RNA提取-OMEGA

OMEGA E.Z.N.A. TM RNA 提取试剂盒操作步骤

1.弃培养基，加入1ml RNA-Slov regent 裂解细胞，将裂解液转移到一干净的1.5ml EP管中，

室温孵育2-3min。

2.每1ml RNA-Slov regent中加入200μl氯仿，涡旋混匀15s，冰上孵育10min。

3.12,000×g，4 ℃，离心15min。

4.吸取上层水相并加入1/3体积的无水乙醇，涡旋混匀15s。

5.将HiBind RNA Spin柱子套在2ml收集管中，该柱子一次性最多可以容纳700μl的溶液。

将上述溶液（包括沉淀）转移至柱子上，室温下，10,000×g离心1min，以完全滤过溶液。

如果还有溶液残留，请延长时间至溶液完全滤过柱子，去弃滤过液。继续将剩余的裂解液转移至柱子，离心弃去滤出液。

Tip：如果在离心后，柱子发生堵塞，可延长离心时间或提高离心速率至裂解液完全流出柱子。柱子发生堵塞的原因有以下几种原因：1.样品起始量太多；2.裂解不够充分；

建议：1.减小样品量，提高匀浆效率；2.裂解完后，用匀浆柱过滤裂解液。

6.将柱子放入一个新的2ml收集管中，加入300μl Wash Buffer I至柱子上，室温下，

10,000×g离心1min，去除滤过液；

7.将柱子放置于2ml收集管中，加入400μl RNA Wash Buffer I，室温下，10,000×g

离心1min，去除滤过液；

8.将柱子套回离心管，加入500μl RNA Wash Buffer II(已用无水乙醇稀释)，室温

下，10,000×g离心1min，弃去滤过液；

9.将柱子套回离心管，加入500μl RNA Wash Buffer II，室温下，10,000×g离心1min，

弃去滤过液。

10.将柱子套回空的收集管，室温下，14,000×g离心空柱2 min，以甩干柱子的基质。

11.将柱子转移至新的1.5ml的收集管中，加入30-50μl DEPC-水至柱子的膜中央。

放置2min。室温下，10,000×g离心1min。

注：如果RNA>50ug，第二次洗脱可能是必需的。

microRNA快速提取试剂盒

◆RNAmisi microRNA快速提取试剂盒◆目录号1105 ◆使用手册 ◆实验室使用，仅用于体外

RNAmisi microRNA快速提取试剂盒 目录号：1105 目录编号包装单位 110501 50次 适用范围： 适用于快速提取各种细胞组织miRNA和其它各种小RNA 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存50次 Lysis/Binding buffer 4°C避光50 ml 70%乙醇室温9ml RNase-free H2O 第一次使用前按说明加指定量乙醇 Wash Solution 1 室温12 ml 第一次使用前加入28ml无水乙醇 Wash Solution 2/3 室温10 ml 第一次使用前加入42ml无水乙醇 RNase-free H2O 室温10 ml 吸附柱RA和收集管室温50套 microRNA吸附柱MA 和收集管 室温50套本试剂盒按照指示储存6个月不影响使用效果。

储存事项 1.Wash Solution 1和Wash Solution 2/3加入无水乙醇后，可以在常温保存一个月， 如果要更长时间保存，请存放在4°C，但是使用前，应该先回复到室温。 2.Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接 不吸晶体，吸上清使用就可以。 3.运输在常温下进行，不影响使用效果。 4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及 时盖紧盖子。 产品介绍： 近年来对RNA干扰和调节性小RNA的广泛研究迫切需要一种能有效提取15-30核苷酸左右大小RNA（包括siRNA和miRNA）的试剂盒。但是传统的RNA提取方法如硅胶膜不能有效吸附回收，酚/胍抽提和乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子RNA。本试剂盒采用独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，强烈有机抽提去除蛋白和DNA，RNA包括微小分子RNA吸附于离心柱内特殊硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤,漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质进一步去除，最后低盐的洗脱液将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

