小鼠肝癌模型研究进展_李顺
% !$年&月第%&卷第%期
中国实验动物学报
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［基金项目］国家重点基础研究")#发展计划项目(% !%KZ(!" ();上海市科技发展基金实验动物研究项目(!(!& " & );上海市卫生和计划生育委员会科研课题项目(% !(&] )()!
［作者简介］李顺(!"F$E )，男，助理研究员，博士，从事基因修饰动物模型研究，*+,-./:/.:4?AF$0!%$123,$［通讯作者］周晓辉(!")#E )，男，研究员，
博士，*+,-./:843?C.-34?.0:4-64213@9""""""""""##
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$研究进展
小鼠肝癌模型研究进展
李顺!，陈丽香!，彭秀华!，诸蒋鸣%，周晓辉
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(!1上海市公共卫生临床中心，上海% !( F ;%1苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏%!(!%#)&摘要’肝癌至今仍是全球高死亡率癌症之一$动物模型特别是小鼠模型是研究肝癌生物学特性#发病机制#新药筛选和治疗的重要工具$近年来，各种小鼠肝癌模型的发展在一定程度上促进了肝癌的相关研究，但是现有模型都有一定不足$缺乏与人类肝癌高度相似且经济适用的动物模型严重制约着对肝癌的深入研究$随着基因修饰技术的发展，小鼠肝癌模型的构建更加快速#容易和方便$本文拟对用于肝癌研究的各种小鼠模型进行概述，并着重强调基因修饰小鼠肝癌模型的构建，以期为相关癌症基因功能研究#应用基因编辑技术研发肝癌模型提供新思路和方向$
&关键词’肝癌;基因修饰;小鼠模型&中图分类号’L"(+##
&文献标识码’P
&文章编号’! (+&F&)(% !$) %+ %!#+ &
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(!1I4-A94-.S?B/.2_D-/54K/.A.2-/KDA5D@，I4-A94-.% !( F ，K4.A-，%1I2433/3V Z-:.2XD<.2-/-A I2.DA2D:，I33243=[A. D@:.5;，I?843?\.-A9:?%!(!%#，K4.A-) &!862>7J2’W. D@2-A2D@@D,-.A:3AD 3V 54D /D-<.A92-?:D 3V 2-A2D@ &N95O0>:6’W. D@2-A2D@;dDAD5.2-/,3<.V.2-5.3A ;X3?:D ,3 世界范围内， 肝癌在男女性中分别位居第三和第六大死亡率癌症，已经严重威胁到人类健康和生命［!］ $全球每年约有) 新发肝癌患者和近$ 患者死于肝癌［%］$我国是全球肝癌发病率最高和死亡数最多的国家，其肝癌患者约占全球的((i $肝癌患者的(年平均存活率低于!!i ［#］$虽然流行病学研究表明，乙型肝炎病毒(4D6-5.5.:Z .@?:，_Zb )和丙型肝炎病毒(4D6-5.5.:K .@?:， _Kb )感染#黄曲霉素#酒精#亚硝胺类物质等都与 肝癌发病有关［&］ $然而，具体的肝癌发生的分子机制和通路仍尚未清楚，构建更加合适的可用于人类肝癌研究的动物模型有助于解决该问题$小鼠的遗传物质和人非常相似，且构建小鼠模型成本较低#周期较短#基因修饰技术更容易实现，因此小鼠是可用 于人类肝癌研究较好的模型动物［(］$构建可准确模拟人类肝癌症状#又易于获取#经济适用的小鼠模型不仅有助于深入探究肝癌发生和发病的分子机制，还可用于检测和评估新的肝癌治疗方法和手段，开发新的肝癌医学影像技术和相关药物等，进而促进将实验室的肝癌研究成果转化到临床应用上的目标$现将有关小鼠肝癌模型研究进行概述$ H致癌物诱发的小鼠肝癌模型 致癌物诱发的肝癌小鼠模型经常被用于肝癌的研究中$人类致肝癌物可分为两类:遗传毒性和非遗传毒性的致癌物$遗传毒性致癌物是指能够与NJP反应，引发NJP损伤而致癌的化学致癌物;非遗传毒性致癌物则不直接与NJP反应，通过诱导宿主体细胞内某些关键性病损(如控制细胞增殖#细胞凋亡和细胞分化)而导致肿瘤的化学致癌物［$］$遗传毒性致癌物二乙基亚硝胺(N*J)是最常用的肝癌诱发化合物$研究表明，对!%n!(<的Z$K#O!雄性小鼠腹腔注射((+979体重)N*J，平均&&周后，! i的Z$K#O!雄性小鼠患有肝癌［)］$此外，也有利用高剂量N*J(F n" +979体重)腹腔注射&n(周龄小鼠，但该方法无前述方法有效$ N*J诱导的小鼠肝癌模型不仅可用于研究肝癌发生的分子机制，还可用于评估和评价治疗肝癌的化学药物$然而，化学物诱导的小鼠肝癌模型虽然可以建立具体的遗传物质改变与致癌物之间的关系［F］，但是小鼠的性别#年龄#品系和遗传背景对肝癌发生的影响一直是用该方法构建模型的瓶颈$ F肝癌移植性的小鼠肝癌模型 由于肝癌移植小鼠模型适用对抗癌药物临床前评价的研究，因此构建肝癌移植小鼠模型得到了长足的发展$早期的移植模型主要是通过同基因品系小鼠肿瘤的移植$随后，通过移植人的肝癌细胞或组织块到免疫缺陷小鼠中构建肝癌模型［"］$例如:无胸腺和毛发的裸鼠(缺乏Q淋巴细胞和Q#Z细胞功能削弱)［! ］;重度联合免疫缺陷小鼠(:D D@D23,+ B.AD<.,,?A3 Q\%=和\"=感染的小鼠肝癌模型 人类的肝癌F i以上是由于乙肝病毒和(或)丙肝病毒感染所致［!&］$因此，在过去的十几年中，多种乙肝和丙肝病毒性感染的动物模型被建立并研究$由于人的_Zb和_Kb不能诱发鼠的肝细胞发生肝炎，建立这些_Zb和_Kb的动物模型时通常需要嵌入人肝细胞$K4.:-@.等［!(］在!"F(年通过转基因的方法把_Zb的NJP序列整合到小鼠的宿主基因组NJP中，从而构建_Zb感染慢性携带者的转基因小鼠模型$随后，携带由_Zb启动子或肝脏特异性启动子启动的_Zb基因组和单个_Zb基因(如:表达表面膜蛋白，e蛋白(_ZC)，核心蛋白和前核心蛋白)的多转基因小鼠模型被大量建立［!$］$利用同样的方法，表达_Kb多蛋白，单独的核心蛋白或结合包膜蛋白的转基因小鼠模型随后也被建立［!)］$这些模型可以用来研究体内肝脏损伤和细胞的恶性转化，并为病毒基因可以起始和促进肝肿瘤的发生提供了确凿的证据$进一步研究发现，乙肝病毒外膜大蛋白和e蛋白，_Kb的核心蛋白是肝癌发生的核心因子$然而由于已报道的_Zb和 _Kb小鼠模型可以引发自身对_Zb和_Kb的免疫耐受，因此这些模型对肝癌发生的影响的研究是在缺乏免疫应答的情况下进行$此外，这些_Zb和_Kb小鼠模型的肝癌发生相对不可预测性，且受小鼠品系影响较大，这些方面大大阻碍了用_Zb和_Kb感染小鼠作为研究肝癌的模型$ I基因修饰性的小鼠肝癌模型 随着小鼠基因打靶技术和基因编辑工具的发展(如:MOJ(8.A2V.A9D@A?2/D-:D:)［!F］#QPW*J:(5@-A+ :2@.65.3A-25. -53@+/.^D DVVD253@A?2/D-:D:)［!"］和KRHISR7K-:"(2/?:5D@D<@D9?/-@/;.A5D@:6-2D<:43@5 6-/.A<@3,.2@D6D-5:7KRHISR-::32.