法RT-PCR 应用中，mRNA 必须转录为cDNA 。在这种情况下，采用不依赖序列的引物，例如寡（dT ）引物或随机六聚体。在采用寡（dT ）引物时，推荐选择3'端引物用于以后的PCR 反应。原因是许多逆转录酶不能高效地将全长mRNA 序列转录到5'端。

图 2 RNA 特异分析是可靠的基因表达定量分析的基础。

PCR product no PCR product

upstream primer downstream primer

Genomic DNA mRNA RT-PCR Product

提示

锚定的寡（dT）n引物与聚（A）尾部的起点杂交，这样能确保mRNA编码部分的靶向转录。这

是生成全长cDNA的大多数两步RT-PCR应用中较受欢迎的引物延伸法。

提示

如果目标序列位于基因的5'端，那么推荐采用随机六聚体引物或随机六聚体与寡（dT）n引物的混

合物用于逆转录步骤。一般采用60μM随机六聚体和2.5μM寡（dT）n。

实时PCR

为了达到高效反应，应将实时PCR应用的引物设计为能生成短的扩增子。用结合DNA双链的荧光染料（如SYBR Green I）分析时的扩增子长度应短于300 bp，探针分析时的扩增子长度应短于150 bp。

提示

为了获得最大便利，请将您的分析设计为全部在相同的PCR条件下运行。为了达到这一目

的，可将引物设计为具有极相近的解链温度，以便能选择相同的退火温度。如果分析是用免

费的ProbeFinder软件设计，那么最佳退火温度都是60°C。

对于TaqMan?分析的设计，应遵循以下推荐：

扩增子长度应小于150 bp。

荧光标记染料不应结合到G-残基，这样可以避免探针的5'端上出现G-残基。

选择能为探针提供C'多于G'的链。

最大TaqMan 探针长度为30个碱基，以获得最佳退火效果。

探针的Tm应介于68-70°C之间。

探针应经HPLC纯化，母液（通常为2-4μM）应在-20°C下等分和保存。应避免反复冻融（写成冷

冻、融化）循环。（又参见“引物的质量和纯度”）

设计引物应在设计完探针后进行。

引物设计应尽可能接近探针而又不与探针重叠。良好的距离应为距探针3个核苷酸。

引物的Tm应比探针低8-10°C，通常应为至少60°C。

TIP

围绕探针设计多个引物。这将使您能经验性地确定并选择最好的引物探针组合。

对于相关生物序列的扩增，例如研究微生物生态学时的普通情况，使用简并引物可能会有帮助。简并引物是相似寡核苷酸的混合物，具有相同序列—除了所选的（简并）位置以外—并使得相似的序列被共同扩增。简并引物也能用于引物设计必须基于蛋白质序列时。

简并引物

锁核酸（LNA ）是核苷酸类似物，其中核糖环由亚甲基桥封闭。 LNA-核苷酸与其互补碱基配对。其优势在于LNA-核苷酸增加寡核苷酸的解链温度，每个LNA 单体可增加2-8°C ，从而比标准寡核苷酸提高了专一性。这个优势可用于一系列不同的应用，尤其是在微小RNA 的定量分析中或在Universal ProbeLibrary 通用型探针的使用中。

LNA 引物

O O O O O O P B LNA 8-mer

5’-TGC T GGTC-3’3’-ACG A CCAC-5’3’-ACG G CCAC-5’T m

Perfect Match Single

Mismatch

O O O O

O P B

DNA 8-mer

5’-TGC T GGTC-3’71 °C 35 °C 45 °C 25 °C 26 °C

10 °C

引物的质量和纯度

茎环引物

茎环引物主要用于逆转录期间，以便后面进行微小RNA的量化分析。茎环引物结合到微小RNA的3'端，这样它可由逆转录酶进行转录。然后借助于微小RNA特异性正向引物、逆向引物和水解探针（TaqMan 探针），可以对RT产物进行定量分析（Chen等人,2005）。

引物的质量和纯度

如果可能的话，应只采用高度纯化的引物（例如HPLC纯化）。在非纯化引物样品中，总会存在较短的片段，这是引物合成期间生成的副产物。这些副产物将促进引物二聚体的形成，并将降低PCR反应的敏感性和产量。