RNA试剂盒提取步骤

常规植物样品总RNA小量抽提 1. 植物样品的研磨。 ?收集植物样品并尽快浸泡到液氮中以防止RNA 的降解。使用研钵、研磨棒和液氮将植物样品研磨成尽量细小的粉末。RNA 的产量取决于样品类型和研磨效果。 注：研磨后的植物粉末可直接保持于-70°C。 ?快速称取50-100mg 的研磨好的植物样品至1.5ml 预冷的离心管中。 注：在加入裂解液之前，不要让样品解冻。初次使用时，推荐先使用50mg，待取得理想结果后， 再酌情提高用量。 2. 立即加入500μlBuffer RL/β-ME混合液至样品中。立即于最高速度涡旋30-60 秒 充分打散样品，室温静置3-5 分钟让样品充分裂解。 注：使用前分装适量的Buffer RL，每1ml Buffer RL 加入20μl β-疏基乙醇(β-ME)或2M DTT。 若植物用量增加超过100mg，按比例增加Buffer RL/2-ME 的用量。 3. 室温下，14,000 x g 离心5 分钟。 4. 把gDNA 过滤柱装在2ml 收集管中。把第三步的上清液转移至gDNA过滤柱中。14,000 x g 离心1 分钟。 5. 弃去gDNA 过滤柱。加入0.5倍体积无水乙醇(~250μl)至滤液中。用移液枪吸打3-5次混匀。 6. 把HiPure RNA Mini Column 装在2ml 收集管中。转移第5 步的混合液至RNA柱子中。10,000 x g 离心30-60 秒。 7. (可选)这一步可插入DNase 进行膜上消化。(请另外订购DNase On Column Kit 进化 膜上DNase 消化)。 8. 倒弃滤液，把柱子装在收集管中。加入500μl Buffer RW1 至柱子中。10,000 x g 离心30-60 秒。9. 倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入600μl Buffer RW2 (已用乙醇稀释)至柱子中。10,000 ×g 离心30-60 秒。 注：在使用Buffer RW2 之前，必须按瓶子标签指示用无水乙醇进行稀释。 10. 倒弃滤液，把柱子重新装回收集管中。加入600μl Buffer RW2(已用乙醇稀释)至柱 子中。10,000×g 离心30-60 秒。 11. 倒弃滤液，把柱子套回空的收集管。10,000 ×g 离心空柱2 分钟甩干柱子。 12. 将柱子转移至新的1.5ml 离心管。加入30-50μl DEPC 水至柱子的膜中央。静置2 分钟。10,000 ×g 离心1 分钟。 13. (可选)再加入30-50μl DEPC 水至柱子的膜中央。静置2 分钟。10,000 ×g 离心1 分钟。 注：HiPure RNA Column 最小的洗脱体积是30μl，小于30μl 会导致RNA 的洗脱效率下降。如果RNA 产量超过30μg，推荐按第13 步进行第二次洗脱。 14. 弃去柱子，把RNA 保存于-80oC。

总RNA提取试剂盒使用说明

总RNA提取试剂盒使用说明 货号：R1200 规格：50T/100T 产品内容： 试剂盒组成R1200-50R1200-100保存有效期 裂解液50ml100ml2-8℃一年 漂洗液15ml15ml×2RT一年 洗柱液50ml50ml×2RT一年RNase free ddH2O15ml15ml×2RT一年RNase free吸附柱50个100个RT一年RNase free收集管(2ml)50个100个RT一年 操作步骤： 1.样品处理： a.植物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织在液氮中研磨，把粉末加入到1ml裂解液中混匀。 b.动物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液，用组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。 c.贴壁细胞：直接在培养板中加入裂解液裂解细胞，每106细胞加1ml裂解液。用取样器吹打混匀。 d.细胞悬液：离心收集细胞。每106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml裂解液混匀。

e.血液处理：取0.2-1ml新鲜血液加3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10000rpm离心1分钟。弃上清，若沉淀含有红细胞，可加入2倍体积红细胞裂解液重复裂解步骤。离心后沉淀加入1ml裂解液混匀。 2.将处理后的样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。 3.向匀浆样品中加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3-5分钟。 4.2-8℃12000rpm离心10分钟。RNA主要在上层无色的水相中，把水相转移到新管中，不要吸到沉淀。 5.吸附柱前处理：在吸附柱中加入500ul洗柱液，室温放置2分钟，2-8℃12,000rpm 离心2min，弃废液。 6.第4步收集的上清中加入200ul无水乙醇混匀，加入吸附柱静置2分钟，2-8℃12000rpm 离心2min，弃废液。 7.向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，2-8℃12,000rpm 离心2min，弃废液。 8.向吸附柱中加入600ul漂洗液，2-8℃12,000rpm离心2min，弃废液。 9.12000rpm离心2min，弃掉收集管，将吸附柱置于室温放置数分钟将吸附柱中残余的漂洗液去除。 10.将吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50-100ul RNase free ddH2O，室温放置5min，12000rpm室温离心2min即得 到RNA。 注意事项： 1，所有相关器皿耗材都应为RNase-free产品，操作过程要小心，带口罩、手套避免环境中RNA酶污染样品。