-5D U结论和展望 理想的肝癌模型应能准确反映癌症生物特性和行为，充分模拟人类肿瘤微环境，且容易操作和获取$虽然目前尚无最理想的小鼠肝癌模型存在，但现有的动物模型在研究人类癌症的发生和发展上仍是非常宝贵的资源和工具$通常，异位移植物和原位移植小鼠肝癌模型可用于检测新的治疗方法，且原位移植小鼠模型非常适用于研究肝癌的转移;而基因修饰肝癌动物模型拥有较高的癌症转移率，在研究肝癌发生的分子机制方面是非常好的模型$随着基因编辑技术的迅速发展，高质量的小鼠肝癌模型将会有利于提高和改善对肝癌的研究和综合治疗方法的研发$现已有通过高压水动力法运送KRHISR7K-:"质粒到成年小鼠肝脏敲除原癌基因和抑癌基因;后面可结合腺病毒或慢病毒包裹KRHISR7K-:"系统在活体小鼠中敲除肝癌相关的原癌和抑癌基因，以期提高活体组织中的编辑效率$在利用KRHISR7K-:"系统构建小鼠肝癌模型中，也 可采用K-:"+O3^H和K-:"N! P系统来编辑小鼠肝癌相关的原癌和抑癌基因，以降低脱靶效应$此外，在构建小鼠肝癌模型研究中小鼠和人之间的差异性在研究过程中也应该被考虑，如小鼠的代谢特征和免疫系统与人有着较大差异，下一步可以探索研究人源化小鼠模型用于肝癌模型的构建$总之，继续研发更适合的小鼠肝癌模型，对于探讨肝癌发生的分子机制#癌症信号通路#新型生物标记物#靶向药物的开发等方面可提供必要工具，以期最终加速将实验室的肝癌研究成果转化到临床应用$ 参考文献 ［!］_D W，Q.-A NP，W.S]，_D ee1X3?:D,3 E%##%%1 ［%］Z-^.@.W，j-9AD@*O1X3?:D,3 ［#］K4DA\d，M4-A9Ij1W. D@2-A2D@D6. % ! ，&%(I?66/#):I% $–%!&1 ［(］X3?_，cDAAD<;M，PA dDA3,D XD<1% !(，):(#1 ［$］R.D:=.>^W，Z@-?D@:c\\，K33ADA XW\，D5-/1* -/?-5.A9,.+ 2@3RJP6@3V./D:@D D-/:<.:2@.,.A-5. D@D:63A:D:V3//3=.A99DA3+ 53C.23@A3A+9DA353C.22-@2.A39DA DC63:?@D.A6@.,-@;,3?:D4D6+ -532;5D:［\］1X?5-9DAD:.:1% !(，# :))!E)F&1 ［)］bD::D/.A3 .524IN，c3^-X，X.4-./3 .24J，D5-/1K-@2.A39DA.2+ .5;3V<.D54;/A.5@3:-,.AD.A AD=B3@A，.AV-A5，-A<- ［\］1\K-A2D@RD:K/.A YA23/1!"F&，! F:$ E$(1 ［F］_.@:5dW，Z-/,-.A P1O3@5;;D-@:3V2-A2D@,3 ［"］Q@3.-A.Q，I24D55.A3K，X-@5.AD//.*，D5-/1Q4D?:D3V CDA39@-V5 ,3 DC-,6/D［\］1K@.5RD YA23/_D,-53/1% F，$(:% E%!!1［! ］K/-@^D R1_?,-A B@D-:52-A2D@2D///.AD CDA39@-V5:-:,3 24-@-25D@.:5.2:3V:D D@-/5?,3@.9DA.22D///.AD:［\］1Z@D-:5K-A2+ D@RD:Q@D-51!""$，#":$"E F$1 ［!!］Z-A^D@5RZ，*9./,D8Jc，_D::IN1_?,-A+IKHN,3?:D24.,D+ @.2,3 H,,?A3/1% !，%%:#F$E#"#1 ［!%］Q-A9M]，I?A Oe，Q.-A\，D5-/1XD5-:5-5.24?,-A4D6-532D//?+ /-@2-@2.A3,-,3 635DA5.-/［\］1j3@/<\d-:5@3DA5D@3/1% !，):(")E$ !1 ［!#］K@-::.A.c，X?//.9-A IS，ZD:5Yd1Q-@9D5.A924@3A.2/;,6432;5+ .2/D?^D,.-2D//:.A54D5?,3@,.2@3DA .@3,DA5:P@D .D=3V54D .A .5@3-A<2/.A.2-/5@.-/:53<-5D［\］1j3@/<\K/.A K-:D:1 % !(，#:$"&E) &1 ［!&］W.W，j-A9_1_D5D@39DAD.5;3V/. 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D@［\］1J-5?@D1% !&，(!&: #F E#F&1 ［收稿日期］% !(+!!+!# 肝癌小鼠造模实验方法 (1)肿瘤细胞悬液的制备小鼠肿瘤细胞用小鼠腹腔培养，然后抽取腹水，是 取得大量肿瘤细胞最便捷的方法。具体操作如下：将肿瘤细胞株复苏后，接种于babl/c （昆明小鼠）腹腔，培养8-10天后，接种小鼠的腹腔内长出含肿瘤细胞的腹水，选择腹水饱满的小鼠，在超净台内于无菌条件下消毒小鼠腹部，用注射器抽取淡腹水为瘤源，放入无菌容器内，加入无菌生理盐水稀释瘤液，小心摇匀，并置冰水上保存。若用多只动物做瘤源时，则应混合腹水。(腹水应为淡黄色浓稠液体，若为深黄色或红色则应弃去不用。) (2)肿瘤细胞计数取少量腹水，放置于干试管内，用生理盐水稀释100倍，用 枪头吸取少许腹水，滴于载玻片上，推片，镜下观察细胞形态：细胞为圆形，胞浆均匀，透明，折光性好，分布均匀。并于镜下进行细胞分类计数，其中肿瘤细胞数应≥95％。 (3)肿瘤细胞接种腹水用无菌生理盐水调整细胞浓度为1*107mL ，在小鼠右侧腋下(右侧腋窝 皮下？)常规接种H22瘤液0．2mL ／只(含2*106个瘤细胞)（5*106）？。全程严格无菌操作， 40min 内完成。 (4)分组与给药昆明小鼠用上法造模，造模后再将腹水瘤小鼠按体重分层，随 机分为阳性对照组(CTX)、青蒿素各剂量组(150mg ／kg 、300mg ／kg)、青蒿琥酯P0组(60mg ／kg)、青蒿琥酯ip 组(60mg ／kg)、青蒿醇提物和青蒿水提物各剂量组 (1000mg ／kg 、4000mg ／kg)和模型对照组(Model)，每组各lO 只小鼠。造模24h 后，阳性对照组(CTX)20mg ／kg 和青蒿琥酯ip 组(60mg ／kg)，腹腔注射0．2mL ／只，每天1次，连续lOd ：其它组灌胃给药，灌服溶液0．4mL ／只，每天1次，连续lOd 。模型对照组仅予等量CMC-Na 溶液，连续lOd 。平均每只小鼠每天给等量鼠料，每周换垫料2次，每日换新鲜水1次。记录各小鼠死亡的时间。 其他问题： 检测药物对肿瘤的抑制作用，给药时间怎么确定？ 1、 造模后第二天给药 2、 肿瘤长出一定体积后在给药 小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验 [摘要] 目的:1.通过可移植性小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验，从感性上认识肿瘤侵袭与淋巴道转移的生物学特性，了解肿瘤动物实验模型建立的过程及意义。2.进一步了解动物尸体解剖、组织取材、染色的过程。3.强化科研思维的培养及实验技能的训练。 