小麦全蚀病抗性鉴定方法的优化及抗源筛选研究
第37卷 第3期2009年3月
西北农林科技大学学报(自然科学版)
Journal o f N ort hw est A&F U niv ersit y(N at.Sci.Ed.)
Vo l.37N o.3
M ar.2009小麦全蚀病抗性鉴定方法的优化及
抗源筛选研究
董建力1,惠红霞1,黄丽丽2,王敬东1,朱永兴1,陈 孝3,叶兴国3 (1宁夏农林科学院农业生物技术研究中心,宁夏银川750002;2西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100;
3中国农业科学院作物科学研究所,北京100081)
[摘 要] 目的 为小麦抗全蚀病育种提供更有效的抗病鉴定方法和便于利用的抗源材料。 方法 以感病小麦品种宁春4号为供试材料,将小麦全蚀病(G.g raminis var tr itici)菌种制成菌饼或菌粒,设菌饼法、菌粒法、菌粒+菌饼法和空白对照4个处理,调查统计病根率、严重度和病茎率,用于筛选有效的抗病鉴定方法;选择22个遗传背景不同的小麦材料,采用优选出的抗病鉴定方法对其进行抗性鉴定,筛选便于利用的抗源材料。 结果 菌饼+菌粒法对宁春4号的致病力明显高于菌饼法和菌粒法,其病根率、严重度和病茎率分别达到100.0%,57.3%和28.6%。22个遗传背景不同的小麦材料间抗病性差异较大,其中小麦 簇毛麦易位系Pm97033的抗病性最强,病根率和严重度分别为11.3%和5.4%;代换系W an7107次之,病根率和严重度分别为21.4%和10.6%;硬粒小麦 簇毛麦双二倍体(T H1)与普通小麦品种杂交后代的抗病性强于粗山羊草与普通小麦品种杂交后代。 结论 菌饼+菌粒法是较佳的小麦抗全蚀病鉴定方法;T H1是一个很好的抗全蚀病育种材料。
[关键词] 小麦;全蚀病菌;抗病性;病害严重度;抗全蚀病易位系
[中图分类号] S435.121.4+9[文献标识码] A[文章编号] 1671 9387(2009)03 0159 04 Optimization of identification technique and germplasm screening
of resistance to take all in wheat
DONG Jian li1,H UI Hong xia1,H UA NG Li li2,WANG Jing dong1,
ZHU Yong x ing1,CHEN Xiao3,Ye Xing g uo3
(1A g ricultur al Bio T echnolog y Resear ch Center of Ning xia A cad emy of A gr icultur e and Forestry S cience s,Yinch uan,
N ing x ia750002,China;2Colleg e of P lant Pr otection,Northw est A&F Univ er sity,Yan glin g,S haanxi712100,Ch ina;
3I nstitu te of Cr op S cience s,Chinese A cad emy of A gr ic ultur al S ciences,Beij ing100081,China)
Abstract: Objective T he purpose of this paper w as to find an effective way to identify disease r esist ance and to screen mater ials resistant for breeding of resistance to take all in w heat. M ethod Identifica tion techniques fo r take all w ere ev aluated by using Ning chun4as material,and different w heat g erm plasm s w ere identified by using disc and gr anule fro m the pathogen cultur e for the disease resistance by surveying the percentag e o f diseased stem and r oot,and severity level.Disease resistance to different her ed ity backg round in22w heat materials w as identified for screening resistant materials. Result The r esults show ed that the combination of the disc and granule o f the fungus(disc+granule)w as much better in effects to test take all fungus to Ningchun4than to use the disc o r granule separately.The per centage of diseased roo t,severity lev el and the percentage of diseased stem w ere100.0%,57.3%and28.6%.T here w as big difference among the22different materials in the disease resistance.T ranslocation lines Pm97033
*[收稿日期] 2008 05 15
[基金项目] 宁夏自然科学基金项目(NZ0759)
[作者简介] 董建力(1956-),男,山西万荣人,副研究员,主要从事小麦生物技术育种研究。E m ail:jianli56@https://www.wendangku.net/doc/4b17033446.html,
show ed the highest r esistance in reaction than others.T he percentag e of diseased roo t and sev ered level w ere11.3%and5.4%;substitution lines Wan7107show ed medium resistance to the fungus,the percent ag e of diseased roo t and severity level w ere21.4%and10.6%;F5generation of co mmon w heat w ith TH1 show ed hig her resistance to take all fungus than the F5prog enies of co mmo n w heat w ith Aegilops tauschii or the other com mon w heat varieties. Conclusion T he m ethod of disc+g ranule is a better w ay to identify resistance to take all in w heat;T H1is a goo d material for the breeding of resistance to take all in w heat.