植物RNA提取步骤

植物RNA提取步骤（附图） 实验步骤 1. 在eppendorf管中加入700ul 提取液（配方见后面）和10 ul巯基乙醇（在有褐化现象的时候再加就行，否则推荐不加），65度预热（可选）。 2. 研钵液氮预冷，取适量材料加入过量液氮，迅速研磨成均匀的粉末（有滑腻感），加入到预热的eppendorf管中水浴6min（可选）.取出后加入氯仿、酚各350ul，振荡20min。 3. 4℃13000rpm 离心15min，同时在另外的eppendorf管加入氯仿、酚各350ul。 4. 吸取上清，加入到上述离心管中，振荡10 min。 5. 4℃13000rpm 离心8min。同时在另外的eppendorf管加入氯仿700ul。 6. 吸取上清，加入到上述离心管中，振荡10min。 7. 4℃13000rpm 离心8min。同时在另外的eppendorf管加入350ul的75％乙醇、350ul的8MLiCl。 8. 吸取上清，加入到上述离心管中，－20℃沉淀30min，13000rpm离心20min。 9. 弃上清，75％乙醇清洗两次。 溶于30ul 的水（DEPC水），直接进行测定浓度和电泳，CTAB结果如下(左侧四个）：0.155ug/ul 260/280=2.11 260/230=2.20 SDS结果如下（右侧四个） 0.102ug/ul 260/280=1.78 260/230=2.05 电泳结果如下： 加入DNase和buffer（promega）,37度消化30min,氯仿抽提两次,用1/10体积NaAc 和二倍体积无水乙醇沉淀15min,13000rpm离心10min.75%酒精洗两次, 溶于30ul 的水（DEPC水）中.

提取细胞RNA的步骤

提取细胞RNA的步骤 提取细胞RNA的步骤： 1) 六孔板每孔细胞中加入1ml Trizol，冰上放置5min，枪头吹打。 2) 将各孔裂解液吸到1.5 ml EP管中，加入氯仿0.2ml/管，用力振摇15s。15－30℃下孵育2-3min，离心（4℃，12，000g，15min）。 3) 离心后液体分为三层（上层－无色水样层为RNA，中层白色为DNA和底层红色为蛋白质），小心吸取上层无色液体移入一新的EP管中。 4) 加入等体积异丙醇，0.4－0.5ml，混匀，15-30℃下孵育10－30min，离心（4℃，12，000g，10min）。其中如果加入等体积异丙醇后，置于试管架上用PE手套密封后，放于4℃冰箱中，沉淀30min效果更好。 5) 去上清，沉淀加入75％乙醇1ml，漩涡振荡30s，离心（4℃，7，500g，5min）。 6) 小心去上清，管内沉淀在超净台中鼓风静置干燥3-5min。最好是用枪头吸取上清，尽量除去。 7) 加入20ul DEPC水溶解，分装5ul/管，-70℃冰箱保存。 8) 细胞总RNA的鉴定：0.9-1.2％琼脂糖电泳鉴定细胞总RNA，观察出现条带及各条带亮度。紫外分光光度计测定：分别测定细胞总RNA在260nm和280nm处的光密度值(OD),并计算RNA的含量和纯度。 1、实验目的 提取人体细胞的总RNA和mRNA。 2、本实验所需试剂 1）、CNE-2细胞及培养细胞的一系列条件， 2）、PBS缓冲液， TRIZOL试剂， 3）、DEPC处理过的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管, 4）、新的氯仿、异丙醇和乙醇， 5）、mRNA分离试剂盒：Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。