提示

尽管引物设计很小心，但是为了防止出现引物二聚体及其他非特异性PCR产物，PCR反应中应始

终采用HPLC纯化引物，以及具有热启动功能的聚合酶。

FastStart Taq聚合酶，dNTPack和FastStart高保真PCR系统，dNTPack以及所有FastStart

Universal SYBR Green、LightCycle 480/2.0系列的SYBR Green Master Mix或Probes Master

Mix都含有经过化学修饰的酶，这些酶在75°C以下将失活。在PCR开始时，95°C下短时

间孵浴足以激活这些酶。因为逆转录酶不具有内源性热启动功能，Transcriptor一步式

RT-PCR试剂盒包含特殊的热启动补充剂，能减少逆转录以及随后PCR期间的引物二

聚体，从而提高专一性。

引物通常以冻干制剂提供。它们可以保存在2-8°C的冰箱中。引物母液应在-20°C下等分和保存。应避免反复的冷冻、融化循环。

提示

为了生成浓缩母液（例如100μM），应采用以不含核酸酶的水配制的、适合于PCR的低浓度无菌

Tris缓冲液（5-10μM，pH 7-8）。纯水的缺点是没有缓冲能力。这样， pH值将经常处于4-5的

范围内。引物在这个pH值下不稳定。应避免TE缓冲液，因为它含有会结合Mg2+离子的EDTA，

而Mg2+离子是PCR反应中的主要成分。

PCR Applications Manual, 3rd edition (2006), Roche Applied https://www.wendangku.net/doc/4a3714429.html,b FAQS: Find a quick solution, 3rd edition (2007), Roche Applied Science.Technical Tip: Real-Time PCR – The Essentials, Roche Applied Science.Technical Tip: Relative Quantification in Perfection, Roche Applied Science.Chen C, et al. (2005) Nucleic Acids Res. 2005; 33(20): e179.SantaLucia, J. (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95, 1460.

Allawi, H.T. and SantaLucia, J. Jr. (1997) Biochemistry 36, 10581.Published by

? 2010 Roche Diagnostics Limited

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引物探针设计简介

引物探针设计简介已有2993 次阅读2009-1-1 20:48|个人分类:课堂集锦|系统分类:科研笔记 1．寡聚核苷酸引物的选择，通常是整个扩增反应成功的关键。所选的引物序列将决定PCR 产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值这个和扩增物产量有关的重要物理参数。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。计算机辅助引物设计比人工设计或随机选取更有效。一些影响PCR反应中引物作用的因素诸如溶解温度、引物间可能的同源性等，易于在计算机软件中被编码和限定。计算机的高速度可完成对引物位置、长度以及适应用户特殊条件的其他有关引物的变换可能性的大量计算。通过对成千种组合的检测，调整各项参数，可提出适合用户特殊实验的引物。因此通过计算机软件选择的引物的总体“质量”（由用户在程序参数中设定）保证优于通过人工导出的引物。需要指出的是，引物不必与模板完全同源，因此可包含启动子序列、限制酶识别位点或5'端的各种修饰，这种对引物的修饰不会妨碍PCR反应，而会在以后使用扩增子时发挥作用。 2．基本PCR引物设计参数引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率。特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。①引物长度；特异性一般通过引物长度和退火温度控制。如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物设计时使合成的寡核苷酸链（18～24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举。②引物的二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的3'末端形成的二聚体，应控制其ΔG大于

real time PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价

real time PCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价一、实时荧光Taqman 探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时；2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探针。另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。二、探针的设计探针设计的基本原则： 1．保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。 2．探针长度

Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm 值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其的Tm值较高。现在有Taqman MGB探针，在TAMER之后再标记一个MGB，可使探针的Tm值较高,即使探针片段较短，也可达到Taqman探针的Tm值要求(68-70℃)。 3．探针的名称应标记探针在基因组的位置及长度。 4．探针Tm值计算用oligo或primer preiemer软件即可计算Tm值。确保探针中GC含量在30-80%。应避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。 5．探针的评价用DNAstar软件中的Primerselect软件，点击“log”菜单中的“create primer catalog”，在“name” 中输入探针的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的探针序列。选中整个序列后，在“report”菜单下“primer self dimer”,分析探针的二聚体。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个dime r，并对此探针用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。在“report”菜单下“p rimer hairpins”,分析探针的发夹结构。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个hairpins，并对此探针的h airpins进行评价。多重荧光PCR时，要对多条探针进行“pair dimer”进行分析。 6．探针的5’端不能为G 因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。 7．Taqman探针与引物之间的位置