Key words:w heat;take all fung us;disease resistance;disease sev erity;translocation lines resistant to take all
小麦全蚀病是一种典型的、毁灭性的土传根部病害,一旦发生就很难消除。虽然一些栽培措施及生物防治方法对该病有一定的控制作用,但效果均不理想。选育和种植抗病品种是解决小麦全蚀病危害的根本途径,而简便、经济、有效的抗病鉴定方法是筛选抗病材料及抗病品种的关键[1 2]。
Laursen研究表明,簇毛麦(H ay naldia v illo da)对全蚀病有较强的抗性[3];陈孝等[4]对硬粒小麦 簇毛麦杂种幼胚和F1幼穗诱导的愈伤组织进行秋水仙素处理,获得硬粒小麦 簇毛麦双二倍体TH1、TH2、TH1W、T H2W、TH3和TH3W。这些材料1998年经中国农业科学研究院植物保护研究所人工接种鉴定,发现TH1、T H3和簇毛麦对全蚀病抗性很强。有研究表明,方穗山羊草(T riticum tauschii)D染色体组中有抗全蚀病菌基因,在小麦背景中抗病性表现较稳定[5]。以往的抗病鉴定方法多采用菌饼法[6 8]和菌粒法[9 10],这些方法虽然有效,但是致病力不是很强,如用同一材料、同一方法,在同一时间、地点进行抗病鉴定,重复间的病根率和严重度相差较大。
为此,本研究欲对全蚀病抗性鉴定方法进行优化,并对遗传背景不同的小麦材料进行抗性鉴定,以期筛选出抗全蚀病的小麦新种质,为小麦抗全蚀病育种提供更有效的抗病鉴定方法和便以利用的抗源材料。
1 材料与方法
1.1 材 料
供试小麦材料:(1)硬粒小麦 簇毛麦双二倍体(TH1)与宁春4号杂交F5代10个(07K4 314、07K4 315、 、07K4 323);(2)宁春4号与粗山羊草杂交F5代8个(074 49、074 50、 、074 58);
(3)抗白粉病易位系Pm97033、附加系92R 179、异代换系Wan7107、Rw15及TH1,均由中国农业科学院作物科学研究所陈孝研究员提供。T H1为抗病对照,宁春4号为感病对照。
1.2 方 法
1.2.1 供试菌种的培养 小麦全蚀病纯化菌株由西北农林科技大学植物保护学院提供。小麦全蚀病菌饼和菌粒的培养按高小宁等[10]的方法进行。
菌饼的制备:将小麦全蚀病纯化菌株按常规方法在PDA培养基上培养30d后,切成1cm2方块,用于菌饼接种。
菌粒的制备:将小麦与水按体积比1 1.5装于三角瓶中,每天高压灭菌1h,连续灭菌3d,待冷却后,将制备的小麦全蚀病菌饼与灭菌的小麦混匀,室温下培养4~6周,晾干备用。
1.2.2 不同接种体感病程度的比较 以感病小麦品种宁春4号为供试材料,用灭菌的河沙盆栽(直径10cm),设菌饼法、菌粒法、菌粒+菌饼法和对照4个处理,每个处理种3盆(重复3次),每盆种7株。
(1)菌饼法:每盆先放7块菌饼,每个菌饼上放1粒灭菌催芽(萌动)的麦粒,盖河沙2cm。
(2)菌粒法:取20g培养好的菌粒均匀撒在河沙上,在菌粒上撒1cm厚的河沙,播7粒灭菌催芽(萌动)的麦粒,盖河沙2cm。
(3)菌粒+菌饼法:在河沙上先放置20g菌粒,菌粒上盖2cm厚河沙,然后放7块菌饼,每个菌饼上放1粒灭菌催芽(萌动)的麦粒,盖2cm厚河沙。
(4)对照:在河沙上播7粒发芽的麦粒,盖2cm 厚河沙。
全部盖河沙后每盆浇一纸杯水(100m L),用塑料膜覆盖保湿,在20~25 、每天8~10h太阳光照条件下培养,每隔2d浇1次水,每盆每次浇水100mL。待幼苗长到3叶期(30d左右)后洗根,调查发病情况。
1.2.3 不同遗传背景材料的抗性鉴定 根据试验结果,选发病最重的菌粒+菌饼法,对22个遗传背景不同的小麦材料进行抗性鉴定,方法同1.2.2中的菌粒+菌饼法。
160西北农林科技大学学报(自然科学版)第37卷
1.2.4 病害调查与统计方法 病害调查与统计参照王美南等[6]
和高小宁等[10]
的方法进行。以根皮层或中柱变褐或变黑为病根。病根率/%=(病根数/总根数) 100%,严重度/%=(变黑组织的面积/总根面积) 100%。以幼苗茎基部变褐或变黑者为病茎,病茎率/%=(病茎数/总茎数) 100%。
2 结果与分析
2.1 小麦全蚀病抗性鉴定方法的优化
从表1可以看出,3种不同处理方法的发病程度有较大差异,菌饼法的病根率、严重度及病茎率均最低,分别为75.3%,35.5%和9.5%;其次是菌粒法,病根率、严重度及病茎率分别为78.4%,36.2%和18.3%;菌粒+菌饼法的病根率、严重度和病茎率最高,分别为100.0%,57.3%和28.6%,说明菌粒+菌饼法有很强的致病力。无菌对照的小麦根部正常,没有发病。
2.2 小麦远缘杂交后代对全蚀病的抗性鉴定结果
从表2可以看出,小麦不同远缘杂交后代材料
的发病程度有较大差异,硬粒小麦 簇毛麦双二倍体(T H 1)与宁春4号杂交后代(07K4 314、 、07K4 323)的病根率在25.6%~98.0%,严重度在16.0%~37.3%,其中07K4 320的抗病性较强,病根率、严重度分别为25.6%和16.0%。粗山羊草与宁春4号杂交后代(074 49、074 50、 、074 58)病根率在89.6%~98.6%,严重度在34.1%~45.2%。T H 1后代的抗病性强于粗山羊草后代。TH 1的病根率和严重度最低,感病对照宁春4号的病根率和严重度最高。
表1 小麦全蚀病抗性鉴定方法的优化T able 1 Identificat ion technique o pt imized
to take all in wheat
%
处理Treatm ent 病根率Rate of infected r oot
严重度Severity 病茎率Rate of infected stem
菌饼Disc 75.3
35.59.5
菌粒Granule 78.436.218.3菌粒+菌饼Disc and g ranule
100.057.328.6对照CK
0.0
0.0
0.0
表2 小麦远缘杂交后代对全蚀病的抗性鉴定结果
T able 2 Identificatio n o f resistance in distant hybridig atio n descendan t o f wheat to the take all
%
材料
M aterial 病根率
Rate of infected root
严重度Severity 材料M aterial 病根率
Rate of infected root
严重度Severity 07K4 31486.4
32.5074 4995.3
35.607K4 31587.325.4074 5091.234.107K4 31692.132.7074 5198.638.407K4 31794.430.2074 5293.437.107K4 31887.637.3074 5396.145.207K4 31988.226.4074 5589.639.
