冰冻切片与石蜡切片的区别

1．冰冻切片是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性,尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。

冰冻时，组织中水份易形成冰晶,往往影响抗原定位。一般认为冰晶少而大时,影响较小,冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率)成反比,即冰晶形成的数量愈多则愈小,对组织结构影响愈严重。因此,应尽量降低冰晶的数量。Fiｓh认为冰冻开始时,冰晶成核率较慢,以后逐渐增加，其临界温度为-3３。C，从-3０。C降至-43。C之间，成核率急剧增加达1018，然后再减慢。基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。

(1)速冻,使组织温度骤降，缩短从-３３。C43。C的时间,减少冰晶的形成。其方法有二：

①干冰-丙酮（酒精)法：将15０－２00ｍｌ丙酮(酒精）装入小保温杯内，逐渐加入干冰,直至饱和呈粘稠状,再加干冰不再昌泡时,温度可达-７0℃C，用一小烧杯(50－100ml)内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮(纯酒精)饱和液内,至异戊烷温度达-7０℃时即可使用。将组织(大小为1cm×0.8ｃｍ×0.5cm）投入异戊烷内速冻３０-6０s后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80℃低温冰箱内贮存。

②液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约２cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内,当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中,大约10-2０s组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入－80℃冰箱贮存备用,或置入恒冷箱切片机冰冻切片。

（2)将组织置于20%-30%蔗糖溶液1~３天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。

影响冰冻切片的因素较多，因此，技术难度较大，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。目前冰冻切片机有两类:

①恒慢冰冻切片机（Cｒｙasｔat）：为较理想的冰冻切片机,型号很多，但其基本结构是将切片机置于-3０℃C低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响,可连续切薄片至2-4μｍ，完全能满足免疫组织化学标记要求。切片时，低温室内温度以-15℃～18℃为宜,温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当,载玻片附贴组织切片,切勿上下移动。

②开放式冰冻切片机：包括半导体致冷切片机和甲醇致冷切片以及老式的ＣＯ2、氯乙烷等冷冻切片机。切片时暴露空气中,温度不易控制，切片技术难度大，在高温季节，切片更加困难，且切片厚8~15μm,不易连续切片，但其优点是价廉，国内有生产。

冰冻切片后如不染色，必须吹干，贮存低温冰箱内,或进行短暂预固定后贮存冰箱保存。

2.石蜡切片其优点是组织结构保存良好,在病理和回顾性研究中有较大的实用价值,能切连续薄片,组织结构清晰,抗原定位准确。用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同：①脱水、透明等过程应在4℃。C下进行,以尽量减少组织抗原的损失。②组织块大小应限于２cｍ×１.5cｍ×0.2cｍ,使组织充分脱水、透明、浸蜡。③浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下,以溶点低的软蜡最好（即低温石蜡包埋)。

组织块脱水、透明、浸蜡时间参考表1-3：

表 1-3 组织块处理时间表

1 70%乙醇４℃ 3～4h

２ 80%乙醇 4℃３～4ｈ

3 ９0%乙醇4℃2~３h

4 95％乙醇Ⅰ４℃ 2~３h

5 95%乙醇Ⅱ４℃ 1～2ｈ

６ 100%乙醇Ⅰ４℃ 1.5ｈ

7 1０0%乙醇Ⅱ4℃1．5h

8 二甲苯Ⅰ 4℃ 0.５～１h

９二甲苯Ⅱ 4℃0.５１～1ｈ

10 石蜡Ⅰ 60℃１h

１１石蜡Ⅱ60℃ 2h

以上全过程为18-24h，也可在室温内使用自动脱水机代替。如组织块小，直径小于０.5ｃm,可用快速石蜡包埋切片，全过程只需4h左右。

石蜡切片为常规制片技术,切片机多为轮转式,切片厚度2～７μm，应用范围广，不影响抗体的穿透性，染色均匀一致。由于甲醛固定、有机熔剂和包埋剂对组抗原有一定的损害及遮蔽，使抗原特征发生改变。有人报告经蛋白酶消化，可以改善光镜免疫组化染色强度,常用的有胰蛋白酶、链霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蜡切片应入3７℃恒温箱过夜,这样烤片可减少染色中脱片现象。切片如需长期贮存,可存放于４℃冰箱内备用。

石蜡切片优点较多,但在制片过程中要经过酒精、二甲苯等有机溶剂处理,组织内抗原活性失去较多,有人采用冷冻干燥包埋法(Ｆrｅeze drｙinｇeｍbedｄｉnｇ meｔhed),可以保存组织内可溶性物质，防止蛋白变性和酶的失活,从而减少了抗原的丢失。该法是将新鲜组织低温速冻,利用冷冻干燥机（Freezing dryer）在真空、低温条件下排除组织内水分 ,然后用甲醛蒸气固定干燥的组织，最后将组织浸蜡、包埋、切片。此法可用于免疫荧光标记、免疫酶标记及放射自显影。

