sds page凝胶电泳sop
原理：
聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它具有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。
而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS
胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，于连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。
1.溶液配制
1.1.30%（W/V）丙烯酰胺+0.8%双丙烯酰胺
用天平称取15g丙烯酰胺、0.4g双丙烯酰胺，加入50ml 去离子水溶解混匀。
1.2.10%（W/V）丙烯酰胺+2.5%双丙烯酰胺
用天平称取5g丙烯酰胺、1.25g双丙烯酰胺，加入50ml 去离子水溶解混匀。
1.3.10% 十二烷基硫酸钠溶液
用天平称取1g十二烷基硫酸钠（SDS），加10ml去离子水溶解混匀，室
温保存。
1.4.10% 过硫酸铵溶液
用天平称取1 g过硫酸铵（APS），加10ml去离子水溶解混匀，分装Eppendof管冰冻保存。
1.5.四甲基乙二胺（TEMED）液
1.6.0.4% 溴酚兰指示液
用天平称取0.4g溴酚兰（BPB），加10ml去离子水溶解混匀，室温保存。
1.7.分离胶缓冲液（1.5M Tris-HCl，pH=8.8）
用天平称取36.3g三羟甲基氨基甲烷（Tris），溶于160ml去离子水中，用HCl调pH值至8.8~8.9（先加5ml浓HCl，再逐滴加1M HCl调节），用去离子水定容至200ml，置棕色瓶中4℃保存。
1.8.浓缩胶缓冲液（0.5M Tris-HCl，pH=6.8）
用天平称取12.1g Tris，溶于160ml去离子水中，用HCl调pH值至6.7~6.8（先加8ml浓HCl，再逐滴加1M HCl调节），用去离子水定容至200ml，置棕色瓶中4℃保存。
1.9.电泳缓冲液
用天平称取15.1g Tris，72.1g甘氨酸，5g SDS，再加去离子水定容至500ml。
1.10.染色剂
用天平称取1.25 g 考马斯亮蓝，加入250 ml甲醇、50 ml冰醋酸，搅拌溶解后加去离子水定容至500ml。过滤后待用。
1.11.脱色液
用天平称取75 ml冰醋酸、50 ml 甲醇，加去离子水定容至1000 ml ，混匀待用。
1.1
2.样品处理液
用天平称取4 g甘油、0.8 g 十二烷基硫酸钠溶液(SDS) 加入5 ml 0.5 N
Tris(pH=6.8)，混匀后分装冷冻保存。
1.13.电泳标准样
1.13.1.buffer ：取120 ul 0.5M tris 、100 ul 甘油、200 ul 10% SDS 、0.4% BPB 加
入480ul 去离子水，混匀3 min。
1.13.
2.稀释液：取275 ul buffer +25 ulβ-硫基乙醇混匀。
1.13.3.稀释液：标准样品=20:1 ，混匀95℃水浴5min，分装小管。
2.操作方法
2.1.样品前处理：成品加入40倍的0.5M冰乙酸，震荡溶解备用。
2.2.电泳样品的制备：取样品，使最终蛋白浓度为1 mg/ml ，加入200 ul 样品
处理液、50 ul 2 M Tris 、40 ul 0.4%BPB、20 ul β-硫基乙醇溶液变蓝则补样品处理液至1 ml,否则加2 M Tris直至溶液变蓝后补样品处理液使总溶液为1 ml。95℃水浴6 min。
2.3.将电泳专用长短玻璃板用无水乙醇擦拭干净（注意不要留下纤维），组装待
用。
2.4.凝胶制备
2.4.1.分离胶的制备
试剂名称体积
30%（W/V）丙烯酰胺+0.8%双丙烯酰胺3ml
分离胶缓冲液3ml
10% SDS 0.12ml
10 % APS 0.12ml
去离子水 5.75 ml
TEMED 0.06 ml
①将上述试剂在小烧杯中依次混合。
②一旦加入TEMED后，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物，使混匀
后沿长玻璃板内侧缝隙加入，留出灌注积层胶所需空间（样品梳齿长加2cm）。
③注意胶面要平整，避免气泡。
2.4.2.浓缩胶的制备
试剂名称体积
10%（W/V）丙烯酰胺+2.5%双丙烯酰胺750 ul
浓缩胶缓冲液750 ul
10% SDS 30 ul
10 % APS 30 ul
去离子水 1.4 ml
TEMED 26 ul
①将上述试剂在小烧杯中依次混匀。
②倒入模具中分离胶上，插入干净的样品梳（注意避免混入气泡），让其在
室温下凝聚。
2.5.上样
2.5.1.将玻璃板移动组装至电泳槽，取50ml电泳缓冲液10倍稀释后，倒入电泳
槽。
2.5.2.双手缓慢小心地取出样品梳，即可看到界线清晰的加样孔。
2.5.
3.用微量进样器吸取10ul电泳标准样、20ul已处理好电泳样品，按预定顺
序加入凹型凝胶加样孔中底部（注意校正胶条和加样时动作要轻缓，针头不要刺伤胶面）。
2.6.电泳
2.6.1.用导线对应正负电极相连。
2.6.2.当跑一块胶板的时候，调节电流为12 mA，两块胶板则调为24 mA，以
此类推。
2.6.
3.电泳跑胶至接近分离胶底部3~5mm时（注意不要使染料逸出到下槽电泳
缓冲液中），调节电压至零，关闭电源。
2.7.染色
电泳完毕后，取出玻璃板。在去离子水中小心从浓缩胶一端轻轻撬开玻璃板（注意防止凝胶破裂）。用去离子水水将凝胶冲洗至一塑料盒中，尽可能倒去水，加入考马斯亮兰染色液至浸没胶面，并除去凝胶下的气泡（否则脱色后有花纹），固定染色约20min。
2.8.脱色
弃去染色液，加脱色液浸没胶面，置摇床上脱色，3~4次（15~20min/次），直到凝胶上背景脱净为止，记录结果。
结果判断