207K4 32025.616.0074 5691.235.107K4 32187.433.6074 5895.637.207K4 32298.024.3Pm 9703311.3 5.407K4 32385.627.8RW 1542.226.5T H1
11.2 5.392R 17939.021.0宁春4号Ningch un 4
100.0
50.1
W an 7107
21.4
10.6
2.3 小麦易位系、代换系和附加系对小麦全蚀病的
抗性
由表2还可以看出,小麦易位系Pm 97033的病根率和严重度分别为11.3%和5.4%,抗病性最强;代换系Wan7107次之,病根率和严重度分别为21.4%和10.6%;附加系92R 179和代换系RW15的病根率分别为39.0%和42.2%,严重度分别为21.0%和26.5%。后3个材料的发病程度均介于抗病对照(TH 1)和感病对照(宁春4号)之间,表现出一定的抗病性。从图1可以看到,易位系Pm97033根白色,表现正常;而感病对照宁春4号根发黑,且根短、叶短。
图1 抗源材料对小麦全蚀病的抗病性Fig.1 Screening o f resistant materia ls to disease
resistance to the take all of w heat
161
第3期董建力等:小麦全蚀病抗性鉴定方法的优化及抗源筛选研究
3 讨 论
在创建抗全蚀病小麦易位系过程中,有效的抗性鉴定方法是育种的关键。目前,小麦全蚀病抗性鉴定都采用菌饼法或菌粒法,虽能发病但致病力不强。本研究对全蚀病抗性鉴定方法进行了优化,即采用菌饼+菌粒法,使供试材料的根系经2次病菌感染,结果致病力明显高于1次病菌感染的菌饼法或菌粒法,为抗病鉴定提供了有效的新方法,利用该法可准确选出抗病强的材料,进一步提高育种效率。
本研究结果表明,硬粒小麦 簇毛麦双二倍体(TH1)与宁夏灌区小麦品种宁春4号杂交后代的抗、感差异较大,TH1与宁春4号小麦杂交后代的抗病性强于粗山羊草与宁春4号小麦杂交后代,说明TH1是一个很好的抗全蚀病材料,而且具抗白粉病和锈病等优点,在进行多抗育种中是一个不可多得的好材料,应得到重视并加以利用。
李辉等[11]从硬粒小麦 簇毛麦双二倍体TH3/4 Wan7107的幼胚培养及花药培养后代中,选育出普通小麦 簇毛麦抗白粉病易位系Pm97033等,并利用白粉病抗性鉴定、细胞遗传学分析、生化标记、分子原位杂交等手段,鉴定出Pm97033为6DL/6VS臂间易位系。本研究利用菌饼+菌粒法对易位系、代换系等远缘杂交后代进行抗性鉴定,发现易位系Pm97033(已知的抗白粉病易位系)和代换系Wan7107(已知的代换系)还具有抗全蚀病的特性。这些材料的发现,将为小麦抗全蚀病育种提供便于利用的抗源,为进一步开展抗全蚀病基因的分子标记研究提供了试材。
Pm97033的亲本组合为T H3/4 Wan7107, TH3的亲本组合为墨75 簇毛麦,因此可以初步确定,Pm97033的抗全蚀病基因可能来源于簇毛麦。Wan7107从普通小麦阿夫(意大利)中系选而成, Wan7107对全蚀病的抗性仅次于Pm97033,也表现出较强的抗病性,其有可能也携带有抗全蚀病基因。究竟哪个对Pm97033的抗性起了主要作用或两者的抗性基因共同起作用,以及两者的抗性基因是否相同,还有待于进一步研究。
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162西北农林科技大学学报(自然科学版)第37卷
抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法
抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法 09级生科3班余振洋200900140156 一、【实验原理】 1．关于恶性肿瘤和抗肿瘤药物： 恶性肿瘤是一种常见病，严重威胁着人类的生存质量，被称为人类健康的第一杀手。多年来人类一直在不断的进行抗肿瘤药物的研究，抗肿瘤药物的筛选是整个研究过程中很重要的个环节，而进行药物的筛选首先离不开合理的筛选方法和系统。寻找选择性强、对实体瘤有效的新型抗肿瘤药物，是摆在抗肿瘤药物研究人员面前的重要任务。世界各国对抗肿瘤药物的筛选都非常重视，投入了大量的人力、物力、财力，每年都有大量的化合物(合成药、天然产物和微生物发酵产物)待筛，抗肿瘤药物筛选方法的发展经历了一个探索的过程。 8O年代中期以前，普遍采用的筛选方法是以体内小鼠白血病／淋巴瘤模型P388和L1210为基础的 J，所有化合物在进一步的临床研究之前必须通过这种小鼠肿瘤模型的筛选。即小鼠白血病P388和L1210作为第一轮初筛，能通过第一轮初筛的化合物才能被允许进入第二轮筛选。这种方法有一个很明显的缺陷就是一些在临床上有活性的药物将被筛选掉，无法保证所有具有抗肿瘤作用的药物都能通过筛选。鉴于以前的筛选方法存在较大的缺陷，1985年之后以NCI为首的一些研究单位普遍开始采用针对疾病的筛选方法来代替针对化合物的筛选方法，即放弃体内小鼠筛选，代之为体外代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株筛选。这种筛选系统是一种高通量的抗肿瘤筛选体系，其主要优势有两点：其一是多种细胞株初筛有可能筛选出对特殊的人类肿瘤或对特殊组织亚型有活性的物质；其二是这种体外筛选尤其适合于复杂天然产物提取物中有效成份的证实，过去动物筛选需较大量的天然产物，而现在天然产物的需要量就大大减少，可以指导有效成份的进一步分离纯化，使得从天然产物中发现新的抗肿瘤药物更加便利。 2．关于筛选方法： 下面为现阶段较为普遍采用的一些抗肿瘤药物的筛选方法的实验原理。 1）以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物 端粒是染色体特殊结构，起着保护染色体的完整和稳定性的作用，端粒酶是一种核糖核蛋白返转录酶，由RNA和蛋白质组成，可以以自身的RNA为模板合成端粒末端。已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性，而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性。因此，认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有密切的关系，有可能成为肿瘤治疗的靶点。 2）应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物 快速荧光素测定法是一种近几年发展起来的应用非常广泛的体外药物敏感性测定方法，其原理为采用一些特殊的荧光染料，对细胞的特定成份进行染色或标记。或通过细胞酶的作用使无荧光性的材料分解或转换为荧光材料，通过测定荧光强度从而测定出活细胞的量。现在普遍采用一种特殊的荧光染 FDAL1u(Fluoreseein diacetate)，在正常情况下它不具有荧光，但当它加人到具有完整细胞膜的肿瘤细胞的营养液中时，由于细胞分泌的水解酶的作用，FDA
实验十一 紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选