术中冰冻与石蜡切片诊断准确性分析

XX医院病理科2010～2012年术中冰冻与石蜡切片诊断准确性分析 肿瘤手术中冰冻切片快速病理诊断具有十分重要的意义，它不仅是鉴别良、恶性肿瘤准确快速的方法，也是指导临床医生决定手术切除范围及制定下一步治疗方案的关键手段。比较冰冻切片快速病理诊断与石蜡切片病理诊断的符合率，分析可能导致误诊的原因。现 对我科2010年１月～2012年5月间所有冰冻切片诊断工作进行回顾性分析。 一、材料与方法 为防止制成的冰冻切片镜下组织形态发生改变，送检标本要求用干纱布包裹或置于不加任何液体的洁净容器内及时送达病理科，病理医师详细检查大体标本后取肉眼确认病变最明显区域1～2块组织，迅速置全自动恒冷切片机（英国产SHANDN ）上制作切片。切片厚4μm，经酒精固定，HE 染色，普通光镜（Olympus BX41）下观察。 二、结果

三、讨论 冰冻切片与石蜡切片诊断的符合率逐年有所提高，说明我科病理医生对冰冻切片诊断的知识面及经验都有所提高。误诊原因分析

1、科外因素： ⑴.术中标本送检时放入生理盐水或其它液体中，或用湿纱布包裹标本，或术者用水冲洗标本等，做冰冻切片时由于骤冷产生大量冰晶使组织呈空网状，使病理医师误认为是粘液或脂肪组织来源的肿瘤，被迫第二次取材。 ⑵.手术医师取材不当或取材错误，可造成冰冻切片诊断的准确率和预测值之间的差异，如滑膜肉瘤送检组织为纤维结缔组织；胰腺癌时切取正常胰腺组织送检；脑胶质瘤送检脓性坏死渗出物，从客观上导致假阴性。 ⑶.有些病变由于组织结构的特殊性，冰冻切片很难确诊，例如：①乳腺硬化性病变，包括某些类型的腺病（硬化性腺病）及放射状瘢痕。有人认为良性硬化性病变与硬癌的鉴别很困难，在冷冻切片中尤其如此。我们曾遇见过乳腺硬化性腺病的假浸润现象而诊断为乳腺癌的病例。②乳腺乳头状病变，包括导管内乳头状瘤与末梢导管的乳头状瘤病。③乳腺导管上皮增生性病变，包括不典型增生。本组有一例导管上皮增生呈“搭桥”样生长，并形成不规则的间隙，误诊为恶性。这些病变有时在石蜡切片中多处取材都可能难以确诊，不能苛求在一张切片短时间内作出确切诊断，必须等待石蜡切片最后确诊，特别是对年轻患者。 2、科内因素：

HE石蜡切片步骤,免疫组化步骤

HE染色 1．取材 切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以6mm×6mm×5mm为宜。 注意事项： （1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 （2）切片材料应根据需要观察的部位进行选，尽可能不要损伤所需要的部分。 2．固定 将切好的组织用生理盐水组织洗3次，立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定，固定36小时。 注意事项： （1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。 （2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。 （3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。 （4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。 脱钙72小时中间不换液是样本30倍中杉金桥（进口脱钙液） 镊子触质粒由硬变韧性为准。 （美）：固定3-5天根据组织大小确定天数，越大固定时间越长。 3. 洗涤 材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。（20，30，30，60） （美）：流水冲洗约4小时 4. 脱水 材料依次经80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水，各30min 注意事项： （1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。 （2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。 （3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。 （4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。（5）如需过夜，应停留在80%酒精中。 （6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象 （美）：80％的酒精×2小时 95％的酒精×2小时 100％的酒精×2小时×2 100％的酒精×1小时或者更长时间 5．透明（环保透明脱蜡液）中杉金桥 纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ60min、Ⅱ30min（至透明为止）。 由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。

石蜡切片的基本操作流程

石蜡切片的基本操作流程 一、取材选取目的组织块，修剪到合适的大小； 二、固定 将组织块放入福尔马林固定液（10%甲醛溶液），固定时间由组织块大小而定，一般不少于24h；体积1cm3的组织块，一般为3-7天； 三、冲水自来水洗几下，泡1小时； 四、系列酒精脱水 50%酒精，1h； 70%酒精，1h； 80%酒精，1h； 90%酒精，1h； 100%酒精（I），1h； 100%酒精（II），1h； 五、透明 酒精：二甲苯=1：1溶液，过夜； 二甲苯，1h； 六、包埋 二甲苯：石蜡=1：1，65-70 ℃，2h； 新鲜石蜡（I），65-70 ℃，1h； 新鲜石蜡（II），65-70 ℃，4h； 新鲜石蜡包埋； 七、切片切片厚度为5-7um； 八、展片温水（40-42 ℃）展片； 九、捞片将展好的片子贴于载玻片上； 十、烘片42 ℃将片子上的水烘干； 十一、烤片60 ℃烤片12-24h； 十二、脱腊 二甲苯（I）：2min； 酒精：二甲苯=1：1溶液：2min； 十三、水化 100%酒精（I）：1min； 100%酒精（II）：1min； 95%酒精：1.5min； 80%酒精：1.5min； 70%酒精：1.5min； 50%酒精：1.5min； 自来水洗：2min 十四、H&E染色 Hematoxylin染色3-5min(2.5min时取出观察染色效果)，自来水洗3次，盐酸分化（2/3杯玻璃缸+3滴1N盐酸），10s；自来水洗蓝化，镜下观察染色效果；（伊红）Eosin染色30-50s，直接脱水（90%酒精-----100%酒精I，100%酒精II各1分------酒精：二甲苯=1：1溶液：1-1.5min）；十五、脱水 90%酒精-100%酒精-100%酒精，各1min； 十六、透明 二甲苯：酒精：1-1.5min；二甲苯：2min；

冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处

创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么 1、从一抗的选择方面来看。有的一抗既能做石蜡切片又能做冰冻切片，而有的一抗只能做冰冻切片，关键取决于所要检测的 抗原稳定性，有的抗原不稳定，经过组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等一系列的做石蜡切片的步骤，所检测的抗原易被破坏，这时只能用冰冻切片来做，检测这类抗原的一抗只能做冰冻切片，而那些稳定的抗原，能经受住石蜡切片的的考验，一般来讲也可以用冰冻切片来做，总得来讲，对于既可以用冰冻切片也可以用石蜡切片检测的抗原，用石蜡切片检测的染色效果要比冰冻切片好一些。 2、从研究目的来看。石蜡切片对组织细胞的定位很准确，而长期冻存组织的冰冻切片可能因冰晶的形成破坏组织细胞形 态的结构，并造成抗原的弥散，从而定位不准确。 3、从抗原的保真性来看。冰冻切片对抗原的保真很好，而石蜡切片在组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等过程 中可能会对抗原的性质造成影响。 4、从操作步骤的繁琐程度看。染色过程冰冻切片简单，而石蜡切片要求脱蜡入水、抗原修复等过程，比较繁琐。 5、总之，石蜡切片对标本的长期保存较合适，且组织细胞形态结构保持好；而冰冻切片适合对新鲜组织的制片，然后立 即固定、染色效果较好，且免疫荧光中可以相对避免石蜡自发荧光的干扰。 冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。 编辑本段冰冻切片的应用

石蜡切片、HE、免疫组化步骤

石蜡切片、HE、免疫组化实验 一：取材及石蜡切片的制作（本次取材为小肠、膀胱、子宫、宫颈） ①取材：小鼠脱颈处死后，应立即找到自己所需的组织器官，用一张滤纸将所需器官放在其上（可以加一些生理盐水在上面，防止干了），修去多余的脂肪、系膜等不要的组织，根据不同器官切成合适大小的形状（如小肠应切成1cm长度的长柱形）。将切好的组织装于冻存管中，加入4%的PFA（PFA的作用是保护蛋白，防止蛋白降解）固定过夜（固定时间不能超过24h，如果24h后不能完成脱水工作，可以先50%、70%酒精脱水后，置于4℃冰箱保存。） ①脱水（目的是为了使组织从水相置换到有机相）（根据不同的组织，脱水时间不同）：将PFA中的组织取出，放入组织盒（组织盒子应尽量选择小格子，防止组织脱水过程中掉出来），一个组织盒可以放4~8个组织小块，切一张与格子大小合适的纸条一并装入，做好标签，防止后期辨认不出具体组织（只能用铅笔写，中性笔会被酒精脱去）。使用自动脱水机进行脱水，设定程序为：酒精50%、70%、80%、90%（各20min）、无水乙醇（30min/次，两次）、酒精二甲苯混合物（1：1）20min、二甲苯20min（两次）、二甲苯石蜡混合物（1：1）30min、石蜡①1h；脱水结束后，取出组织盒，置于石蜡①中1h（石蜡应提前融化，且不能凝固，放在70℃烘箱中）。 ①包埋：用4X6cm的小纸条根据小木块形状，叠成盒子（盒子最好四边叠平，不要左右不平，便于放融化的蜡进去后能得到比较好的形状，最好不要漏），取一个盒子，将融化的石蜡①倒入，在其快要凝固的时候，将组织按照所需的形状，摆正（如小肠切成的小柱子应立起来，便于后面切片的时候，可以切到所需的形状），再用做好标记的长纸条贴着盒子壁固定（为了包埋后识别组织，且不能将纸条放在蜡块中央，后期不好取出，会损坏刀片），倒蜡之前，可以将盒子放在铁皮或小铁块上（能够让石蜡更快凝固。），每次用镊子拿组织或摆正组织之前，先烧一下（能够更好摆正组织块，可以随时调整组织位置）。包埋过夜。 ①切片：将包埋好的蜡块取出，置于小木块上，用刀修成梯形（包埋时组织所在的底面现在变成正面，主要修这一面，蜡块厚的一面用烧过的刀块烫平，贴在小木块上，贴紧底面后，用刀片烫一下四边，使蜡块完全固定在小木块上，防止切片时掉落）（组织蜡块的梯形上下边一定要平行，梯形不用太大，也不能太