方法:将高转移力小鼠腹水型肝癌细胞(HCa - F)经 615 小鼠右腋中线皮下接种，定期观察右腋皮下肿瘤的生长和同侧腋窝淋巴结及腹 股沟淋巴结肿大情况，并于接种后 21 天处死全部小鼠，取皮下瘤体及双侧腋窝淋巴结，腹股沟淋巴结称重并测量大小，同时观察肿瘤的形态特点，生长方式，肺、肝、肾等脏器，并将瘤体、淋巴结及脏器做切片处理以作染色和镜下观察。 结果:21 天观察，实验使用 10 只小鼠，最终存活 8只，其中形成肿块 7 只（3只形成的肿块较大），成瘤率 70%，淋巴结转移率 70%。肉眼观察，较大肿瘤 2*1.5*1.3cm，灰白色，质地较硬，从中间切开，发现肿块大部分坏死，中心部分出现腔，腔内有肿瘤坏死物质。镜下观察，坏死组织粉染，轮廓尚存。残存肿瘤组织细胞存在异型性：瘤细胞大小和形态不一致，细胞核体积增大并呈现多形性，核浆比增大。核的大小、形状和染色不一。核分裂象增多，核浆比失调，胞浆减少。结论:高转移力小鼠腹水型肝癌细胞通过淋巴道转移，无器官转移，且具有高转移力。 [关键词]HCa-F（高转移力小鼠腹水型肝癌细胞); 615小鼠; 高淋巴道转移 [前言]研究背景:原发性肝癌的发生率地区差异大，在亚非国家较常见，我国的发病率较高，属于常见的肿瘤之一。近年来，我国对肝癌的防治研究取得了明显的成绩，一些直径在1cm一下的小肝癌已被发现并及时治疗取得满意的疗效[1]。随着临床治疗经验的积累，逐渐 上海中医药大学学报第26卷第4期2012年7月 辨证论治联合手术及化疗对H22肝癌小鼠疗效的观察 王艳明 1，2 方肇勤 1 张园园 1 潘志强 1 卢文丽 1 1．上海中医药大学基础医学院（上海201203） 2．河北省廊坊市妇幼保健中心（河北廊坊065000） 【摘要】目的：探索建立同病异证H22肝癌小鼠中药个体化辨证论治联合手术及化疗的综合治疗方案及初步评价其疗效。方法：采用H22肝癌细胞腋下实体瘤小鼠及小鼠标准化、计量化辨证方法，观察中药个体化辨证论治联合手术及化疗的综合治疗方案对小鼠带瘤生存时间、抑瘤率和证候等的综合疗效。结果：建立了中药个体化辨证论治联合手术及化疗方法，该方法在抑瘤率、术后早期生存率，以及改善小鼠免疫紊乱与衰退方面显示出一定的优势。结论：在实验室可以模拟临床，建立起肿瘤小鼠个体化辨证论治 联合手术及化疗方法， 为综合治疗方案的探索、优化和提高提供了方法学。【关键词】肝癌；小鼠；辨证论治；中西医结合；方法学【中图分类号】R285．5【文献标志码】A 【文章编号】1008-861X （2012）04-0087-05 ［基金项目］国家科技重大专项课题（2009ZX09502-018）［作者简介］王艳明，女，在读硕士生，主治医师，主要从事 中医学证和辨证论治的研究。［通讯作者］方肇勤，教授，博士生导师。E-mail ：zqfang@sh163．net 原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其 恶性程度高，发展迅速，病死率高，严重危害着患者的生命健康。当前，原发性肝癌治疗的首选是手术，当不具备手术指征时，常采用肝癌局部介入化疗和物理疗法，放疗也有采用。在我国，大多肝癌患者会 主动寻求中医药治疗， 因此，中西医结合治疗成为肝癌治疗的主要模式。中医药防治肝癌主要采取辨证论治的方法，针对肝癌邪毒、痰瘀、脾虚等主要病机，以及不同患者的特殊证候，予以清热解毒、行气活血、化痰软坚、健脾益气等综合治疗及个体化的辨证 论治 ［1-3］ 。项目组在前期的研究中发现肝癌小鼠与人类近似， 存在着证候的自然发生、兼夹和演变，是肝癌辨证论治研究的理想模式生物［4］ ，并逐步建立 起大鼠和小鼠标准化诊法和辨证方法［5-9］，尝试开 展了以中药复方为主的辨证论治［10-11］ ，取得了积极 的进展。并在以往的试验中利用基因芯片的检测发现同病异证的肝癌小鼠在神经-内分泌系统存在一 些重要激素的表达特征，具有各自的物质基础［12］ 。为了模拟临床实际，建立肝癌小鼠中西医结合治疗方法，并以此为基础，不断探索和优化中西医结合肝 癌防治方法、 揭示中西医结合防治肝癌的作用机制，我们在以往工作的基础上，进一步探索中药辨证论治联合手术及介入化疗对H22肝癌小鼠的治疗及 疗效评价， 报道如下。1材料与方法 1．1实验动物健康雄性昆明小鼠140只，体质量（25?1）g ，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动 物生产许可证号为SCXK （沪）2008-0003，动物使用 许可证号为SYXK （沪）2009-0069。1．2药物 1．2．1中药方剂（1）基本方：半枝莲15g ，白花蛇舌草15g ，香附10g ，八月札10g ，郁金10g ，延胡 索10g ， 当归10g ，川芎10g ，桃仁10g ，法半夏10g ，陈皮10g ，神曲10g 。 （2）气虚方：半枝莲15g ，白花蛇舌草15g ，香附10g ，八月札10g ，郁金10g ，延胡索10g ，当归10g ，川 芎10g ， 桃仁10g ，法半夏10g ，陈皮10g ，神曲10g ，生晒参10g ，黄芪15g ，白术10g ，阿胶10g 。 （3）阳气虚方：半枝莲15g ，白花蛇舌草15g ，香附10g ，八月札10g ，郁金10g ，延胡索10g ，当归10g ，川芎10g ，桃仁10g ，法半夏10g ，陈皮10g ，神曲10g ，生晒参10g ，黄芪15g ，白术10g ，阿胶10g ，淫羊藿10g ，山茱萸10g ，杜仲10g 。 （4）气阴阳虚方：半枝莲15g ，白花蛇舌草15g ，香附10g ，八月札10g ，郁金10g ，延胡索10g ，当归10g ，川芎10g ，桃仁10g ，法半夏10g ，陈皮10g ，神 曲10g ， 生晒参10g ，黄芪15g ，白术10g ，淫羊藿10g ，山茱萸10g ，杜仲10g ，阿胶10g ，熟地黄20g ，炙鳖甲10g ，炙龟甲10g 。 中药制备：以上4方均按标准的中药水煎醇沉方法，浸膏分别浓缩至1g /ml 。 1．2．2局部介入用化疗液每0．2ml 含5-Fu · 78· \篇二：缺氧 缺氧动物模型复制及中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧地影响 【摘要】目地：本实验学习复制乏氧性缺氧和血液性缺氧地动物模型方法，观察缺氧过程中呼吸地反应及血液色泽和全身一般情况地变化，并了解温度和中枢神经系统机能状态对缺氧耐受地影响以及对照实验和控制实验条件重要性.方法：通过复制缺氧动物模型，观察不同类型缺氧过程中呼吸、黏膜和血液色泽地变化.通过测定耗氧量和小鼠地存活时间来观察中枢神经系统机能抑制和低温对缺氧地影响.结果：中枢神经系统功能抑制和低温对动物耐受缺氧地影响与对照组相比，存活时间和总耗氧率有显著性差异；复制不同原因造成地不同缺氧类型小鼠都表现出了不同地呼吸频率和存活时间地变化.结论：给小鼠注射氯丙嗪、冰浴降温可显著降低总耗氧率，延长其存活时间（）.中毒、亚硝酸盐可显著缩短小鼠存活时间，降低呼吸频率.美兰可以缓解亚硝酸盐对小鼠地作用，已定程度延长小鼠存活时间，延缓呼吸频率地下降. 【关键词】缺氧氯丙嗪总耗氧率亚硝酸盐美兰存活时间 当供应组织地氧不足，或组织利用氧障碍时，机体地机能和代谢可发生异常变化，这种病理过程称为缺氧.根据缺氧地原因不同可将缺氧分为低张性缺氧、血液性缺氧、循环性缺氧和组织中毒性缺氧四种类型，不同类型地缺氧，机体地代偿适应性反应和症状表现有所不同. 