实验十一紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选 Ⅰ. 紫外诱变技术 一实验目的 以紫外线处理细菌细胞为例，学习微生物诱变育种的基本技术。了解紫外线对细菌细胞的作用。 二实验材料和用具 菌株：大肠杆菌（Escherichia coli） 培养基：营养肉汤（nutrient broth）固体和液体培养基 生理盐水等 器皿：10ml及1ml的移液管，无菌试管，无菌培养皿，无菌三角瓶（内有无菌的玻璃珠20~40粒），无菌漏斗（内有两层擦镜纸），无菌离心管，离心机，紫外诱变箱等。 三实验原理 以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产和科研中可利用此法获得突变株。 四实验内容 1、对出发菌株进行处理，制备单细胞悬液； 2、紫外线进行处理； 3、用平板菌落计数法测定致死率；
五 操作步骤 （一）出发菌株菌悬液的制备 1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16~24h ； 2. 将活化后的菌株接种于液体培养基，37℃ 110rpm 振荡培养过夜（约16h ），第二天，以20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基，继续培养2~4h ； 3. 取4ml 培养液与5ml 离心管中，10000rpm 离心3~5min ，弃去上清液，加4ml 无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液； 4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内，振荡20~30min ，以打散细胞； 5. 取诱变前的0.5ml 菌悬液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注肉汤平板，每一梯度倾注两皿，每皿加1ml 菌液，37℃倒置培养24~36h ，进行平板菌落计数。 （二）UV 诱变 1. 将紫外灯打开，预热30min ； 2. 取直径6cm 的无菌培养皿（含转子），加入菌悬液5ml ，控制细胞密度为107~108个/ml ； 3. 将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上，静止1分钟后开启磁力搅拌仪旋纽进行搅拌，然后打开皿盖，分别处理5s 、10s 、15s 、30s 、45s ，照射完毕后先盖上皿盖，再关闭搅拌和紫外灯； 4. 取0.5ml 处理后的菌液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注肉汤平板进行计数（避光培养）。 六 实验结果 对平板菌落进行计数，并计算死亡率。 %100///?-=ml ml ml 照射前活菌数照射后活菌数照射前活菌数死亡率
基因突变的检测方法
基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。
菌种筛选方法 (2)
菌种筛选方法 在实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。初筛的目的是删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良菌种不致于漏网。因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次。初筛的手段应尽可能快速、简单。复筛的目的是确认符合生产要求的菌株，所以，复筛步骤以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标,测得的数据要能够反映将来的生产水平。 1 从菌体形态变异分析有时，有些菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性，这就能很容易地将变异菌株筛选出来。尽管相当多的突变菌株并不存在这种相关性，但是在筛选工作中应尽可能捕捉、利用这些直接的形态特征性变化。当然，这种鉴别方法只能用于初筛。有人曾统计过3,484个产维生素B2的阿舒假囊酵母(Eremoth ecium ashbyii)的变异菌落，发现高产菌株的菌落形态有以下特点：菌落直径呈中等大小（8-10毫米），凡过大或过小者均为低产菌株；色泽深黄色，凡浅黄或白色者皆属低产菌株。又如，在灰黄霉素产生菌荨麻青霉(Penicillium urticae)的育种中，曾发现菌落的棕红色变深者往往产量有所提高，而在赤霉素生产菌藤仓赤霉（Gibberell a fujikuroi）中，却发现菌落的紫色加深者产量反而下降。 2 平皿快速检测法平皿快速检测法是利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应，将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的
"形态"变化。具体的有纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等，见图。这些方法较粗放，一般只能定性或半定量用，常只用于初筛，但它们可以大大提高筛选的效率。它的缺点是由于培养平皿上种种条件与摇瓶培养，尤其是发酵罐深层液体培养时的条件有很大的差别，有时会造成两者的结果不一致。图平皿快速检测法示意图平皿快速检测法操作时应将培养的菌体充分分散，形成单菌落，以避免多菌落混杂一起，引起"形态"大小测定的偏差。 1) 纸片培养显色法将饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片搁于培养皿中，用牛津杯架空，下放小团浸有3%甘油的脱脂棉以保湿，将待筛选的菌悬液稀释后接种到滤纸上，保温培养形成分散的单菌落，菌落周围将会产生对应的颜色变化。从指示剂变色圈与菌落直径之比可以了解菌株的相对产量性状。指示剂可以是酸碱指示剂也可以是能与特定产物反应产生颜色的化合物。 2) 变色圈法将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养，或喷洒在已培养成分散单菌落的固体培养基表面，在菌落周围形成变色圈。如在含淀粉的平皿中涂布一定浓度的产淀粉酶菌株的菌悬液，使其呈单菌落，然后喷上稀碘液，发生显色反应。变色圈越大，说明菌落产酶的能力越强。而从变色圈的颜色又可粗略判断水解产物的情况。 3) 透明圈法在固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成浑浊、不透明的培养基背景。将待筛选在菌落周围就
(3)理解基因突变的检测方法
第十章基因突变 一、教学目的与要求： （1）了解基因突变的类型和性质、特征 （2）掌握基因突变分子机理和诱变因素的作用方式 （3）理解基因突变的检测方法 (4) 掌握基因突变的修复途径 二、教学重点、难点、疑点： 1.突变的概念、类型和性质 2.诱发突变的分子基础 3.诱发突变与人类癌症 4.生物体基因突变的修复机制 5.果蝇基因突变的检出 6.植物基因突变的检出 7.人类基因突变的检出 [解决方法] （1）通过出示基因结构变化的示意图，加深学生对基因突变内涵的理解。 （2）课堂教学中不断提出问题，让学生通过概念的运用达到巩固概念和知识迁移的目的。 2．教学难点及解决办法 基因突变的原因。 [解决办法] 对人类镰刀型细胞贫血症病因结合图解进行分析，使学生真正明白基因突变的原因——DNA复制过程也可能发生差错，基因中个别碱基的变化，就会造成性状改变。 3．教学疑点及解决办法 为什么说基因突变是变异的主要来源？ [解决办法]讲明基因突变与基因重组的区别，联系实际举例。 三、教学方法设计： 四、教具或教学手段：多媒体课件 五、教学过程与板书设计：