冰冻切片与石蜡切片的区别

1．冰冻切片是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。 冰冻时，组织中水份易形成冰晶，往往影响抗原定位。一般认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重。因此，应尽量降低冰晶的数量。Fish认为冰冻开始时，冰晶成核率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-33。C,从-30。C降至-43。C之间，成核率急剧增加达1018，然后再减慢。基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。 （1）速冻，使组织温度骤降，缩短从-33。C43。C的时间，减少冰晶的形成。其方法有二： ①干冰-丙酮（酒精）法：将150-200ml丙酮（酒精）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不再昌泡时，温度可达-70℃C，用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。将组织（大小为1cm××）投入异戊烷内速冻30-60s后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80℃低温冰箱内贮存。 ②液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。 （2）将组织置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。 影响冰冻切片的因素较多，因此，技术难度较大，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。目前冰冻切片机有两类： ①恒慢冰冻切片机（Cryastat）：为较理想的冰冻切片机，型号很多，但其基本结构是将切片机置于-30℃C低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至2-4μm，完全能满足免疫组织化学标记要求。切片时，低温室内温度以-15℃～18℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。 ②开放式冰冻切片机：包括半导体致冷切片机和甲醇致冷切片以及老式的CO2、氯乙烷等冷冻切片机。切片时暴露空气中，温度不易控制，切片技术难度大，在高温季节，切片更加困难，且切片厚8～15μm，不易连续切片，但其优点是价廉，国内有生产。 冰冻切片后如不染色，必须吹干，贮存低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存冰箱保存。 2．石蜡切片其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准确。用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同：①脱水、透明等过程应在4℃。C下进行，以尽量减少组织抗原的损失。②组织块大小应限于2cm××，使组织充分脱水、透明、浸蜡。③浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下，以溶点低的软蜡最好（即低温石蜡包埋）。 组织块脱水、透明、浸蜡时间参考表1-3： 表1-3 组织块处理时间表 1 70%乙醇4℃3～4h 2 80%乙醇4℃3～4h 3 90%乙醇4℃2～3h 4 95%乙醇Ⅰ4℃2～3h 5 95%乙醇Ⅱ4℃1～2h

2021年石蜡切片和冷冻切片之欧阳学文创编

石蜡切片和冷冻切片——傻傻分不清楚系列 欧阳光明（2021.03.07） 在组织实验中，组织切片和冷冻切片是最常见的两种切片方法，两种优缺点明显，在实验的应用上也大有不同。而两个实验的相同点都是应用免疫学基本原理——即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内蛋白质，对其进行定位、定性及相对定量的研究。 一、石蜡切片 组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。 1、固定：将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。凝固组 织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。同时能使组织硬化，有利于切片的进行。 2、脱水：为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。 3、透明：常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。纯酒精不

能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。材料块在透明剂浸渍过程称透明。 4、浸蜡： 先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。 5、包埋：以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。 6、切片：切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。通常切片厚度为5微米，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。 7、贴片与烤片：将水浴中展片捞至玻片上铺正，然后将载玻片放入37℃温箱中干燥。 8、切片脱蜡及水化：干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。 9、染色： 经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。实验操作简单。 免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。 二、冰冻切片： 冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法。制作过程较石蜡切片快捷、简便，因多应用

组织切片石蜡切片过程

石蜡切片过程 一、石蜡包埋: 1.脱水：组织水洗后便可酒精脱水，70% →80% →90% →95%→ 100%酒精（无水乙醇）→100%酒精，各级酒精脱水时间30-45 min。（注意：80%酒精内组织可留之较久，当天如果来不及做完就可以暂时保存一晚上，次日再继续做下去。70%的酒精可作为更久的保存剂。） 2.透蜡：脱水后组织：50%酒精+50%二甲苯30 - 45min. 二甲苯（组织透明即可停止) 15min. 50%二甲苯+50%石蜡20-30min. 纯石蜡1 45min. 纯石蜡2 45min.（透腊之前做好准备工作：准备腊杯，烘箱温度保持55—60℃左右，使石腊熔化，温度不宜过高，以免使组织发脆。） 3.包埋： a.折好纸盒，准备小镊子、酒精灯、解剖针、冷水等。 b.用温热吸管吸取石蜡注入纸盒。等待底稍微凝固，温镊子夹住样品放入盒子中央，面朝底(可以将蜡一次倒入纸盒，然后待蜡表面起膜后，用温镊子夹住样品放入蜡中，待冷却即可，整个操作过程中，切勿让蜡中起气泡)。 c.两手拿着两端，入冷水一半，吹气，使表面石蜡形成移较厚腊层，然后急速全部进入冷水中3分钟。 d.修正蜡块（上下两个面一定要平行并且光滑） e.固着蜡块