Oligo引物设计软件使用方法

作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要功能：如：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列，根据不同的实验情况，导入模板有三种方法： 1，直接用键盘输入： a，点击file菜单中的New Sequence 浮动命令，或直接点击工具栏中的New Sequence 命令，进入序列展示窗口； b，此时即可键入DNA序列； c，如果需要的话，Oligo提供碱基回放功能，在边键入时边读出碱基，防止输入错误。点击Edit菜单中的“Readback on”即可。 2，利用复制和粘贴：当我们序列已经作为TXT文件存在或其它oligo不能直接open的文件格式，如word文件.html格式，这个功能就显得很有用了。在相应文件中复制序列后在序列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。当序列输入或粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即可进入引物设计模式。 3，如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA，GenBank格式时，oligo就可以直接打开序列文件。点击File菜单中的“Open”浮动命令，找到所需文件，打开即可。进入引物设计模式后，oligo一般会弹出三个窗口，分别是6－碱基频率窗口，碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口，其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用，比如6－碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA时，

甲基化引物探针设计方法

本文叙述了一种用于甲基化分析的探针法定量PCR的引物和探针设计方法，目前用于甲基化检测的引物探针设计工具非常多，都有使用成功的案例，经过初步多方尝试，本文中叙述的为本人认为较为靠谱的方法。Oligo7的优势在于专业，参数详尽且可自由设置，模块化设计，学会后使用便利。专业的活就是要专业的用专业的工具干。

首先是进行序列转换，有较多的在线工具和联机软件都可实现，这里使用https://www.wendangku.net/doc/4a3714429.html,/methprimer/，较为简单直观。

直接将目标序列放入如上图的编辑框中，此也可直接用于相关引物的设计，不过本人没使用过，因为不能设计探针。submit后就有转化后的序列信息，如下图：以上详细标记了CpG位置和非CpG位置的C，可直接复制到Word标注使用，下面就可以使用Oligo7利用上边的序列设计引物和探针了，如果是设计非甲基化引物探针，则使用原始序列。

关于引物和探针的一些主要参数，主要参考invtrogen的建议： Primer设计的基本原则： a)引物长度一般在18-35mer。 b)G-C含量控制在40-60%左右。 c)避免近3’端有酶切位点或发夹结构。 d)如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。 e)如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。 f)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 g)退火温度Tm控制在58-60C左右。 h)如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。 T aqMan 探针设计的基本原则： a)T aqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。 b)长度一般为18-40mer 。 c)G-C含量控制在40-80%左右。 d)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 e)在引物的5’端避免使用G。 f)选用比较多的碱基C。 g)退火温度Tm控制在68-70℃左右。另：目标变异碱基最好在3’末端或3’末端-1位置，保证扩增特异性，对于甲基化，则最好是C。

PCR技术和引物设计

引物和探针设计 – PCR 和定量PCR 基本原理引物设计的重要因素针对特殊应用的其他提示引物的质量和纯度目录 1247

基本原理引物是短的寡核苷酸，充当DNA复制的起始点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3'-羟基作为DNA合成的起始点。这个3'-羟基由相配的引物提供。引物在体内由RNA聚合酶（称为引物酶）生成。这些引物（在此为小RNA）由DNA聚合酶用作延长的起始点。在延长过程中，RNA引物降解并由DNA取代。体外扩增反应，如聚合酶链反应（PCR）或逆转录（RT），需要引物。通过选择特异的引物序列，DNA 片段的所需区域可得到扩增。对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。在开始引物设计之前，必须弄清以下几点： PCR的目的（例如定量检测、克隆、基因分型） PCR类型（定量PCR、RT-PCR、长片段PCR) 样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）可能的问题（例如假基因、SNP) 1