第一节基因突变的概念和特征 一、基因突变的概念及类别 1、基因突变：指在染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变基因突变：指染色体上一定位点基因内部的化学变化引起的突变 2、类别 隐性突变：A a 显性突变：a A 自发突变—外界环境条件的自然作用或生物体内的生理生化变化而产生的突变 诱发突变—在专门诱变因素影响引起的突变，为“诱发突变” 形态突变型—可见突变：指造成外形改变的突变型 至死突变型—能造成个体死亡或生命力明显下降的突变型 条件突变型—在一定条件下有致死效应 3.一般特征 ①突变的频率：指生物体在每一世代中发生突变的机率，或者在一定时 间内突变可能发生的次数。 高等植物 10-5— 10-8 细菌和噬菌体 10-4—10-10范围大、突变频率比动植物高 例如：氨基酸过程中三种疾病是由三种基因突变导致酶发生变化引起的，有一定的突变频率 苯丙氨酸羟化酶缺乏导致苯丙酮尿症；尿黑尿酸氧化酶缺乏会产生尿黑酸尿症；酪氨酸酶缺乏导致白化病 苯丙氨酸羟化酶 苯丙酮酸苯丙氨酸酪氨酸 积累尿黑尿酸氧化酶 酪氨酸酶 苯丙酮尿症尿黑酸黑色素
抗肿瘤药物药效学实验方法及指导原则
抗肿瘤药物药效学实验方法及指导原则 一、基本原则 1. 抗肿瘤药物分类 (1) 细胞毒类药物(cytotoxic agent)：包括干扰核酸和蛋白质合成、抑制拓扑异构酶及作用于微管系统的药物等； (2) 生物反应调节剂(biological response modifier)； (3) 肿瘤耐药逆转剂(resistance reversal agent)； (4) 肿瘤治疗增敏剂(oncotherapy sensitizer)； (5) 肿瘤血管生成抑制剂(tumor angiogenesis inhibitor)； （6）分化诱导剂(differentiation inducing agent)； (7) 生长因子抑制剂(growth factor inhibitor)； （8）反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide) 。 2. 抗肿瘤药物药效学需研究内容 2.1 包括体外抗肿瘤试验，体内抗肿瘤试验。 2.2 评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以做出正确的结论。 2.3 I类抗肿瘤新药应进行药物作用机制初步研究。 二、体外抗肿瘤活性试验 1. 试验目的 1.1 对候选化合物进行初步筛选； 1.2 了解候选化合物的抗瘤谱； 1.3 为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等。 2. 试验方法 选用10-15株人癌细胞株，根据试验目的选择相应细胞系及适量的细胞接种浓度，按常规细胞培养法进行培养；推荐使用四氮唑盐MTT还原法、XTT 还原法、磺酰罗丹明B(SR染色法、或51Cr释放试验、集落形成法等测定药物的抗癌作用。
基因文库中目的基因的筛选
基因文库中目的基因的筛选 克隆基因的方法有很多，根据研究基础的不同，可以使用以下的方法克隆目的基因： 1. PCR或RT-PCR法 2. 从基因文库中分离基因 3. 从cDNA文库中分离基因 4. 转座子标签法 5. 图位克隆法 6. 差减杂交法、扣除杂交、差异显示法 7. 人工合成法 本章中主要介绍从基因文库中筛选目的基因的几种方法。 获的目的克隆的方法有两种 1）目的基因的直接选择 2）从基因文库中筛选 称为鸟枪射击法，建立一个包含所有基因或大部分基因的克隆，从中筛选目的克隆。 一、直接选择 直接选择的基因比较少，如抗生素抗性基因。如克隆一个kan抗性基因，在R6-5质粒上含有四种抗性基因：kan, 氯霉素、链霉素、硫胺类药物，kan抗性基因存在于13个EcoRI片段中的一段中。将R6-5的片段插入pBR322的EcoRI位点中，连接混合物中将含有13个不同片段的大量重组拷贝，其中部分是kan抗性的。只有含kan的克隆才能在含有kan的培养基上正常生长。 1.1 标记援救可以扩大直接选择的范围 利用E. coli的突变系可扩展该项技术。例如要从E. coli中克隆trpA基因，编码色氨酸合成
酶，一个突变系不能合成色氨酸，只有加入色氨酸后才能存活。因此E. coli的突变体可以用来克隆trpA基因。首先从一个正常个体中提取总DNA，然后酶切，连接产生大量重组DNA分子，其中一个将携带完整的trpA基因。连接混合物用来转化缺陷型E. coli细胞，大部分转化子是缺陷型的，携带trpA的重组子将是野生型的，可以在基本培养基上生长。 1.2 标记援救的范围和限制 存在两个限制因素： 1）必须存在着目的基因的突变品系 2）需要一种只有野生型能够生长的培养基。 一般而言，标记援救适用于微生物的合成酶，可以在基本培养上选择。
基因突变习题
1 、基因突变常发生在细胞周期的 A ：分裂间期 B ：分裂期前期 C ：分裂期后期 D ：在分裂期的各个时期都有可能 请选择答案： A:B:C:D: 2 、下列基因突变叙述中正确的是[ ] ①基因突变包括自然突变和诱发突变 ②在DNA复制中，碱基排列顺序发生差异，从而改变了遗传信息，产生基因突变 ③基因突变一般对生物是有害的，但是，也有的基因突变是有利的 ④基因自由组合使生物产生新基因 A ：A．①②③④ B ：B．①②③ C ：C．①②④ D ：D．②③④ 请选择答案： A:B:C:D: 3 、在下列几种育种方法中，可以改变原有基因分子结构的育种方法是 A ：杂交育种 B ：诱变育种 C ：单倍体育种 D ：多倍体育种 请选择答案： A:B:C:D: 4 、通过人工诱变培育的新类型是 A ：无籽番茄 B ：矮秆抗锈病小麦 C ：无籽西瓜 D ：青霉素高产菌株 请选择答案： A:B:C:D: 5 、下列叙述中，不属于诱变育种优点的是 A ：可以提高变异的频率 B ：育种年限显著缩短 C ：大幅度改良某些性状 D ：需大量处理供试材料 请选择答案： A:B:C:D:
6 、下列人类疾病中不是由基因突变引起的是 A ：白化病 B ：血友病 C ：侏儒症 D ：镰刀型盆血症 请选择答案： A:B:C:D: 7 、下列各项中可能产生新基因的是 A ：用离体花药培养玉米植株 B ：用秋水仙素得到三倍体西瓜 C ：通过杂交培养抗病小麦品种 D ：用X射线处理青霉素菌种 请选择答案： A:B:C:D: 8 、若一对夫妇所生育子女中，性状差异甚多，这种变异主要来自 A ：基因突变 B ：基因重组 C ：环境影响 D ：染色体变异 请选择答案： A:B:C:D: 9 、杂交育种依据的主要遗传学原理是 A ：染色体变异 B ：基因连锁互换 C ：基因自由组合 D ：基因突变 请选择答案： A:B:C:D: 10 、进行无性生殖的生物，可遗传的变异来源是 A ：基因重组和基因突变 B ：基因重组、基因突变、染色体变异 C ：基因突变、染色体变异 D ：基因重组、染色体变异 请选择答案： A:B:C:D: 11 、在育种实验中，将纸袋套在花上的目的是 A ：保持开花的温度和水分 B ：防止花粉成熟后散失 C ：防止自花传粉 D ：防止外来花粉的干扰 请选择答案： A:B:C:D: 12 、