二、切片 1.切片（切片时，可以在刀片以及刀片周围涂上一点甘油） 2.贴片烤片（甘油蛋白=1/2甘油+1/2鸡蛋清）（在贴片时，用细吸管取一点点甘油蛋白（越少越好）于载玻片上，然后用手抹匀，手一定要干净。将切片放在载玻片（光亮面朝向下），然后滴几滴冷水使切片悬于水上。接着将载玻片放在37℃上烘烤。 常见问题分析： 1.切片分离不能形成蜡带：?室温过低，蜡过硬。 2.蜡带弯曲：?蜡块口下面不平行，或蜡块不与刀刃平行所致。 3.切片厚薄不一:?切片刀或蜡块未固定紧。 4.切成片后，组织与蜡块脱离：?脱水不干净等。 5.蜡片易粘在切片上或蜡片萎缩：?室温太高或蜡太软或刀的角度 太小。 6.切片破裂：?浸蜡不足或浸蜡温度过高，或在脱水剂、透明剂中 时间过长，引起组织发脆或有杂质，材料脱钙不完全，此种无法补救。 7.蜡片上卷，切过刀口即破裂：?刀口太钝或沾有石蜡或刀的角 度过大或蜡太硬。 *：包埋时，时间长会使标本变质，过短则石蜡不能透进标本。石蜡包埋过程中，注意控制温度保持在58-60℃，石蜡不能融化。

石蜡切片与冰冻切片

石蜡切片与冰冻切片 一、组织和细胞标本类型： （一）组织标本类： 1、石蜡切片：组织形态保存好 2、冰冻切片：抗原性保存好 （二）细胞标本类： 1、组织印片 2、细胞培养片（细胞爬片） 3、细胞涂片 二、组织取材 1、脑组织和神经组织应采用灌注固定后，再进行后固定。 2、组织取材注意事项： （1）标本新鲜：组织要求离体后30min~2h内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。 （2）注意防止人为因素的影响刀和剪要快，避免挤压。 （3）组织块的大小厚为0.1~0.3cm，大小可根据需要而定。 三、活细胞标本的制备法 （1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。 （2）将细胞直接培养在盖玻片上。 （3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。 四、石蜡切片的制备 1、由于石蜡不溶于水和醇类试剂，只溶解在二甲苯类试剂中。因而，组织经固定和水洗后含大量水分，需用乙醇类试剂进行脱水，水脱完后，组织内含有大量的乙醇，还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换，最后经浸蜡，组织细胞内被大量石蜡支称，才使组织能用于石蜡切片。 2、小动物组织脱水、透明和浸蜡时间 75%乙醇30min，85%乙醇30min，95%乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h，Ⅲ过夜或2h；无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min；二甲苯Ⅰ15min，Ⅱ10min，Ⅲ10min；石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1~2h。 五、冰冻切片的保存和使用 1、冰冻切片固定后-80℃保存备用 2 、冰冻切片从-80℃取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。

石蜡切片步骤

石蜡切片制作 大致步骤：取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片和粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。 1、取材 植物材料选择时必须尽可能不损伤植物体或所需要的部分。 取材必须新鲜，尽可能割取所需要的组织块，并随即投入固定液。 取材时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。 切取的材料应该小而薄，便于固定剂迅速渗入内部。一般厚度不超过2mm，大小不超过5*5mm2。 2、固定 用适当的化学药液—固定液浸渍切成小块的新鲜材料，迅速凝固或沉淀细胞和组织中的物质成分、终止细胞的一切代谢过程、防止细胞自溶或组织变化，尽可能保持其活体时的结构。 固定液的选用：FAA固定液 FAA固定液配制：福尔马林（38%甲醛）5 ml 冰醋酸 5 ml 70%酒精 90 ml 5 ml甘油（丙三醇） 固定时间根据材料块的大小及松密程度而定。 3、洗涤与脱水 固定后的组织材料需要除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。多数用流水冲洗：使用含有苦味酸的固定液固定的则需要用酒精多次浸洗；如果组织经酒精或酒精混合液固定，则不必洗涤，可直接进行脱水。 酒精为常用的脱水剂，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行，通常从30%或50%酒精开始，经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1-数小时，如不能及时进行脱水，材料可以放在70%酒精中保存，因高浓度酒精易使组织收缩硬化。 4、透明 选用二甲苯为酒精和石蜡的浸媒液，替换出组织内的酒精。通常组织先经过纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1-2小时，再转入纯透明剂中浸渍。时间根据材料块大小而定。 5、浸蜡与包埋 用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。通常把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1-2小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进行，以利于石蜡浸入组织内。浸蜡后的组织材料块放在装有蜡液的容器中（摆好在蜡中的位置），待蜡液表层凝固即迅速放入冷水中冷却，即做成含有组织块的蜡块。容器可用光亮且厚的纸折叠成纸盒或金属包埋框盒。如果包埋的组织块数量多，应进行编号，以免差错。石蜡熔化后应在蜡箱内过滤后使用，以免因含有杂质而影响切片质量，且可能损伤切片刀。 6、切片 包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上，夹在轮转式切片机的蜡块钳内，使蜡块切面与切片刀刃平行，旋紧。切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。通常切片厚度为 4-7微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。 7、贴片与烤片