引物设计的重要因素 2 有一些不同的软件工具可用于引物设计和序列分析。它们能简化相配引物对的搜索，一般考虑以下标准。最流行的软件为Primer 3(https://www.wendangku.net/doc/4a3714429.html,)，它是大多数基于网络引物设计应用的基础。典型的引物长度为18-30个碱基。短的引物（15个核苷酸以下）能非常高效地结合---但是它们的专一性不够。非常长的引物能提高专一性，但是退火效率低，从而导致PCR 产物量低下。应避免编码单一序列和重复序列的引物。引物长度和专一性引物的GC 含量应介于40%和60%之间。应避免聚-（dC ）-或聚（dG ）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。聚-（dA ）-和聚（dT ）-也应避免，因为这会生成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域退火温度是基于引物的解链温度（Tm ）计算。最常用的解链温度计算公式显示如下。“2+4”法则，亦称华莱士法则，对于极短的寡核苷酸（最多14个碱基）有效，该法则提出每个AT 对能将双链DNA 的解链温度提高2°C ，每个GC 对则能提高4°C 。 GC 法则（适用于长于13个碱基的序列）也是一种简单但同时相当不准确的方法。两种法则都假设退火发生于以下标准条件下： 50 nM 引物、50 mM Na + 和pH 7.0。 “盐调整”法稍微准确一些，考虑到了反应缓冲液中的Na+离子浓度。最复杂的方法称为“碱基堆积”法。这里的计算中包括了杂交期间的焓（H ）和熵（S ）。计算出的解链温度可用于估算最佳退火温度。但是，经常需要经验性地估算最佳温度。所选引物的解链温度应允许退火温度介于55°C 和65°C 之间。一个引物对的两条引物都应具有相同或极相近的解链温度。退火温度 Tm = 2 °C ? (A + T) + 4 °C ? (G + C) Tm = 64.9 °C + 41 °C ? (G + C -16.4)(A + T + G + C) Tm = 100.5 °C + 41 °C ? ? 16.6 ? log 10([Na + ]) C + G A + C + G + T 820A + C + G + T 提示

探针的设计原则

实时荧光Taqman 探针设计的几个要点实验室很多同学都要做Real time PCR实验，实验室的师兄师姐都会有很多宝贵意见，不过也有实验室前没有做过的，查找了下资料和大家分享下关于实时荧光Taqman探针设计、实时荧光PCR探针的选择、引物的设计及评价。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标Molecular Beacon。广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。 (请注意，该图显示的不是普通的Taqman探针法，而是Taqman MGB探针法)Taqman探针检测的是积累荧光。常用的荧光基团有FAM，TET，VIC，HEX等等。当探针完整的时候，由于3′端的荧光淬灭基团在吸收5′端报告基团所发射的荧光能量，本身会发射波长不同的荧光而导致本底高，因此TaqMan探针近来又有新的发展——TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高——因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T 的模板可以区分得更为理想。 Taqman探针法已经得到广泛使用，不过有人认为这种技术利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度(Tm)仅要求其高于60°C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，难于做质控检测。 Real time PCR Taqman探针设计、实时多重PCR探针的选择和引物的设计及评价一、实时荧光Taqman探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。

U6_5S_miRNA 引物探针设计

内参 1.RNU6 Homo sapiens RNA, U6 small nuclear 1 (RNU6-1), small nuclear RNA NR_004394.1 ORIGIN 1 gtgctcgcttcggcagcacatatactaaaattggaacgatacagagaagattagcatggc 61 ccctgcgcaaggatgacacgcaaattcgtgaagcgttccatatttt RNU6-F CTCGCTTCGGCAGCACA RNU6-R AACGCTTCACGAATTTGCGT 2.5S Homo sapiens RNA, 5S ribosomal 2 (RNA5S2), ribosomal RNA NR_023364.1 ORIGIN 1 gtctacggccataccaccctgaacgcgcccgatctcgtctgatctcggaagctaagcagg 61 gtcgggcctggttagtacttggatgggagaccgcctgggaataccgggtgctgtaggctt 121 t 5S-F TCTCGTCTGATCTCGGAAGCTA 5S-R GCGGTCTCCCATCCAAGTA

MiRNA 方案1 Universal Reverse primer TGGTGTCGTGGAGTCG 方案2 Universal Reverse primer GTGCAGGGTCCGAGG

1.hsa-miR-122 序列：uggagugugacaaugguguuug 长度：22 2.Hsa-miR-16 序列：uagcagcacguaaauauuggcg 长度：22 3.hsa-mir-93 序列：caaagugcuguucgugcagguag 长度：23