1.材料和方法 1.实验动物：小白鼠（雌性）. 药品：氯丙嗪() 、钠石灰（ )，亚硝酸钠（ ) 、亚甲基蓝(美蓝）（，）、％ ( ) 、( ). 器材：、广口瓶和测耗氧装置. 方法 中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧地影响 取只性别相同体重相近地小鼠，准确称取体重，并随机分为生理盐水组和氯丙嗪组.氯丙嗪组按体重腹腔注射％氯丙嗪，随即安放在冰浴地纱布上 ，使呼吸频率降至次；生理盐水组按体重腹腔注射生理盐水，室温放置－，作为对照.之后将只小鼠分别放入地广口瓶内，连接好测耗氧装置.如右图. 不同原因造成地缺氧 取只性别相同体重相近地小鼠随机分为乏氧性缺氧组和一氧化碳中毒组.乏氧性缺氧组小鼠放入含有钠石灰地密闭瓶中；一氧化碳中毒组小鼠放入密闭瓶，注入气体. 另取只性别相同体重相近地小鼠随机分为亚硝酸纳组和亚硝酸纳治疗组.亚硝酸纳组小鼠腹腔注射亚硝酸纳，并随即腹腔注射生理盐水；亚硝酸纳治疗组小鼠腹腔注射亚硝酸纳后即刻腹腔注射亚甲基蓝 . 2.观察项目 2.1.中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧地影响 记录下小鼠地体重（）.从密闭测耗氧装置开始记时到小鼠死亡，分别观察氯丙嗪组和生理盐水组小鼠地存活时间（）、总耗氧量（）.按以下公式计算出总耗氧率[（·）]： [（·）] （）÷（）÷（） 2.2.不同原因造成地缺氧 乏氧性缺氧组和一氧化碳中毒组：处理前分别测出两鼠地正常呼吸频率（次）.待塞紧瓶塞开始记时后，每隔测一次呼吸频率（次），并观察两鼠地行为以及耳、尾、口唇等地颜色变化，直至小鼠死亡.记录死亡时间. 亚硝酸纳组和亚硝酸纳治疗组：处理前分别测出两鼠地正常呼吸频率（次）.待注射药品后，每隔测一次呼吸频率（次），并观察两鼠地行为以及耳、尾、口唇等地颜色变化，直至小鼠死亡.记录死亡时间. 将只鼠分别解剖取出小块肝脏组织置于滤纸上观察颜色地不同. 3.实验结果 中枢神经系统功能抑制和低温对缺氧地影响氯丙嗪组小鼠体重与生理盐水组小鼠体重 无显著性差异（）；氯丙嗪组小鼠地耗氧量为± ，生理盐水组小鼠地耗氧量为± ，两者无 2016年肝癌临床研究进展 回顾了一下2016年的肝癌研究进展，总结如下。流行病学在美国，肝癌是唯一一种发病率和死亡率均呈上升趋势的恶性肿瘤。为此，美国NIH预测了现在至2030年期间美国肝癌的发病情况。基于2000年至2012年的肝癌发病特征，研究者发现，目前肝癌发病人数上升的主要在于1959年之前出生的人群的贡献，而在1960-1969年出生的人群中，肝癌的发病率已经在下降。基于不同人种的肝癌发病率变化趋势，整体而言，无论是男性还是女性，在2030年之前，肝癌的发病率还是会继续上升。早期肝癌的根治性治疗包括我国在内，终末期肝病模型（MELD）是确定肝病患者接受肝移植优先性的依据。在2016年年初，OPTN/UNOS更新了MELD评分的计算方式，将患者的血清钠水平纳入了新的评分系统，被称为MELD-Na。MELD-Na是在原有的MELD 评分（MELD(i)）基础上进一步计算，计算公式是：MELD-Na = MELD(i) + ×(137-Na)–[×MELD(i)×(137-Na)]。如果血清钠低于125 mmol/L，则被设定为125；如果高于137则被设定为137。根据美国和欧洲肝病学会指南，伴血管侵犯的肝癌患者已属晚期，不适合接受手术等根治性治疗手段。但这观念一直受到包括日本在内的亚太地区学者的挑战。来自日本的一项回顾性研究中，研究者发现，部分伴有门脉癌栓 的患者接受手术依然有意义。6,474名合并门脉癌栓的患者纳入了该研究，其中2,093例接受了肝切除手术，4,381例接受了其他治疗。经过匹配分析，肝切除组的中位生存时间显著较长（年vs 年，P除非癌栓已经侵犯了门脉主干，否则还应该积极争取手术。中期肝癌的介入治疗经肝动脉化疗栓塞（简称介入）是中期肝癌的标准治疗方式，对于这部分患者，进一步提高介入的疗效是研究者探索的热点。在一项单中心的随机对照研究中，相比较传统的介入方式，使用阿霉素洗脱微球未显示出优势。该研究对比了使用普通微球或阿霉素（150 mg）洗脱的微球进行栓塞的安全性和疗效。研究一共募集了101例患者，结果显示，两组之间的副作用和疗效均没有显著差别。主要终点方面，两组的客观缓解率分别为%和%，次要终点方面，包括无进展生存期（月vs 月，P=）和总体生存期（月vs 月，P=）都没有显著差别。此外，在介入基础上加用贝伐单抗亦不能提高疗效，反而可能带来更多副作用。索拉菲尼则是晚期肝癌患者的标准药物治疗，将索拉菲尼的适应证扩大至中期肝癌，与介入联用，则不能进一步提高介入的疗效。在今年年初公布的SPACE研究已经已经得到了这一结论。这是一项全球多中心、随机、双盲、安慰剂对照的2期临床研究，中国大陆也有两个中心参与其中。介入治疗使用的阿霉素洗脱的微球，所入组的患者是中期的多发肝癌患者，这些患者无大血管癌栓或肝外转移。研 建立小鼠肿瘤模型的研究进展 摘要：建立一种理想的肿瘤动物模型对研究肿瘤的发病、治疗和预防有重大的意义。其中小鼠肿瘤模型具有生长周期快、易获得、易操作等优点被基础实验研究所广泛采用，如何选择和建立一个合适的小鼠肿瘤模型对肿瘤的整个研究有着举足轻重的作用。 关键字：肿瘤，动物模型，小鼠 肿瘤，是一种严重威胁人类健康的多发病和常见病。对肿瘤的研究一般都是在人类疾病动物模型的基础上展开的。建立一个完全反映人类疾病的动物模型比较困难，但可依据不同的实验目的选择相应的动物实验模型。 1.实验动物的选择 可用作肿瘤模型的动物有很多，小鼠肿瘤模型作为其中一种常用模型主要因为有以下几个优点。（1）易获得，常用的肿瘤模型小鼠通常采用SPF级小鼠，SPF级小鼠一般医学院校及研究所都能买到。（2）生长周期短，一般小鼠肿瘤模型两周左右就能长大，能大大缩短实验周期。（3）易操作，小鼠的动物实验操作一般简便，因此可适当增加组内样本数量，使实验数据更具说服力。 2.理想的建立肿瘤模型应具备的条件 （1）肿瘤生长的过程应与人类肿瘤生长过程相似，做到尽可能复制出与人类肿瘤相同的模型。 （2）制作模型的方法简单易行。 （3）动物模型的重复性要好，要能满足实验的多次重复试验结果稳定性好。 （4）采用的建模方法对实验人员和环境无危害或危害较小。 3.肿瘤来源的选择 现在世界上保有近500种的动物移植瘤，但常用于筛药的不到40种，多数为小鼠肿瘤，其次是大鼠和仓鼠移植瘤，包括小鼠L1210淋巴白血病，P1534淋巴白血病，艾氏腹水瘤，Friehd病毒白血病，肉瘤180，白血病P388，Lewis肺癌，腺癌755，白血病615，Walker-256，吉田肉瘤，肉瘤45，Liol淋巴瘤，Dunning 白血病，Ｗagner癌肉瘤，白血病L5170Y，P1798淋巴肉瘤，LPC-1浆细胞瘤，淋巴瘤8，B16或Cloadman黑色素瘤，Ridaway骨肉瘤，Gardner 淋巴肉瘤，肉瘤37，P315白血病，Mur hy-sturm淋巴肉瘤，Jensen肉瘤，Geurin氏癌，仓鼠十二指肠腺癌和人体肉瘤HSL第1代杂交鼠移植。它们对抗癌药作用的敏感性大致可分 共识.