HE石蜡切片步骤-使用

石蜡切片制作 一、木精-伊红对染法 ——paraffin section 一、器材及试剂： 1. 器材： 切片刀，切片机，恒温箱，蜡杯，酒精灯，解剖刀，解剖剪，解剖盘，培养皿，镊子，单面刀片，毛笔，包埋盒，染色缸，盖玻片，载玻片，玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温度计，脸盆，水浴锅。 切片机，切片刀，温台，恒温箱，解剖刀，镊子，剪刀，解剖针，单面刀片，小台木，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，烧杯，水盆，熔蜡炉，蜡杯。 2．试剂： 中性福尔马林固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。 卡诺（Carnoy）固定液，埃利希木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸乙醇液，各级酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，中性树胶。 3. 材料： 鼠肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织、大豆或小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆的根、茎、叶等。 二、实验原理： 石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。木素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色，细胞核被木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。 三、试剂配法： 1．中性甲醛固定液： 甲醛（37%-40%，市售，本所购买即为此浓度） 100mL 磷酸氢二钠 6.5 磷酸二氢钾（钠） 4g

双蒸水 900mL 2．木精、伊红染色液为碧云天产品 3．1%盐酸乙醇液 盐酸 1份 70%酒精 100份 四、实验步骤： 1．取材 颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或其他组织）。 切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2－3mm厚。 注意事项： （1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 （2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。 2．固定 将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中 固定，固定30－50min。（4度过夜） 注意事项： （1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化 学变化，失去固定作用。 （2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合 太早，固定时就没有作用了。 （3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间 应更换1-2次新液。 （4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材 料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签 上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。 3. 洗涤 材料经固定后,流水冲洗，数小时或过夜。 4. 脱水

石蜡切片的制作过程(精)

石蜡切片的制作 目的要求:了解生物制片的基本原理和方法;了解石蜡切片制作的基本过程;学会制作石蜡切片。 一、生物制片的基本原理 (一生物制片的目的与发展概况 生物制片是研究生物有机体微观结构的基础方法,其目的是提供在显微镜下以适度的样品,有效地对其进行形态和功能观察研究。 (二生物制片的方法 当我们研究生物体的组织或细胞时,除了某些生物体可用相差显微镜或偏光显微镜等方法达到观察目的外,其余大部分生物体,因为组织较厚,光线不易透过内部等关系而达不到观察的要求,为了达到此目的,就必须将生物体的组织切成薄切片或不切片,经过一系列处理,使光线易于透过,即可进行观察。因此,根据标本的制作方法分为切片法和非切片法两种。这些方法,各有优缺点,应该适当的配合使用,才能获得比较理想的结果。 1.切片法 (1切片法的种类 切片法就是利用锐利的刀具,将器官组织或幼小个体分割成许多极薄的薄片,而制成切片标本的一种方法。切片法在切成薄片以前必须设法使组织内渗透某种支持物质。使组织保持一定的硬度,然后利用切片机进行切片。根据所用支持物质的不同切片法又可分为石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、炭蜡切片法等类型。现分述如下: ⅰ.石蜡切片法

石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法,因此用得最多,它有很多优点:比较省时间,容易操作,可切成极薄的切片(4um 以下,能制作连续切片,组织块可包埋在石蜡中永久保存。缺点是只能用于较小的组织块,较大的组织块不易切好,容易破碎,组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。制片时间太长。 ⅱ.火棉胶切片法 火棉胶切片法是以火棉胶为支持剂进行切片的方法。此法的优点是包埋过程中不用二甲苯及石蜡,不经高温,可避免组织收缩及变脆,适于精细材料(如脑的切片,也引火棉胶有韧性切片不知有折卷或破裂,适宜于大块组织及多空洞的组织(脑、眼球,硬度较高的组织(骨、肌腱。缺点:手续麻烦、费时间,切片不能切薄,起码在10um以上,不能作连续切片,因此,在生物制片技术上已经不经常采用。 ⅲ.冰冻切片法 冰冻切片法是利用液体二氧化碳或其它药剂(如氯乙烷在变成气体时吸收大量的热使组织迅速结成冰块而后再进行切片的方法。目前国内外用半导体致冷调节器来代替二氧化碳的冰冻,冷冻速度更快更为方便。 冰冻切片法的优点是较前两种方法简便,组织不经脱水、透明、包埋等手续即可切片,因而可节省很多时间,十分钟左右即能制成切片。常用于临床病理手术诊断,银材料不经溶媒处理就可直接进行切片,材料不受试剂的激烈刺激及温度影响,所以组织没有显著的收缩,细胞形态不致有大的改变,也引冰冻切片不需有机溶剂处理,所以能保存脂肪、类脂等成分,所以冰冻切片法常用于组织化学,尤其是神经组织,临床病理学等方面的研究。 新鲜的组织或已经固定的组织,经短时间处理后即可进行切片。用任何固定及处理的材料均适合冰冻切片,但一般的经验用福尔马林固定的材料最适合冰冻切片,而用酒精、甘油保存的材料必须充分水洗后才易于冰冻,否则不易切成完整的切片

冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处

1、 冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法，正在受到青睐。 编辑本段冰冻切片的应用 （1）在手术进行中，突然发现病人的病变与原诊断，原定手术方案不相符合，或者怀疑时，需要病理确定。 （2）了解淋巴结内是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其它的治疗措施。 （3）对于已确定为恶性肿瘤的患者，则需要了解其手术范围是否足够，上下切缘是否有残存的肿瘤组织。 （4）在做剖腹探查时所发现的肿块或者异样的组织。 （5）显示组织中的脂肪和脂类物质，这常见于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研组织等。 （6）某些酶的显示如ATP酶，琥珀酸脱氢酶等。 （7）神经病理学技术中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal 氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。 （8）对某些物质所进行的免疫荧光的研究。 编辑本段冰冻切片的制作方法

低温恒冷箱冷冻切片制作法 以Shandon As 620 E型恒温箱冷冻切片机为例，该机的箱面上有电子控制板，装有即时冷冻键和除霜键，启动即时冷冻键，机器马上进行工作状态，并可持续10mins。启动即时除霜键，可将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉，并可持续15mins。有照明键一个，启动该键可照明工作间，有利工作及观察组织的冰冻状况。配有消毒键一个，当进行一周的工作或者一天的工作后，启动该键，可对工作间进行消毒。当每天工作完毕时，可启动密锁键，锁住工作间。除此之外，箱面的左边有四个按键，两个为快速自动进退键，两个为微小进退键，还有一个手动旋钮，调节修组织块时的进退。 冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左右，冷冻箱的中间为一台切片机，工作间的温度在0-30℃间可任意调节，并在箱面上的荧屏显示出来。 操作方法及步骤 ①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。 ②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。 ③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 ④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。 ⑤调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。 ⑥应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。 冰冻切片时的注意事项

免疫组化HE染色步骤

免疫组化H E染色步骤 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020

骨组织石蜡切片制作 步骤： 1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲 液内固定12—24h。 2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h. 3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。 4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。 5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I1小时，石蜡II1小时。 6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。 7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。 免疫组化检测 步骤： 1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min二甲苯1 （10min）二甲苯2（10min）。 2.水化：100%酒精1（2min）100%酒精（2min）95%酒精（2min） 80%酒精（2min）70%酒精(2min)。 冲洗3次，每次5min.。

4.抗原修复：将组织片置的柠檬酸缓冲液（）中煮沸15min,自然冷 却至室温。 冲洗3次，每次5min。 6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活 性。 冲洗3次，每次5min。 8.滴加1抗（GFP1：100稀释,4℃过夜） 冲洗3次，每次5min。 10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min,PBS冲洗 3次，每次5min。 11.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min,PBS冲洗 3次，每次5min。 显色5min。 13.自来水冲洗10min。 14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。 15.自来水冲洗10min。 16.常规脱水，透明，封片，镜检。 组织切片HE染色 步骤 1、将烘烤后的组织切片依次侵入二甲苯1，二甲苯II进行脱蜡各 10min。 2、脱蜡后的组织切片依次浸入无水乙醇I、无水乙醇II、95%酒精、80%酒精、70%酒精中各2min，PBS冲洗2次，每次5min。

石蜡切片

石蜡切片制作 一、苏木精-伊红对染法 一、器材及试剂： 1.器材： 切片刀，切片机，恒温箱，蜡杯，酒精灯，解剖刀，解剖剪，解剖盘，培养皿，镊子，单面刀片，毛笔，包埋盒，染色缸，盖玻片，载玻片，玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温度计，脸盆，水浴锅。 切片机，切片刀，温台，恒温箱，解剖刀，镊子，剪刀，解剖针，单面刀片，小台木，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，烧杯，水盆，熔蜡炉，蜡杯。 2．试剂： 中性福尔马林固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、苏木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。 卡诺（Carnoy）固定液，埃利希苏木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸乙醇液，各级酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。 3.材料： 鼠肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织、大豆或小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆的根、茎、叶等。 二、实验原理： 石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木素与伊红对比染色法（简称H.E.对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。 三、试剂配法： 1．中性甲醛固定液： 甲醛（37%-40%，市售，本所购买即为此浓度）100mL 磷酸氢二钠 6.5

磷酸二氢钾（钠）4g 双蒸水900mL 2．苏木精、伊红染色液为碧云天产品 3．1%盐酸乙醇液 盐酸1份 70%酒精100份 4．甘油蛋白贴片剂： 蛋白50ml 甘油50ml 水杨酸钠（防腐剂）1g 配制时将鸡蛋一个打破入碗或杯中，去蛋黄留下蛋白，用玻棒调打成雪花状泡沫，然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中，经数小时或一夜，即可滤出透明蛋白液。此时在其中再加等量的甘油，稍稍振摇使两者混合。最后加入防腐剂（水杨酸钠）作防腐用。可保存几个月。 四、实验步骤： 1．取材 颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或其他组织）。 切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10mm×2mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2－3mm厚。 注意事项： （1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 （2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。2．固定 将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定，固定30－50min。 注意事项： （1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。 （2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。

HE石蜡切片步骤,免疫组化步骤.