细菌总RNA提取说明-生工

细菌总RNA快速抽提试剂盒 产品编号：SK8625/SK8626 包装规格：50次/100次 试剂盒组成 组分 SK8625，50次 SK8626，100次 Buffer Rlysis-B 50 ml 100 ml DEPC-treated ddH2O 30 ml 60 ml 操作手册1份1份 保存方法及注意事项 试剂盒于常温运输，4°C保存。有效期见包装。 产品介绍 本试剂盒是生工生物工程（上海）有限公司最新研制成功的一种细菌总RNA快速抽提试剂盒。因为细菌RNA半衰期很短，RNA很容易发生降解。针对这一难题，本试剂盒采用溶菌酶与裂解液Buffer Rlysis-B共同作用，快速裂解样品，再通过氯仿抽提、无水乙醇沉淀等步骤，可获得浓度高、完整性好的RNA。适合于从各种来源的细菌（革兰氏阳性或阴性菌等）培养液中快速提取RNA。 使用本试剂盒，从1 ml对数生长期的细菌菌液中提取5~15 μg总RNA，可直接用于RT-PCR、Northern Blot、斑点杂交等实验。 本产品具有以下特点： 1. 操作简单，全过程可在40分钟内完成。 2. 完整性好，纯化的RNA几乎不会发生降解。 3. 纯度高，OD260/280一般为2.0。 试剂准备 自备试剂：无水乙醇、75%乙醇、溶菌酶、氯仿等。 标准抽提步骤 4. 取1 ml对数生长期的细菌，8,000 rpm 4°C离心1 min，彻底弃掉培养基，加100 μl溶菌酶，振荡混匀。（G-菌使用的溶 菌酶浓度为400 μg/ml，室温酶解3~5分钟；G+菌使用的溶菌酶浓度为3 mg/ml，室温酶解5~10分钟。） ?收集菌体后可用500 μl DEPC-treated ddH2O漂洗一次，10,000 rpm离心1分钟，弃上清，进一步去除残留的培养基。 5. 立即加入900 μl Buffer Rlysis-B震荡混匀，室温放置3 min。 6. 向裂解样品中加入200 μl 氯仿，充分混匀。12,000 rpm 4°C离心5 min，取上清。 7. 向上清液中加入1/3 体积无水乙醇，混匀，室温放置3 min，12,000 rpm 4°C离心5 min，小心倒掉上清。 ?离心后，在离心管底部，可能无肉眼可见的沉淀产生，属正常现象，请继续以下操作。 8. 用700 μl的75%乙醇（请用DEPC-treated ddH2O配制）洗涤沉淀，12,000 rpm 4°C离心3 min, 小心倒掉上清。 9. 重复步骤5一次。 10. 室温倒置10 min，尽可能使离心管中残留的乙醇彻底挥发。加入30-50 μl的DEPC-treated ddH2O溶解沉淀，立即使用或 -70°C长期保存。 ?如果残留的乙醇有挂壁现象，倒掉液体后再短暂离心，将残液用移液器吸出。然后开盖室温放置5~10分钟至残留的乙

TransZol法rna提取试剂盒说明

TransZol法RNA提取步骤 准备试剂：氯仿、无水乙醇。 1.菌体处理 (1)将发酵后的菌体小心地转入1.5ml离心管中，用纯水冲洗菌体，12000rpm离心2min，仔细去除培养基上清。 (2)加入TransZol TM Up (每≤2×109个细菌中加入1ml TransZol TM Up)。 (3)用移液枪反复吸吹直至裂解液中无明显沉淀。 (4)室温静置5min。 2. 每使用1ml TransZol TM Up，加入0.2ml氯仿或50ul 4-Bromoanisole(间溴茴香醚)，剧烈震荡30s，室温孵育3min。 3. 10000×g 4℃离心15min。此时溶液分成三层，无色的水相（上层）、中间层，粉红色有机相（下层）。RNA分布在水相中，水相体积约为所用TransZol TM Up 试剂的50%-60%（为了避免吸到中间层导致DNA污染，可以适当留下一部分水相）。 4. 转移无色的水相于新的RNase-free离心管中，加入等体积的无水乙醇（此时可能会出现沉淀），轻轻颠倒混匀。 5. 将得到的溶液和沉淀一起加入离心柱中，12,000×g 室温离心30s，弃掉流出液（如果体积大于离心柱容量，可以分几次完成）。 6. 加入500ul CB9，12,000×g 室温离心30s，弃掉流出液。 7. 重复步骤6一次。 8. 加入500ul WB9（使用前请先检查是否加入无水乙醇），12,000×g 室温离心30s，弃掉流出液。 9. 重复步骤8一次。 10．12,000×g 室温离心2min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟彻底晾干离心柱。 11.将离心柱放入RNase-free Tube（试剂盒已配）中，加50-200ul RNase-free Water 在离心管的中央，室温静置1min。 12. 12,000×g 室温离心1min，洗脱RNA。 （可选步骤：为获得更多的RNA，建议重复步骤11和12进行二次洗脱）。