抗肿瘤药物体内筛选试验标准操作规程(SOP)
抗肿瘤药物体内筛选标准操作规程概述： 抗肿瘤药物是指能够直接杀伤或抑制肿瘤细胞生长或增殖的一类药物，作用机制包括抑制肿瘤细胞核酸或蛋白质的合成、干扰大分子物质代谢、干扰微管系统、抑制拓扑异构酶等。 本操作规程包括与抗肿瘤药物申请临床试验和申请上市有关的非临床有效性和安全性研究的内容，其中着力强调非临床有效性和安全性之间的关联性，以及非临床研究和临床试验之间的关联性。旨在一方面为抗肿瘤药物的非临床研究提供技术参考；另一方面，通过技术要求引导科学有序的研发过程，使国内此类药物的研发更趋规范和合理。 本操作规程仅代表目前对抗肿瘤药物非临床研究的一般性认识。具体药物的非临床研究应在本指导原则的基础上，根据药物的自身特点制订研究方案。 研究目的： 建立一套包括抗肿瘤药物体内作用的药效学研究和评价体系及相应的标准操作规程以 及抗肿瘤药物安全性和作用新机制的研究。 ①有效性研究 抗肿瘤药物有效性研究的目的主要在于探索受试物的作用机制、作用强度、抗瘤谱等，为之后的安全性评价以及临床试验中适应症、给药方案的选择提参考信息。 ②安全性评价 安全性评价的目的主要包括：（1）估算 I 期临床试验的起始剂量；（2）预测药物的毒性靶器官或靶组织；（3）预测药物毒性的性质、程度和可逆性；（4）为临床试验方案的制订提供参考。 研究计划： (a)小鼠急性毒性测试
按照急性毒性测试的常规方法，选用昆明种小鼠，通过腹腔注射方式给药，测定体外抗肿瘤活性突出的化合物的半数致死量（LD50），参考给药小鼠体重变化情况，评价化合物的急性毒性，并确定小鼠体内抗肿瘤活性测试的给药剂量。 (b)小鼠体内抗肿瘤活性测试 根据动物体内抗肿瘤活性测试的标准方法，选用昆明种小鼠，皮下接种肉瘤S180或肺癌H22瘤株，选择体外活性突出且急性毒性较低的化合物，设定合适的剂量通过腹腔注射方式给药，以临床常用抗肿瘤药物环磷酰胺作为阳性对照药物，测定肿瘤生长抑制作为体内活性评价指标。 (c)专利保护范围内的化合物的继续合成 申请保护范围较大的专利，合成部分可能具有良好活性的新的化合物，拓展研究范围，发现活性更强的化合物，并申请新的发明专利。并可针对具体化合物申请从属专利，延长高活性化合物的保护期限。 （d）体外抗肿瘤活性的广泛筛选 采用MTT法或台盼蓝染色法，测定化合物对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性，确定化合物在不同瘤株间抗肿瘤活性的选择性，为裸鼠模型实验提供依据。 （e）抗肿瘤作用机理的深入研究 根据抗肿瘤（f）人癌裸鼠移植瘤模型实验活性化合物作用机理特征，选用微管蛋白聚合等实验从分子水平确认化合物的作用机理；利用人脐静脉血管内皮细胞探讨化合物对内皮细胞骨架的影响及诱导凋亡的途经，从细胞水平上阐明化合物的作用机理。 根据抗肿瘤新药审批办法的要求，采用裸小鼠皮下接种模型和/或原位移植瘤模型，以相对肿瘤增值率和生存时间为指标，确定化合物的抗肿瘤活性。 （g）动物体内药物代谢动力学实验
易错pcr获得木聚糖酶xynh突变株筛选.doc
易错pcr获得木聚糖酶xynh突变株筛选 易错pcr获得木聚糖酶xynh突变株筛选 （一）项目简介 易错pcr技术是在采用dna聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。 木聚糖水解酶系是一类降解木聚糖的酶系，包括β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-l-阿拉伯糖苷酶、α-d-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶，可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素。 易错pcr技术获得木聚糖酶xynh突变株筛选，是通过易错pcr技术使木聚糖酶发生突变，从突变株中筛选出木聚糖酶的降解能力、耐热性、酶活性提高的突变株，这些突变株就是我们所需的突变株。 （二）国内外研究现状和发展动态 1.国内外研究现状 木聚糖酶可以应用在酿造、饲料工业中。木聚糖酶可以分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料用粮中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，并因而更易取可溶性脂类成分。 国外对木聚糖酶的研究开始的较早。sorensen，1955年就对动物瘤胃和土
壤中的木聚糖酶进行了研究。1992年就已实现了木聚糖酶的工业化生产。目前国际上研究工作主要集中在对微生物木聚糖酶的诱导与调节机理研究，以及酶的提纯、鉴定方法，木聚糖酶基因分子的克隆和表达等（neeta 等，1999；raffaele等，2004）。自上世纪七十年代末开展木聚糖酶基因的研究工作以来，已有150多种来自真菌和细菌的木聚糖酶基因被克隆并在大肠杆菌中表达。 我国在木聚糖酶方面的研究起步较晚，但发展迅速。上世纪八十年代初期，中国科学院微生物所在张树政院士(曾宇成等，1987)的带领下，开始了我国对木聚糖酶的早期研究工作，首次从海枣曲酶（aspergillus phoenicis）中纯化得到了四种木聚糖酶：酶i、酶ⅱ、酶ⅲ和酶ⅳ，并深人研究了活力较高的组分酶ⅲ的酶学性质。“九五”期间，山东大学微生物技术国家重点实验室曲音波教授等（曲音波等，2001）开展了木聚糖酶在造纸方面的应用研究，从碱性假单胞菌sp. g6-2分离出两种木聚糖酶xyna和xynb。目前，我国对木聚糖酶的研究大多停留在产酶菌株的筛选和驯化、木聚糖酶的纯化和理化性质研究方面，部分课题已涉及木聚糖酶的分子生物学研究、木聚糖酶基因克隆、表达和重组。 2.发展动态 国内外目前对木聚糖酶的研究，主要是提高木聚糖酶的耐热性及低温酶活性。 木聚糖酶原酶在国内外市场的发展迅速，占了酶制市场份额的12%左右。世界上规模化生产木聚糖酶的国家有许多，例如：丹麦、爱尔兰、芬兰、
抗肿瘤药物体内筛选试验标准操作规程(SOP)
抗肿瘤药物体内筛选标准操作规程 概述： 抗肿瘤药物是指能够直接杀伤或抑制肿瘤细胞生长或增殖的一类药物，作用机制包括抑 制肿瘤细胞核酸或蛋白质的合成、干扰大分子物质代谢、干扰微管系统、抑制拓扑异构酶等。 本操作规程包括与抗肿瘤药物申请临床试验和申请上市有关的非临床有效性和安全性 研究的内容，其中着力强调非临床有效性和安全性之间的关联性，以及非临床研究和临床试 验之间的关联性。旨在一方面为抗肿瘤药物的非临床研究提供技术参考；另一方面，通过技术要求引导科学有序的研发过程，使国内此类药物的研发更趋规范和合理。 本操作规程仅代表目前对抗肿瘤药物非临床研究的一般性认识。具体药物的非临床研究 应在本指导原则的基础上，根据药物的自身特点制订研究方案。 研究目的： 建立一套包括抗肿瘤药物体内作用的药效学研究和评价体系及相应的标准操作规程以 及抗肿瘤药物安全性和作用新机制的研究。 ①有效性研究 抗肿瘤药物有效性研究的目的主要在于探索受试物的作用机制、作用强度、抗瘤谱等， 为之后的安全性评价以及临床试验中适应症、给药方案的选择提参考信息。 ②安全性评价 安全性评价的目的主要包括：（1）估算I期临床试验的起始剂量；（2）预测药物的毒性靶器官或靶组织；（3）预测药物毒性的性质、程度和可逆性；（4）为临床试验方案的 制订提供参考。 研究计划： （a）小鼠急性毒性测试 按照急性毒性测试的常规方法，选用昆明种小鼠，通过腹腔注射方式给药，测定体