实时定量PCR引物和探针设计操作步骤Primer Express软件

实时定量PCR引物和探针设计操作步骤Primer Express软件 Primer Express 是实时定量PCR引物和探针设计的专用软件。遵守以下三个原则有助于快速建立定量PCR反应体系： 1.所有扩增按照同样的原则设计 (Primer Express)； 2.所有PCR反应在ABI PRISM ?7000/7900上使用同样的热循环条件； 3.所有反应使用相同的PCR试剂。引物和探针的设计原则下述原则的重要程度由上往下越来越低，请尽量满足编号靠前的条件。它们中有的已经在Primer Expre软件中设置成缺省值，有的则需要在选择引物和探针时由设计者加以运用。如果是设计SYBRGreen 引物，也要选择TaqMan Primer and Probe design并遵守这些规则，但是只需要合成引物就可以了。 TaqMan 探针： 1. 保持G-C含量在30-80%之间。 2. 避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上。 3. 5' end不能是G。 4. 尽量使探针中的Cs多于Gs。如果不能满足，则使用互补链上的探针。 5. 对于单探针反应，用Primer Express?软件计算出来的Tm值应当在68-70 °C 之间。引物：1. 在探针确定以后再选择引物。 2. 引物要尽可能地接近探针，但是不要重叠。 3. 保持G-C含量在30-80%之间。 4. 避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上。 5. 用Primer Express?软件计算出来的Tm值应当在58-60 °C之间。 6. 3' end 的5个碱基中G and/or C碱基的总数不能超过2个。实时TaqMan 引物和探针设计 Begin by opening Primer Express and selecting "File", "New", and "TaqMan? Primer & Probe Design". The following screen will appear. You can close the TaqMan? Primer & Probe Data box as shown.

realtimePCRTaqman探针设计、实时多重PCR探针的选择、引物的设计及评价

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定量PCR引物探针设计原则完整版

定量P C R引物探针设计原则 Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】

定量PCR引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR 要求。当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBIgenbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。引物设计原则序列选取应在基因的保守区段避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构? 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60% 引物之间的TM相差避免超过2℃ 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。 Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp? 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

引物设计个人心得

Primer 5.0搜索引物： 1.Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。 2.PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 3.Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。 4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。 Oligo 6.0评估引物： 1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer overall 6.7kcal/mol没有问题。 2.Hairpin Formation根据黄金法则 3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。 4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 5.Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。PCR引物设计的11条黄金法则 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物

]Oligo设计教程

Oligo 设计教程在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo 程序导入模板序列，根据不同的实验情况，导入模板有三种方法：1，直接用键盘输入： a，点击file菜单中的New Sequence 浮动命令，或直接点击工具栏中的New Sequence命令，进入序列展示窗口； b，此时即可键入DNA序列； c，如果需要的话，Oligo提供碱基回放功能，在边键入时边读出碱基，防止输入错误。点击Edit菜单中的“Readback on”即可。 2，利用复制和粘贴：当我们序列已经作为TXT文件存在或其它oligo不能直接open的文件格式，如word文件.html格式，这个功能就显得很有用了。在相应文件中复制序列后在序列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。当序列输入或粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的 Accept浮动命令，即可进入引物设计模式。 3，如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA，GenBank格式时，oligo就可以直接打开序列文件。点击File菜单中的“Open”浮动命令，找到所需文件，打开即可。进入引物设计模式后，oligo一般会弹出三个窗口，分别是6－

碱基频率窗口，碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口，其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用，比如6－碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA时，该信息就显得有用了，而内部稳定性窗口则可以显示引物的5’端稳定性是否稍高于3’端等。一，普通引物对的搜索：以Mouse 4E（cDNA序列）为例。我们的目的是以Mouse 4E（2361 bp）为模板，设计一对引物来扩增出600－800bp长的PCR产物。1，点击“Search“菜单中的”For Primers and Probes“命令，进入引物搜索对话框； 2，由于我们要设计的是一对PCR引物，因此正、负链的复选框都要选上，同时选上Compatible pairs。在Oligo默认的状态下，对此引物对的要求有：a，无二聚体；b，3’端高度特异，GC含量有限定，d，去除错误引发引物等。 3，剩下的工作是确定上、下游引物的位置及PCR产物的长度以及引物设计参数。 ①单击：“search Ranges”按钮，弹出“Search Ranges”对话框。输入上游引物的范围：1－2000，下游引物的位置：100－2300；PCR产物的长度600－800bp。