(完整版)总RNA提取的原理、步骤

总RNA提取的原理、步骤 1.原理及方法（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法） TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。 2.简易步骤 细胞或组织，加入0.4ml TRIZOL试剂后匀浆 ↓ 室温静置5分钟 ↓ 加入1/5 TRIZOL试剂体积量的氯仿，剧烈震荡混匀 ↓ 室温静置5分钟，12000g 4℃离心l5分钟 ↓ 将上清液转移至新的离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇，颠倒混匀 ↓ 室温静置10分钟，12000g 4℃离心l0分钟，弃上清 ↓ 向沉淀中加入1ml的75%乙醇清洗沉淀，12000g 4℃离心5分钟 ↓ 弃上清保留沉淀，干燥 ↓ 沉淀物溶解于11μl的DEPC处理水中 ↓ 注意：以上操作应在生物安全柜内完成，以防止污染。 注意事项 ①全程配戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。 ②使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。

③在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。 ④用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。如无例外，所有的操作应该在15 -30°C的条件下完成，试剂亦在 15 -30°C的条件下。 ⑤75%乙醇(用DEPC处理过的水配制：将水加入无RNA酶的玻璃瓶中，加入DEPC至 0.01% (v/v)。放置过夜并高压灭菌。) ⑥每50—100 mg组织加1ml的TRIZOL。匀浆化时组织样品容积不能超过TRIZOL容积的10%。 ⑦单层生长的细胞直接往直径3.5 cm的培养板中加入1ml的TRIZOL溶解细胞，通过移液管分次移出细胞裂解物。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的TRIZOL 量（每10 cm2加1 ml）。当TRIZOL量不足时可导致抽提的RNA中污染有DNA。 ⑧在匀化后和加入氯仿之前，样品可以在–60—–70°C保存至少一个月。RNA沉淀（RNA 洗脱）溶于75%的乙醇在2—8°C至少可以保存一周，在–5—–20°C下至少可保存一年。 逆转录cDNA及注意事项 如果cDNA当天不使用，则要保存在-20℃或-70℃。 RNA逆转录成cDNA操作流程简图如下：（在冰盒上操作） 1.将提取的RNA溶解于11 μl DEPC-t净化水中，加入1ul引物，1ul模板RNA，1uldNTP 轻微震荡后离心3-5秒。 2.在PCR扩增仪上70℃ 5分钟。 3.冰上冷却1分钟，并短暂离心，向反应体系中加入5×reaction buffer 4μl，RibolockTM Ribonuclease inhibitor (20 u/μl) 1μl，10 mM dNTP mix 2μl。 4.轻微震荡后离心3-5秒，在PCR扩增仪上37℃ 5分钟。 5.向反应体系中加入RevertAidTM M-MuLV Reverse Transcriptase (200u/ul) 1μl，在PCR 扩增仪上42℃ 60分钟进行逆转录，70℃ 10分钟灭活逆转录酶。 6.收集反应产物，冰上冷却

OMEGArna提取试剂盒中文说明

E.Z.N.A. Total RNA Kit I (R6834-01 50 preps) 步骤 A ． 真核细胞和组织 自己需要的材料： β－巯基乙醇、70％乙醇（DEPC 水配置）、除RNase 的枪头和EP 管。 材料的最佳量 想得到最佳的产量和好的Hibind RNA 柱的纯化效果，选用正确的细胞和组织量是最重要的。Hibind RNA 柱的最大处理量是可变的，根据细胞和组织的类型。最大的结合能力是100ug 的RNA 。TRK 裂解缓冲液的最大裂解能力是1*107个细胞或30mg 的组织。 细胞的步骤 1． 用500ul 的TRK 裂解缓冲液裂解细胞（≤1*107），使细胞团松散，轻轻弹EP 管或者用 枪头吹旋，再用漩涡振荡混匀。 a) 使用前每1ml TRK 裂解缓冲液加入20ul 的β－巯基乙醇。 b) 如果是单层的组织培养细胞（成纤维细胞，内皮细胞等），可以直接在细胞培养器 里裂解细胞。完全吸去培养基后直接加TRK 裂解缓冲液至细胞中。加700ul 的TRK 到T35细颈瓶或10cm 的培养皿中，更小的培养器加500ul 的TRK 。将液体布满整个器皿表面，确保细胞裂解完全。将裂解产物转移至1.5mlEP 管中。 c) 如果细胞是悬液培养，收集细胞（≤1,500rpm or 400*g ）*5min ，弃上清，加入TRK 裂解液，漩涡振荡混匀。 2． 匀浆化裂解产物 “裂解和匀浆化样品”－第四页有详细的说明，如果细胞≤1*105，漩涡振荡1min 。不完全使样品匀浆化会显著的减少RNA 的产量还容易造成柱子堵塞。 a) 用匀浆器30 s ，使样品匀浆化。 b) 用钝的针头的注射器（0.9mm 直径），至少吹打5次是样品匀浆化。注射器要除 RNase 。 3． 将匀浆后的裂解产物转移至Homogenization Spin Column 中，离心，≥1,4000*g, 3min, 室温。将离心收集的流出液转移到新的EP 管中。转到总RNA 分离中第4步。 组织的步骤： 1． 用500ul 的TRK 裂解缓冲液裂解细胞（≤30mg ），使用前每1ml TRK 裂解缓冲液加入 20ul 的β－巯基乙醇。 500ulTRK 裂解液最大裂解能力30mg ，难破碎的组织大于20mg 就用700ul 的TRK 裂解液。当组织量超出建议的最大量时，也不要超过40mg 。 组织样品匀浆化参照第四页选择一种方法只用，除非是使用液氮， 2． 离心，≥1,5000*g, 5min, 室温。 3． 转移上清至，Homogenization Spin Column 中，离心，≥1,3000*g, 3min,室温。将离心收 集的流出液转移到新的EP 管中。 总RNA 分离： 4． 在裂解产物中加入50％体积（250ul －350ul ）的无水乙醇（96％－100％）混匀，漩涡振 荡20s 。 5． 样品转移到Hibind RNA Mini column 上，离心管的最大容量为750ul ，加完乙醇后可能 会形成沉淀。所以要充分振荡将所有的混合液加入到柱子上。室温离心，10,000*g,1min 。弃去流出液（透过柱子流出到离心管里的液体）。 生物秀-专心做生物 w w w .b b i o o .c o m