中华肝脏病杂志,2004,12∶425～428 11 Perrillo RP ,Lai CL ,Liaw YF ,et al .Predictors of HBeAg loss after lamivudine treatment for chronic hepatitis B .Hepatotogy ,2002,36∶186～194 12 Rizzetto M ,Tassopoulos NC ,Goldin RD ,et al .Extended lamivu -dine treatment in patients with HBeAg -negative chronic hepatitis B .J Hepatol ,2004,41∶1070～1076 13 Ryu SH ,Chung YH ,Choi MH ,et al .Long -term additional lamivu -dine therapy enhances durability of lamivudine -induced HBeAg loss :a prospective study .J Hepatol ,2003,39∶641～619 14 Chien RN ,Yeh CT ,Tsai SL ,et al .Determinants for sustained HBeAg response to lamivudine therapy .Hepatology ,2003,38∶1267～1273 15 党红星,何瑞,马跃东.拉米夫定致小儿锥体外系反应二 例.中华儿科杂志,2004,42∶436 16 Lok ASF ,Zoulim F ,Locarnini S ,et al .Monitoring drug resistance in chronic hepatitis B virus (HB V )-infected patients durin g lamivud ine therapy :evaluation of performance of INNO -LiPA HBV DR assay .J Clin Microbio ,2002,40∶3729～3734 17 Suzuki F ,Suzuki Y ,Tsubota A ,et al .Mutations of polymerase , precore and core promoter gene in hepatitis B virus during 5-year lamivudine therapy .J Hepatol ,2002,37∶824～830 18 Qaq ish RB ,Pharm D ,Mattes KA ,et al .Ad fovir dipivoxil :A new antiviral agent for the treatment of hepatitis B virus infection .Clin Therapeut ,2003,25∶3084～3099 19 Bozdayi AM ,E yigun CP ,Turkyilmaz AR ,et al .A novel pattern (sW195a )in surface gene of HBV DNA due to YSDD (L180M plus M204S )mutation selected during lamivudine therapy and success -ful treatment with adefovir dipivoxil .J Clin Virol ,2004,31∶76～77 20 Qarugan RB ,Gomez LC ,Serrano PL .Use of adefovir in the treat -ment of the chronic hepatitis B virus infection with res istance to lamivudine .Transplant Proc ,2003,35∶1841～1843 21 Villeneuve JP ,Durantel D ,Durantel S ,et al .Selection of a hepati -tis B virus strain resistant to adefovir in a liver transplantation pa -tient .J Hepatol ,2003,39∶1085～1089 22 梁扩寰,主编.肝脏病学.第1版,北京:人民卫生出版社, 1995.520 23 张瑞琪,缪晓辉,倪武.膦甲酸钠治疗慢性乙型肝炎47例. 中华传染病杂志,2002,20∶180～181 (收稿:2004-12-10) (校对:郭顺明) 肝癌动物模型的建立 徐 静 综述 李 旭 审校 作者单位:230022 合肥市 安徽医科大学附属医院感染科 自20世纪初获得小鼠自发性肝癌动物模型以来,人们对肝癌动物模型的研究不断深入,逐渐建立了诱发性肝癌模型、移植性肝癌模型及转基因动物肝癌模型。下面就各类肝癌动物模型的建立方法和特点作一简述。 一、自发性肝癌动物模型 是指实验动物未经任何有意识的人工处置,在自然情况下所发生的肿瘤。实验动物多选用近交系小鼠,由于实验动物种属、品系的不同,肿瘤发生类型和发病率有很大差异。14月龄以上的C3Hf 系雄鼠、C3H 系雄鼠和C3He 雄鼠的发生率分别为72%、85%和80%[1]。 自发性肝癌动物模型最大的优点是,系完全在自然条件下发生的疾病,排除了人为因素,肝癌的发生、发展与人类肝癌相似,反映了动物的肿瘤易感性和环境致癌物质、促癌物质的积聚程度,但其发生率低且不稳定,发生时间较长、难预测且参差不齐,荷瘤动物个体在动物(性别、体重、肿瘤发生时间等)和肿瘤(大小、数目、部位等)两方面差异较大,造模有一定的困难。该模型主要用于病理学研究和作为移植性肿瘤的瘤源。 二、诱发性肝癌动物模型 诱发性肝癌模型是指用化学、物理、生物的致癌因素在实验条件下诱发动物发生肝癌,它是 进行实验肿瘤学研究的常用方法。其中化学性致癌物最常见,如亚硝胺类(DEN )、黄曲霉素类(AFB1)、氨基偶氨燃料类(3′-Me -DAB )、芳香胺类化合物(2-AAF )等。最常用的实验动物为大鼠,多选用敏感性高的纯系大鼠。目前常用的品系有:Wistar 、Spraque -Dawley 和Fischer344,前两者在国内应用更为广泛。大鼠的年龄和性别均对致癌性有影响。一般认为幼年雄性大鼠对致癌的敏感性较高,但有时也可出现幼年雌性大鼠诱癌成功。鼠龄以3个月以内、体重120克以下的大鼠诱癌启动率高于月龄大的大鼠,而体重200克以上或1岁以上的大鼠的肝癌启动率低,很难诱发肝癌。这与其组织中的肝细胞或幼稚细胞的状态以及细胞的增殖水平有关。 诱发性大鼠肝癌的给药途径主要有经口给药法和注射给药法。经口给药法又分为自动口服给药和强制灌胃两种,前者是将水溶性致癌物溶于水中或将非水溶性致癌物混于饲料中让大鼠自动摄取,此法简单方便,但由于动物饮水和饲料的摄取量不同,不能保证给准确药量;后者是将溶于水或悬浮于载体的诱癌剂通过特制的灌胃针头给大鼠灌胃,此法能准确掌握给药量,但强制性操作和定时给药会对动物造成一定程度的机械性损伤和心理上的影响。