荧光定量PCR引物设计

荧光定量PCR引物设计专业的定量PCR设计软件：beacon Designer 有时一对100分的引物扩增效率特别低，换了一对貌似很烂的引物，结果溶解曲线却长得很漂亮～扩增效率也蛮高。个人认为这个跟你选择的位置有关看引物Tm值相差是否很高，适当降低反应退火温度，看看是否有效看所扩增片段GC含量以及产物Tm是否很高，比方水稻基cDNA扩增常常用到GC buffer。看所用扩增基因是否为组织特异性表达看RNA是否完整是否降解，反转录过程是否完整设好内参正对照最后，所有这些都满足还是没扩增出来，重新设计引物吧，（1）设计的时候尽量靠近基因的3'端，这样能最大限度地保证扩增效率（2）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染（3）两条引物的Tm值不要相差太大（4）产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp。.如果想同时检测很多对基因的变化，最好设计的时候记录下产物的Tm值，这对你后面的实验设计读板温度很有帮助。保证在产物Tm80以上（一般T m=80以下的峰都是引物二聚体），对于水稻等GC含量比较高的基因组，产物Tm不要高于94(个人观点)。如果同时检测很多对基因的表达量变化，我会尽量调整所有产物的Tm值和内参产物的Tm相差不太大，这样方便实验操作和最后的分析。（3）相对错配来说，我认为dimer和harpin对realtime PCR的影响更大（当然，也别错配得太邪门了，非来一条跟产物出峰在相同位置或者比产物峰还高的错配就死了），引物的3'端不要有错配。（5）一般我们用Primer Premier设计软件，我一般先让软件自动搜索正义链或反义链的引物，找到一条评分是100的，再在它左右合适的位置手动搜索有没有合适和它配对的评分也比较高的引物，一般5分钟之内可以搞定一个基因。实时定量PCR引物设计的具体要求 1、引物使用核酸系列保守区设计并具有特异性。最好位于编码区5'端的 300-400bp区域内，可以用DNAMAN，Alignment软件看看结果。

MGB探针设计原则

总体原则 ?先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。 ?所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。 ?扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。 ?保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。 ?为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G） ?将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。引物设计原则 ?序列选取应在基因的保守区段 ?避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构?典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 ?Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60% ?引物之间的TM相差避免超过2℃ ?引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 ?为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。 ?Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp ?引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。探针设计原则

PCR引物和探针

引物设计原则： 1．上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行PCR 扩增。所以引物的选取也要非常的保守。 2．上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。 3．确保引物中GC含量在30-80%。应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3’端最好不为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。 4．避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。 5．跨外显子设计引物，用于区别或消除基因组DNA的扩增。探针设计的基本原则： 1.保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。 2.Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10℃，这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。 3.确保探针中GC含量在30-80%。 4.避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基 5.探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。 6.Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基。 7.避免探针与引物之间形成二级结构。 8.对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。

实时荧光Taqman 探针设计的几个要点

实验室很多同学都要做Real time PCR实验，实验室的师兄师姐都会有很多宝贵意见，不过也有实验室前没有做过的，查找了下资料和大家分享下关于实时荧光Taqman 探针设计、实时荧光PCR探针的选择、引物的设计及评价。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标Molecular Beacon。广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。 (请注意，该图显示的不是普通的Taqman探针法，而是Taqman MGB探针法)Taqman探针检测的是积累荧光。常用的荧光基团有FAM，TET，VIC，HEX等等。当探针完整的时候，由于3′端的荧光淬灭基团在吸收5′端报告基团所发射的荧光能量，本身会发射波长不同的荧光而导致本底高，因此TaqMan探针近来又有新的发展——TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高——因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T 的模板可以区分得更为理想。 Taqman探针法已经得到广泛使用，不过有人认为这种技术利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5`—3`外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度(Tm)仅要求其高于60°C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，难于做质控检测。 Real time PCR Taqman探针设计、实时多重PCR探针的选择和引物的设计及评价一、实时荧光Taqman 探针设计总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。

定量PCR引物、探针设计原则

精心整理定量PCR引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→ 配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBIgenbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。引物设计原则序列选取应在基因的保守区段避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。 Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60% 引物之间的TM相差避免超过2℃ 引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。 Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp 引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。