RNA提取步骤

1. 组织样品：称取20mg-50mg 样品，使用液氮研磨或者匀浆器匀浆，加入RNA-Solv ? Reagent裂解 2. 室温静置2-3 分钟。 3. 加入200μl 氯仿(氯仿的使用量为1/5 RNA-Solv ? Reagent 的使用量），涡旋混匀15 秒，冰浴10 分钟。 4. 4℃，12,000×g 离心15min。 5. 小心转移不大于80%的水相层至新的离心管，加入1/3 倍体积的无水乙醇，涡旋混匀15 秒。 6. 将HiBind RNA 结合柱套在2ml 离心管中，转移不大于700μl 混合液至HiBind RNA 结合柱中。 室温下10,000×g 离心1 分钟，弃滤液。 7. 重复步骤六，直至所有的混合液全部离心，结合到HiBind RNA 结合柱上。 8. 将HiBind RNA 结合柱套在新的2ml 离心管中，加300μl RNA Wash Buffer I 至HiBind RNA 结合柱中，10,000×g 离心1 分钟，弃滤液； 9. （选做）DNase I 消化: a. 配制DNase I(Digestion Buffer, 73.5μl; RNase-Free DNase I,1.5μl),混匀。 b. 将上述75μl DNase I 溶液转移至HiBind RNA 结合柱膜的正中央，不要将消化液转移至柱子内 壁。 c. 室温静置15 分钟。 10. 将HiBind RNA 结合柱套在同一个2ml 离心管中，加入400μl RNA Wash Buffer I 洗涤，如做了DNase I 消化，需室温静置 5 分钟，10,000×g 离心1 分钟，弃滤液。 11. 将HiBind RNA 结合柱套在同一个2ml 离心管中，加入500μl RNA Wash Buffer II 洗涤，10,000×g 离心 1 分钟，弃滤液。 12. 重复步骤11 一次，＞10,000xg 离心空甩2min 干燥HiBind RNA 结合柱基质。 13. 将HiBind RNA 结合柱套在干净的1.5ml 离心管中，加30-50μl DEPC Water，室温静置2min。≥10,000xg 离心1min 洗脱RNA。

总RNA提取试剂盒说明书

总RNA提取试剂盒说明书 货号：R1200 规格：50T/100T 产品内容： 试剂盒组成R1200-50R1200-100保存有效期 裂解液50ml100ml2-8℃一年 漂洗液15ml15ml×2RT一年 洗柱液50ml50ml×2RT一年 RNase free ddH2O15ml15ml×2RT一年 RNase free吸附柱50个100个RT一年 RNase free收集管(2ml)50个100个RT一年 操作步骤： 1.样品处理： a.植物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织在液氮中研磨，把粉末加入到1ml裂解液中混匀。 b.动物组织：取新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液，用组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。 c.贴壁细胞：直接在培养板中加入裂解液裂解细胞，每106细胞加1ml裂解液。用取样器吹打混匀。 d.细胞悬液：离心收集细胞。每106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml裂解液混匀。 e.血液处理：取0.2-1ml新鲜血液加3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10000rpm离心1分钟。弃上清，若沉淀含有红细胞，可加入2倍体积红细胞裂解液重复裂解步骤。离心后沉淀加入1ml裂解液混匀。 2.将处理后的样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。 3.向匀浆样品中加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3-5分钟。 4.2-8℃12000rpm离心10分钟。RNA主要在上层无色的水相中，把水相转移到新管中，不要吸到沉淀。 5.吸附柱前处理：在吸附柱中加入500ul洗柱液，室温放置2分钟，2-8℃12,000rpm离心2min，弃废液。 6.第4步收集的上清中加入200ul无水乙醇混匀，加入吸附柱静置2分钟，2-8℃12000rpm离心2min，弃废

Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)

Trizol法使用步骤 一、分离纯化的基本原理 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。 二、用户需自备的试剂和材料 无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free） 三、准备工作 RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。 RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。 1、料制品的处理 尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下： 1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。 2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品

的所有部分都浸泡到溶液中。 3）在通风柜中室温处理过夜。 4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。 5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。 2、璃玻和金属物品 250°C烘烤3小时以上。 四、从组织中提取总RNA 1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。 （液氮既能使各种组织成分不易被破坏或降解,又能使组织变硬,脆性增加易于磨碎。终止细胞内外一切生物反应，防止RNA酶的降解反应） 2) 匀浆：组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。 五、从细胞中提取总RNA 1) 培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml比例加入。 2) 悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。 六、操作步骤 1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。

EASYspin Plus 骨组织RNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书

EASYspin Plus Bone Tissue RNA Kit EASYspin Plus骨组织RNA快速提取试剂盒 目录号：RN54 适用范围： 适用于快速提取骨组织细胞总RNA，使用独有基因组DNA清除柱技术可有效清除电泳可见gDNA残留，RNA可用于反转录PCR，荧光定量PCR等。 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存50次(RN5401) 裂解液CLB 室温50 ml PLANTaid 室温 5 ml 裂解液RLT Plus 室温25 ml 去蛋白液RW1 室温40 ml 漂洗液RW 室温10 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free H2O 室温10 ml 基因组DNA清除柱 和收集管室温 50套 RNase-free 吸附柱RA和收集管 室温50套 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。 储存事项： 1.不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。 2.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。 注意事项 1.所有的离心步骤均可在室温完成（4℃离心也可以），使用转速可以达到13,000 rpm

的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 2.需要自备乙醇，研钵或者其它合适的破碎骨组织装置。 3.样品处理量绝对不要超过基因组清除柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造 成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。 4.裂解液CLB和RLT Plus 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手 套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。 5.关于DNA 的微量残留: 一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留（DNase消化也无法做到100%无残留），本公司的EASYspin Plus RNA提取产品，由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时： 1)选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与 扩增反应。 2)选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。 3)将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后 的RNA清洁(cleanup) ，请联系我们索取具体操作说明书。 4)在步骤去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上进行DNase I柱上消化处理。购 买DNA酶柱上消化试剂盒(货号：RN34)前可先索取具体操作说明书。 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 提示： ?第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇! ?取1ml裂解液CLB至离心管内(如果CLB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解），在裂解液CLB中加入100μl PLANTaid，颠倒混匀后65°C水浴中预热。多个样品按照比例放大准备。 1.液氮研磨法: a. 骨钳夹碎骨组织后放入研钵（研钵在180度干烤2小时），加入液氮后反复研 磨成细粉，注意液氮蒸发后不断补加保存液氮一直存在。

RNA提取一般步骤总结

RNA提取一般步骤总结 RNA提取原理： | 通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。 RNA提取的一般步骤 所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制RNA酶活性。RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA 与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。 实验步骤： 破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。 1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。 2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。 3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。 4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。 5、融解RNA一般使用TE。 6、保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA 时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。 I氯化锂法提取总RNA： 本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA，其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA，具有快速简洁的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片断丢失的缺陷。 试验试剂： 1、氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，过滤灭菌】 2、悬浮液【10mM? Tris-HCL (pH7.6) ,1mM? EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】 试验步骤： 1、对于大量组织或细胞，则每克组织或细胞加入5－10ml氯化锂－尿素溶液，匀桨器高速匀桨2分钟；对于少量细胞（107个细胞/ml），则每克组织或细胞加入0.5ml氯化锂－尿素溶液手工匀桨，并转移至Eppendof管中。