注射法也是一种常用的方法,可将 诱癌剂溶于可溶性液体中或悬浮于载体中,通过各种部位注射 World Journal of Cancer Research 世界肿瘤研究, 2015, 5, 15-20 Published Online January 2015 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/4812987880.html,/journal/wjcr https://www.wendangku.net/doc/4812987880.html,/10.12677/wjcr.2015.51003 Orthotropic Transplantation to Establish H22 Hepatocellular Carcinoma Model in Mice Chen Han1,2, Hengxiao Wang1,2*, Zhaoxia Wang3 1Department of Immunity, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan 2School of Medicine and Life Sciences, University of Jinan-Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan 3Department of Pathology, Institute of Basic Medicine, Shandong Academy of Medical Sciences, Ji’nan Email: *wanghengxiao@https://www.wendangku.net/doc/4812987880.html, Received: Nov. 24th, 2014; revised: Dec. 22nd, 2014; accepted: Dec. 30th, 2014 Copyright ? 2015 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.wendangku.net/doc/4812987880.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Objective: To establish a liver orthotropic transplantation tumor model with H22 cells, for the further development of the related experimental study. Methods: A certain number of H22 cells were directly injected in the left lobe of the liver in C57BL/6 mice, establishing a transplanted tu-mor model of hepatocellular carcinoma in situ. Results: After 7 days of surgery, the liver surface appeared irregular size nodules, nodules increased with the prolongation of time increases, the late abdominal organs appeared invasion, adhesion, ascites was increased. Histopathological ex-amination of liver tumor tissues and adjacent tissues of cancer showed that liver orthotropic transplantation tumor formation rate was 100%, no spontaneous regression. Conclusions: Ortho-tropic injection of H22 cell established orthotropic transplantation tumor formation in the liver, and the tumor formation time was relatively short, tumor formation processes associated with organ metastasis and ascites. This model was reasonable to simulate the pathological and physio-logical body of liver cancer in human, and could satisfy the requirement of research on liver can-cer. Keywords Hepatocellular Carcinoma, Orthotropic Transplantation, Experimental Animal Models 原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞 移植瘤小鼠模型 韩琛1,2，王恒孝1,2*，王朝霞3 *通讯作者。 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910255261.0 (22)申请日 2019.04.01 (71)申请人 南通大学附属医院 地址 226001 江苏省南通市西寺路20号 (72)发明人 郑文杰 姚登福 张捷 金云峰 倪温恺 徐育青 (74)专利代理机构 南通市永通专利事务所(普 通合伙) 32100 代理人 葛雷 (51)Int.Cl. C12N 5/071(2010.01) C12N 5/09(2010.01) (54)发明名称 一种肝癌类器官模型的体外构建方法 (57)摘要 本发明公开了一种肝癌类器官模型的体外 构建方法，将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮 细胞，按特定比例混悬于培养基A；培养至第4天， 半量换液维持培养；第7天开始，换为培养基B，连 续培养7天；第14天传代扩增培养。本发明基于肿 瘤微环境中复杂的细胞构成，快速构建大小均 一、结构稳定、可检测抗癌药物有效性，并可扩增 培养的3D肝癌类器官体外模型。本发明构建的肝 癌类器官模型方法简易，构建迅速，可操作性强， 适用于研究肝癌发生发展机制、以及肝癌药物高 通量筛选等， 具有产业化意义。权利要求书1页 说明书4页 附图3页CN 110004109 A 2019.07.12 C N 110004109 A 1.