HE染色 1.取材 切取的组织块不宜太大,以利于固定剂穿透,通常以6mm×6mm×5mm为宜。 注意事项: (1取材动作要迅速,不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。 (2切片材料应根据需要观察的部位进行选,尽可能不要损伤所需要的部分。 2.固定 将切好的组织用生理盐水组织洗3次,立即投入10%中性福尔马林固定液或4%多聚甲醛中固定,固定36小时。 注意事项: (1一般固定液,都以新配为好,配好后应贮存在阴凉处,不宜放在日光下,以免引起化学变化,失去固定作用。 (2有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用,一定要在使用前才混合,如果混合太早,固定时就没有作用了。 (3固定材料时,固定液必须充足,一般为材料块的20~30倍,有些水分多的材料,中间应更换1-2次新液。 (4材料固定完毕后,保存于严密紧塞或加盖的容器里,同时在容器外上标签,并随同材料在溶液中投入相应的标签,以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字,应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。 脱钙72小时中间不换液是样本30倍中杉金桥(进口脱钙液

镊子触质粒由硬变韧性为准。 (美:固定3-5天根据组织大小确定天数,越大固定时间越长。 3. 洗涤 材料经固定后,PBS或双蒸水冲洗约3小时。(20,30,30,60 (美:流水冲洗约4小时 4. 脱水 材料依次经80%、90%、100%、100%各级乙醇溶液脱水,各30min 注意事项: (1脱水必须在有盖的玻璃品中进行,防止吸收空气中的水分。 (2在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料以免损坏,可用吸管吸出器皿中的脱水剂,再用吸水吸尽器皿内剩余液,然后于皿中加入高一级脱水剂。 (3在低浓度酒精中,每级停留不宜太长,否则易使组织变软,助长材料的解体。 (4在高浓度或纯酒精中,每级停留的时间也不宜太长,否则会使组织变脆,影响切片。 (5如需过夜,应停留在80%酒精中。 (6脱水必须彻底,否则不易透明,甚至使透明剂内出现白色混浊现象 (美:80%的酒精×2小时 95%的酒精×2小时 100%的酒精×2小时×2

石蜡切片步骤

石蜡切片基本步骤 （一）取材和固定 根据实验目的选择材料。将整个虫体或虫体的内部器官（如肠道、马氏管、唾液腺等）取出后，立即投入固定液。 取材大小：0.5cm×0.5 cm×0.2或者1.0 cm×1.0 cm×0.2，厚度不宜超过3mm。 固定液：2.5%的戊二醛固定液，Bouin氏液，10%甲醛等。 固定时间：4oC固定24小时。 注意事项： 取材：1．勿使组织块受挤压切取组织块所用刀、剪要锋利，切割时不可来回切割。夹取组织时，镊子要轻，切勿挤压，以免损伤组织。取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。 2.选好组织块的切面应熟悉器官组织的组成，并根据观察目的来确定纵切或横切。 3．保持材料的清洁组织块上如有血液、污物、粘液、食物等，先用生理盐水冲洗干净，再入固定液。 4．切除（清除）不需要的部分特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，以免影响以后的程序和观察。 固定：1．材料新鲜取出组织后须立即固定。否则时间相隔过久，体积就要收缩变形或发生自溶现象。 2．抽气生物组织常有气体的存在，使材料不能沉入固定液中，抽气使得固定液有效渗入。真空泵抽气或者用空针管抽气。昆虫整体固定，固定前用解剖针刺数个小孔，以利用固定液渗透。 3．固定剂用量一般为组织体积的10~20倍。勿使组织贴于瓶底或瓶壁，以免影响固定剂的渗入。 4．避免阳光尽可能避免接触阳光以免失去固定作用。 5．加速固定轻轻摇动盛器使组织移动有利于固定液渗入，对长期固定的标本可经常更换固定液。

（二）洗涤 2.5%戊二醛固定液固定的组织：0.2M, pH7.2磷酸缓冲液漂洗三次，每次10min Bouin氏固定液固定的组织：直接入70%酒精更换数次即可脱水，注意苦味酸。 甲醛固定的组织：直接投入50%或70%酒精脱水，不经水洗。但如果在甲醛中时间过长，则仍应当用流水冲洗。 陈旧性标本和混合性固定液应及时洗涤，有利于脱水、切片和染色。否则会影响以后的染色效果。 （三）脱水与透明 漂洗后即入酒精脱水，经50%，70%，80%，90%，95%，100%酒精脱水，其中95%，100%酒精需重复两次。每级10min。 脱水后，入1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯，每次约10min，至组织透明为止。 注意： 1. 一般经水洗的材料脱水可从35%开始，柔弱的材料从15%开始，若用酒精洗涤，则可直接移入50%或70%酒精中继续脱水。 2. 每级脱水时间，依照材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。动物组织每级10~30min。 3. 脱水应彻底，否则与二甲苯混合后混浊，必须倒回重脱水且效果不好；如需过夜，则停留在70%酒精中。 （四）透蜡 透明后，先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍3小时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍6小时左右，直至用石蜡完全置换了组织块中的二甲苯，浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右（60°C）的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。便于今后的包理与切片。