外抗肿瘤活性突出的化合物的半数致死量（LD5o），参考给药小鼠体重变化情况，评价化合物的急性毒性，并确定小鼠体内抗肿瘤活性测试的给药剂量。 （b）小鼠体内抗肿瘤活性测试 根据动物体内抗肿瘤活性测试的标准方法，选用昆明种小鼠，皮下接种肉瘤 S180或肺癌H22瘤株，选择体外活性突出且急性毒性较低的化合物，设定合适的剂量通过腹腔注射方式给药，以临床常用抗肿瘤药物环磷酰胺作为阳性对照药物，测定肿瘤生长抑制作为体内活性评价指标。 （c）专利保护范围内的化合物的继续合成 申请保护范围较大的专利，合成部分可能具有良好活性的新的化合物，拓展研究范围， 发现活性更强的化合物，并申请新的发明专利。并可针对具体化合物申请从属专利，延长高活性化合物的保护期限。 采用MTT法或台盼蓝染色法，测定化合物对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性，确 定化合物在不同瘤株间抗肿瘤活性的选择性，为裸鼠模型实验提供依据。 （e）抗肿瘤作用机理的深入研究 根据抗肿瘤（f）人癌裸鼠移植瘤模型实验活性化合物作用机理特征，选用微管蛋白 聚合等实验从分子水平确认化合物的作用机理；利用人脐静脉血管内皮细胞探讨化合物对内 皮细胞骨架的影响及诱导凋亡的途经，从细胞水平上阐明化合物的作用机理。 根据抗肿瘤新药审批办法的要求，采用裸小鼠皮下接种模型和/或原位移植瘤模型, 以相对肿瘤增值率和生存时间为指标，确定化合物的抗肿瘤活性。 （g ）动物体内药物代谢动力学实验 选择在人癌裸鼠移植瘤模型实验中活性良好的化合物，开展动物体内药物代谢动力学实验，考查化合物的吸收、分布、代谢、排泄性质。 （h）动物亚急性，长毒实验 根据抗肿瘤新药审批办法的要求，测定动物亚急性、长毒性质，进行药物安全性评价。 基本方法: ①小白鼠的灌胃法
抗药性突变株的获取和突变率测定
实验名称：抗药性突变株的获取 和突变率测定 姓名： 学号： 系别： 实验日期： 同组同学名单:
本实验利用紫外线诱变，获得大肠杆菌的链霉素抗性突变株，学习了解微生物诱变育种的基本技术。试验后，通过计算紫外照射造成的死亡率以及自发突变频率和诱导条件下突变频率，进一步加深对紫外诱导的认识。 【实验目的】 1.掌握获取细菌自发和经诱变产生的突变株的基本方法。 2.了解突变株频率和突变率的计算。 3.了解微生物诱变育种的基本技术。 4. 【实验材料】 1.菌种大肠杆菌（E. coli） 2.培养基及试剂牛肉膏蛋白胨液体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基、蒸馏水、链霉 素（母液10 mg/mL；终浓度10 μg/mL）。 3.仪器及用具三角瓶（300 mL）、9 cm培养皿、6 cm培养皿、离心管（1.5 mL）、恒 温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、大头针、涂布器、酒精灯 【实验方法及步骤】 （一）出发菌株培养液的制备 1. 取斜面或冻存菌种划平板，获得单克隆一个。 2. 取单克隆，37°C条件下在牛肉膏蛋白胨液体培养基培养8~24h；稀释培养液， 取102 ~103 个细菌个体转移到新鲜牛肉膏蛋白胨液体培养基，过夜培养。 （二）培养基的制备 倒牛肉膏蛋白胨固体培养基平板（非选择性培养基），以及含有链霉素的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板（选择性培养基平板；链霉素终浓度10 μg/mL，在倒平 板前加入到培养基中） （三）自发突变的测定 取过夜培养液，稀释106倍（用1.5mL离心管装0.99mL 无菌蒸馏水，将10 μL 培养液加入到0.99 mL蒸馏水，震荡或吹打混匀，连续三次），取100μL 涂布在非
实验十抗性菌株筛选
实验十用梯度平板法筛选大肠杆菌抗药性突变株 【实验目的】：了解并熟悉抗药性突变株的筛选原理和方法 【实验原理】：经诱变处理后的微生物群体中，虽然突变的数目大大增加，但所占的比例仍然是整个群体中的极少数。为了快速、准确地得到所需的突变体，必须设计一个合理的筛选方法，以杀死大量的未发生突变的野生型，而保留极少数的突变型。 梯度平板法是筛选抗药性突变型的一种有效简便方法，其操作要点是：先加入不含药物的培养基，立即吧培养皿斜放，待培养基凝固后形成一个斜面，再将培养皿平放，倒入含一定浓度药物的培养基，这样就形成一个药物浓度梯度由浓到稀的梯度培养基，然后再将大量的菌液涂布于平板表明上。经培养后，在高浓度药物处出现的菌落就是抗药性突变型菌株。【材料和器皿】： （1）菌种：大肠埃希氏菌 （2）培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，2×（2倍浓度）牛肉膏蛋白胨培养液（分装于小三角瓶中，每瓶装20ml），生理盐水。 （3）器皿：培养皿，涂布棒，移液管，滴管，离心机 【方法和步骤】： 1 制备菌液 从已活化的斜面菌种上挑一环大肠埃希氏菌于装有5ml牛肉膏蛋白胨培养液的无菌离心管中（接2支离心管），置37℃条件下培养16h左右，离心（3500r/min，10min），弃去上清液后再生理盐水洗涤2次，弃去上清液，重新悬浮于5ml的生理盐水中。并且将2支离心管的菌液一并倒入装有玻璃珠的三角瓶中，充分振动以分散细胞，制成108/ml的菌液。然后吸3ml菌液于装有磁力搅拌棒的培养皿中。 2 紫外线照射 （1）预热紫外灯：紫外灯功率为15W，照射距离30cm。照射前先开灯预热30min。 （2）照射：将培养皿放在磁力搅拌器上，先照射1min后再打开皿盖并计时，当照射达2Min 后，立即盖上皿盖，关闭紫外灯。 3 增殖培养（在暗室红灯下操作） 照射完毕，用无菌滴管将全部菌液吸到含有3ml 2×牛肉膏蛋白胨培养液的小三角瓶中，混匀后用黑纸包裹严密，置37℃培养过夜。 4 制备梯度培养皿 取10ml 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基于直径9cm的培养皿中，立即将培养皿斜放，使高处的培养基正好位于皿边与皿底的交接处。待凝固后，将培养皿平放，在加入含有链霉素（100μg/ml）的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基10ml。待凝固后，便得到链霉素从到0逐渐递减的浓度梯度培养皿。然后在皿底做一个“↑”符号标记。 5 涂布菌液 将增殖后的菌液进行离心（3500r/min，10min），弃去上清液，再加入少量生理盐水（约0.2ml），制成浓的菌液后将全部菌液涂布于梯度培养皿上，并将它倒置于37℃恒温箱中培养24h，然后将出现于高药物浓度区内的单菌落分别接种到斜面上，经培养后再做抗药性测定。 6 抗药性测定 （1）制备含药平板：取链霉素溶液（750μg/ml）0.2、0.4、0.6、0.8ml，分别加到无菌培养皿中，再加入融化并冷却到50℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基15ml，立即混匀，平置凝固后即成一个对照平板（不含药物）。 （2）抗药性的测定：将上述每个皿底的外面用记号笔画成8等分，并注明1~8号，然后将