一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：包括下列步骤： （1）将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，混悬于培养基A，静置培养；（2）第4天使用培养基A半量换液，维持培养；（3）第7天换为培养基B培养7天；（4）第14天取肝癌类器官消化传代，消化后的细胞按步骤（1）~（3）的培养方法继续培养；所述培养基A包括：青霉素、链霉素、I型鼠尾胶原蛋白、维生素C、牛胰岛素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氢化可的松、谷氨酰胺、胎牛血清、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和DMEM/F12培养基； 所述培养基B包括：青霉素、链霉素、转铁蛋白、维生素C、牛胰岛素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氢化可的松、谷氨酰胺、胎牛血清、Wnt3a、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和DMEM/F12培养基。 2.根据权利要求1所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，使用计数仪计数，按7:2:1的特定比例，混悬于培养基A。 3.根据权利要求书2所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，按特定比例混匀于培养基A后，计数并按每孔2000个细胞使用排枪均匀地接种于96孔-超低吸附圆底细胞板，每孔接种细胞混悬液体积为100μL。 4.根据权利要求书3的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，按比例混悬于培养基A，接种于96孔-超低吸附圆底细胞板，然后放入37℃二氧化碳培养箱，静置培养，尽量避免移动。 5.根据权利要求书4所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：第4天半量换液一次，使用微量移液枪紧贴培养基液面，吸弃孔中50μL培养基，并加入等量培养基A。 6.根据权利要求书5所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：培养至第7天，使用微量移液枪，紧贴培养基液面，吸出旧培养基；再沿孔壁缓慢加入100μL培养基B，隔日吸弃50μL培养基，加入等量培养基B，持续培养7天。 7. 根据权利要求书6所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：培养至第14天，使用1000μL移液枪，吸出96孔板中所有类器官置离心管，吸弃上清，加入500μL Accutase放入37℃二氧化碳培养箱孵育30min，离心去上清后使用培养基A计数、重悬并稀释，按步骤（1）~（3）的培养方法继续培养。8. 根据权利要求书1、2、3或4所述的一种肝纤维化类器官模型的体外构建方法，其特征是：培养基A包括：100U/mL青霉素、100μg/mL 链霉素、2~10μg/mL I型鼠尾胶原蛋白，1μg/mL维生素C、10μg/mL牛胰岛素、2μmol/mL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10ng/mL氢化可的松、2~10μmol/mL谷氨酰胺、4~8%胎牛血清、10~50ng/mL表皮生长因子、10~50ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和DMEM/F12培养基；培养基B包括：100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2~10μg/mL转铁蛋白、1μg/mL维生素C、10μg/mL牛胰岛素、2μmol/mL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10ng/mL氢化可的松、2~10μmol /mL谷氨酰胺、8-12% 胎牛血清、2~50ng/mL Wnt3a、10~50 ng/mL表皮生长因子、10~50 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10~100 ng/mL肝细胞生长因子和DMEM/F12培养基。 权 利 要 求 书1/1页2CN 110004109 A 落地生根水提物对H22肝癌小鼠免疫功能的影响分析 发表时间：2019-12-12T12:48:00.970Z 来源：《医药前沿》2019年32期作者：杨志杰樊星花梁宇红[导读] 目的：探讨落地生根水提物对H22肝癌小鼠免疫功能的影响。 （广西医科大学第四附属医院暨柳州市工人医院药学部广西柳州 545005）【摘要】目的：探讨落地生根水提物对H22肝癌小鼠免疫功能的影响。方法：建立H22荷瘤小鼠模型，随机分为空白组、阳性组（5-FU）、模型组、水提物低剂量组（4g/kg生药量）、中剂量组（8g/kg生药量）及高剂量组（16g/kg生药量）共6组，每组10只。阳性组按20mg?kg-1腹腔注射5-FU，模型组、空白组灌服等体积生理盐水，连续给药15天。进行碳廓清试验，计算抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数和肝脏指数。结果：落地生根水提物中、高剂量组可明显抑制H22实体瘤生长（P＜0.05），抑瘤率分别为65.68%和74.56%。中、高剂量组可显著增高碳廓清指数（P＜0.05）与脾脏指数（P＜0.05），仅中剂量组对胸腺指数有显著增高作用（P＜0.05），落地生根水提物对肝 脏指数无影响。结论：落地生根水提物对H22荷瘤小鼠的免疫系统有一定的保护作用，能调节巨噬细胞吞噬功能的作用，增强机体的免疫功能，提高抗肿瘤能力。 【关键词】落地生根水提物；H22；免疫功能；小鼠【中图分类号】R964 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2019）32-0206-03 落地生根Bryophyllum pinnatum (L.f.) Oken为景天科(Crassulaceae)落地生根属(BryophllurnSalisb)植物，在广西、广东、云南、福建和台湾等地区广泛分布，别名为花蝴蝶、倒吊莲、土三七、叶生根、番鬼牡丹、叶爆芽、天灯笼、枪刀草、厚面皮、著生药等，全草入药，性酸、寒[1]。除具有观赏价值外，还具有药用价值，可治创伤出血、疔疮、乳腺炎、跌打损伤吐血、热性胃痛、关节肿痛、急性中耳炎、皮肤溃疡等[2]。在国外，落地生根广泛分布于非洲、美洲热带以及印度和澳大利亚，作为传统药物用于腹泻、呕吐、镇痛、抗炎、抗病原微生物、利什曼病及抗变态反应等[3]。本实验就落地生根对H22肝癌小鼠免疫功能影响做研究，尝试对落地生根水提物抗肿瘤的作用进行初步探讨。 1.资料与方法 1.1 一般资料 1.1.1细胞株及动物小鼠H22肝癌细胞由广西医科大学药理学教研室提供，经本实验室传代保存。昆明种小鼠60只，体质量18～22g，雌雄不拘，由广西医科大学实验动物中心提供。试验动物使用许可证 SCXK2009-0002。 1.1.2药品与试剂落地生根采取于广西来宾市忻城县，经河池学院化学与生物工程学院邓晰朝副教授鉴定为鉴定景天科(Crassulaceae)落地生根属(BryophllurnSalisb)植物落地生根Bryophyllum pinnatum (L.f.) Oken。