(整理)EASYspin Plus大量组织细胞RNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书

EASYspin Plus大量组织/细胞RNA快速提取试剂盒 目录号：RN41 目录编号包装单位 RN4101 10次 适用范围： 适用于快速提取动物细胞和易裂解动物组织总RNA，使用独有基因组DNA清除柱技术确保有效清除gDNA残留，不需要使用DNase消化，RNA可直接用于PCR，荧光定量PCR.。 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存10次 裂解液RLT Plus 室温100 ml 去蛋白液RW1 室温120 ml 漂洗液RW 室温25 ml X 2 第一次使用前按说明加指定量乙醇 70%乙醇室温15ml X 2 第一次使用前按说明加指定量乙醇 RNase-free H2O 室温10 ml 基因组DNA清除柱 和收集管 室温10套RNase-free 吸附柱RA和收集管室温 10套本试剂盒在室温储存6个月不影响使用效果。

储存事项： 1.所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接 使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。 2.不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输 和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。 3. 4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖 紧盖子。 注意事项 1.所有的离心步骤均可在室温完成，使用可容纳50ml 离心管的离心机。 2. 3.样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造 成DNA残留或者产量降低。不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大，例如胸腺脾脏DNA含量丰富，超过100mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富，超过6x107细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，如细胞不超过6x107，组织不超过200mg。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。 4. 5.

RNA提取标准流程图

RNA提取标准流程 原理： TRIzol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol使样品细胞裂解，溶解细胞含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中，取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA。 预防RNase污染注意事项： 1．经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。2．使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。 3．RNA提取过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿、塑料制品高压灭菌，然后烘干即可。 4．配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.05% v/v，充分混匀后37oC放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。） RNA的提取 准备试剂：氯仿，异丙醇（可保存在-20oC，用时取出置于冰上），75%乙醇，无RNase的水。所有.溶液均需用0.05% DEPC处理过的水配制。10×Loading buffer （宝生物工程（），货号：D603，35元，1mL×5支） 准备器材：1 mL、200 μL枪头、小烧杯*3、1.5 mL Eppendorf管、2 mL Eppe ndorf管若干、报纸、卷纸、研钵，以上物品全部需要高压。 操作步骤: 1. 研磨+匀浆：将组织在液氮中磨碎（大体积不均一的样品，如下丘脑、海马等神经组织、成年动物肾上腺等腺体，必须对整个组织研磨），取50～100 mg组织样品（肝脏可减少样品量到30 mg）放入2 mL离心管中，称重记录；均一组

织或者小体积的不均一组织可直接称重后匀浆。每50～100 mg组织加入1 mL TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。 2．将匀浆样品在室温（15～30oC）放置5 min（可延长到15 min），使核酸蛋白复合物完全分离。 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖（如肝脏和肌肉中的糖原）或胞外物质（肌肉）可于2～8℃ 10000 × g离心10 min，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量基因组DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液转入2 mL管中进行下一步操作。 3. 每1 mL TRIzol加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡60 s（可使用混匀器，也可手动剧烈颠倒混匀），室温放置3 min。（可延长震荡时间和放置时间到15 min，同GTC 法） 4. 4oC 10000 × g离心15 min。样品分为三层：底层为红色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。（即1mL最多600μl，为保证RNA质量，可适量减少抽取量，防止抽到下层） 5. 记录抽取水相的量，把水相转移到新的1.5 mL Eppendorf管中，用等体积的预冷的异丙醇沉淀水相中的RNA。 a. 每使用1 mL TRIzol加入0.5 mL异丙醇，室温放置10 min。 b. 可选：应对糖原含量较高的组织（如肌肉和肝脏）：每使用1 mL TRIzol在水相中加0.25 mL异丙醇和0.25 mL高盐溶液（0.8 M柠檬酸钠和1.2 M NaCl）混合离心，这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，沉淀出RNA。 6. 4oC 10000 × g离心10 min，离心前看不出RNA沉淀（肌肉和肝脏等富含糖原的组织可能出现大量糖原沉淀），离心后在管侧和管底出现白色半透明状沉淀。弃上清。 8. 向1.5 mL Eppendorf管中加入75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1 mL TRIzol 至少加1 mL 75%乙醇。4℃不超过7500×g离心5 min，弃上清。 9.室温放置于超净台通风口（垫上已灭菌的吸水纸）干燥RNA沉淀，大约晾5～ 10 min即可，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入适量DEPC水，记录使用的DEPC水体积（适量是指加入水后仍能保证RNA浓度至少≥0.5 μg/μL，但不影响溶解，浓度在4 μg/μL以上的RNA较容易出现溶解不完全的情