氟尿嘧啶注射液（5-FU），天津金耀药业有限公司，批号1504261。一得阁墨汁购于一得阁墨业有限责任公司。 1.2 仪器 多功能提取浓缩机组(上海顺仪实验设备有限公司)；分析天平(日本岛津公司)；DRAGON LAB移液器(20～200μL)( 大龙兴创实验仪器（北京）有限公司)；酶标仪（美国伯乐BIO-RAD公司）。 1.3 药材提取 取6100g落地生根干药材，加10倍量蒸馏水，回流提取3次，每次1小时，过滤，合并3次滤液，浓缩成浸膏，浸膏量为1246.8g，置于4℃冰箱，待用。 1.4 造模、分组及给药 取冻存的H22肝癌细胞，复苏为0.9%氯NaCL溶液混悬，小鼠腹腔注射，连续传两代。无菌条件下取H22肝癌小鼠腹水，稀释成含量为1×107?mL-1的细胞悬液后于小鼠右侧腋窝皮下接种，小鼠接种肿瘤细胞悬液后称体重，随机分为空白组、阳性组（5-FU）、模型组、水提物低剂量组（4g?kg-1生药量）、中剂量组（8g?kg-1生药量）及高剂量组（16g?kg-1生药量）共6组，每组10只。空白组为正常小组，阳性组按20mg?kg-1给予5-FU腹腔注射，模型组、空白组灌服等体积生理盐水。各组均于接种后24小时开始给药，每天1次，连续15天。 1.5 小鼠碳廓清实验 末次给药24小时后,尾静脉注射以生理盐水稀释4倍的印度墨汁,每10g体质量注射0.1mL，墨汁注入后立即计时，于注入墨汁后第2（t1）、10min（t2），分别从内眦静脉丛取血20μL，加入到2mL 0.1% Na2CO3溶液中，摇匀。以0.1% Na2CO3溶液作空白对照，用酶标仪在600nm波长处比色测定光密度值（OD）。将小鼠处死，取肝、脾，称质量，计算吞噬指数（a)。吞噬指数计算方法：K=（lgOD1-lgOD2)/(t2-t1).吞噬指数（a)=体质量×K1/3（肝质量+脾质量）。 1.6 瘤重、胸腺指数、脾脏指数、肝脏指数的测定 分别称取小鼠体重，脱颈椎处死小鼠，剥离肿瘤组织，取小鼠脾脏、胸腺和肝脏，精密称定，计算抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数和肝脏指数：肿瘤抑制率（%）={1-（平均实验组瘤重/平均对照组瘤重）}×100%；胸腺指数=胸腺质量/体重；脾脏指数=脾脏质量/体重；肝脏指数=肝脏质量/体重。 1.7 统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，所有数据均以-x±s表示，两组间差异比较采用t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。 2.结果 2.1 抑瘤作用 研究结果显示，与模型组比较，落地生根水提物中、高剂量组可明显抑制小鼠H22实体瘤生长（P＜0.05)，抑瘤率分别为65.68%和74.56%，与5－氟尿嘧啶作用相当，见表1。 表1 落地生根水提物对小鼠瘤重及免疫脏器指数的影响 小鼠免疫力对接种人类肝癌细胞系9724生 长的影 作者：张志培，施新猷，李六金，刘雪松，江逊，彭磊，赵佐庆 【关键词】肝癌细胞 关键词: 肝癌细胞;接种;免疫缺陷小鼠;T细胞;细胞毒;流式细胞仪 摘要:目的探讨不同免疫力小鼠的免疫细胞对人类肝癌细胞系9724生长的影响及异种特异性细胞毒杀伤能力. 方法将培养后的人类肝癌细胞系接种到不同免疫力小鼠（免疫正常的BALB/c，B缺陷的CBA/N，T缺陷的BALB/c nude及T，B缺陷的C.B-17SICD小鼠）右后臀皮下，观察其生长;取实验和相应的正常鼠脾细胞进行细胞毒杀伤试验. 结果 BALB/c和CBA/N小鼠不成瘤;BALB/c nude和C.B-17SCID 小鼠100%成瘤;SCID免疫重建组用BALB/c外周淋巴细胞重建SCID （BALB/c-PBL-SCID）的不成瘤，用CBA/N外周淋巴细胞重建的SCID （CBA/N-PBL-SCID）成瘤，接种过瘤的BALB/c和CBA/N小鼠脾细胞对癌细胞有较强的细胞毒杀伤作用，对照组和nude，SCID小鼠无杀伤作用;SCID免疫重建有较小的杀伤作用. 结论 T细胞在异种瘤移植排斥中起主要的免疫杀伤作用，这种排斥是异种特异性的;肿瘤免疫需要综合性免疫作用. Keywords:hepatocarcinoma cell;vaccination;immunodefi-cient mice;T lymphocytes;cytotoxicity;flow cytometry Abstract:AIM To explore the effect of immune cells in var-ious mice with different immune on growth of human hepato-carcinoma cells in these mice and xenospecific cytotoxicity of these mice to hepatocarcinoma cells.METHODS The hu-man hepatocarcinoma cells cultured were inoculated subcuta-neous into the posterior limbs in various mice with different immune（including normal immune mice-BALB/c，B lympho-cyte deficient mice-CBA/N，T lymphocyte deficient mice-BALB/c nude and T，B lymphocytes combined deficient mice-C.B-17SCID）and their growth in the mice.Were surveyed And the spleen cells were harvested from both experiment groups in5weeks after being inoculated and from control groups a to examine direct cytotoxicity to the hepatocarci-noma cells.RESULTS There were no carcinoma growth in BALB/c，CBA/N mice and immunoreconstructed SCID mice with BALB/c mice peripheral blood lymphocytes（BALB/c-PBL-SCID）but100%carcinoma growth in SICD，nude and immunoreconstructed SCID mice with CBA/N肝癌小鼠造模实验方法
小鼠腹水型肝癌淋巴道转移实验
辨证论治联合手术及化疗对H22肝癌小鼠疗效的观察
小鼠缺氧实验实验报告
2019年肝癌临床研究进展
建立小鼠肿瘤模型的研究进展
肝癌动物模型的建立_徐静
原位移植法建立肝脏H22肝癌细胞移植瘤小鼠模型
【CN110004109A】一种肝癌类器官模型的体外构建方法【专利】
落地生根水提物对H22肝癌小鼠免疫功能的影响分析
小鼠免疫力对接种人类肝癌细胞系9724生长的影