基因突变的检测方法
基因突变的检测方法
基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一，检测方法也随之迅速发展。人类细胞癌基因的突变类型已如上所述，对于基因突变的检测，1985以前，利用Southern印迹法，可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式。对于用该法法不能检测的突变，只能应用复杂费时的DNA序列测定分析法。多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是突变研究中的最重大进展，使基因突变检测技术有了长足的发展，目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上，并且由PCR衍生出的新方法不断出现，目前已达二十余种，自动化程度也愈来愈高，分析时间大大缩短，分析结果的准确性也有很大很提高。其中包括单链构象多态性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和异源双链分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法，可根据检测目的和实验室条件选择时参考。 PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率。由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时，突变检出率可达70％-95％，片段大于400bp时，检出率仅为50％左右，该法可能会存在1％的假阳性率。应用PCR-SSCP法应注意电泳的最佳条件，一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响，同时该法不能测定突变的准确位点，还需通过序列分析来确定。Sarkar等认为对于大于200bp的片段，用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度。应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因，也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法，仅检测第5-8外显子即可发现85％以上的p53基因突变。由于该法简便快速，特别适合大样本基因突变研究的筛选工作。 异源双链分析法（HA） HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率。该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一些不能用SSCP 检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100％。 突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点，如K-ras基因第12密码子的BstNI位点，第13密古巴子有BgⅠⅡ位点。用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第12、13密码子的DNA片段，在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。 变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR 产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程
紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选
紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选 姓名：张鑫淼班级：生工1301 一．实验目的 以紫外线处理细菌细胞为例，学习微生物诱变育种的基本技术。 了解细菌抗药性突变株的筛选方法 二．实验材料 菌株：大肠杆菌（Escherichia coli） 培养基：营养肉汤（nutrient broth）固体和液体培养基 试剂：2mg/ml链霉素，（Str）母液，无菌生理盐水。 仪器：1ml的移液管17个，10ml移液管11个，无菌试管9个，无菌培养皿15个，无菌三角瓶7个（其中一个内有无菌的玻璃珠20~40粒），无菌漏斗（内有两层擦镜纸），无菌离心管1个，离心机，紫外诱变箱等 营养肉汤蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g蒸馏水1000mLpH 7.4 营养琼脂蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15～20g蒸馏水1000mL 三．实验原理 以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w 的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA 分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产和科研中可利用此法获得突变株。 链霉素属氮基糖昔类抗生素，其杀菌机理是作用于核糖体小亚基，使其不能与大亚基结合组成有活性的核糖体，从而阻断细菌蛋白质的合成。细菌对链霉素产生抗药性的作用机理一般是由于编码核糖体蛋白S12的rpsL基因或其他基因发生突变，导致相应的核糖体蛋白发生改变，是蛋白质合成不再受链霉素抑制。 四．实验内容与操作步骤 （一）出发菌株菌悬液的制备 1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16~24h； 2. 将活化后的菌株接种于液体培养基，37℃ 110rpm振荡培养过夜（约16h），第二天，以20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基，继续培养2~4h； 3. 取1ml培养液与1.5ml离心管中，10000rpm离心3~5min，弃去上清液，加1ml无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液； 4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内（预先加入9ml无菌生理盐水），振荡20~30min，以打散细胞； 5. 取诱变前的0.5ml 菌悬液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注营养琼脂平板，每一梯度倾注两皿，每皿加1ml菌液，37℃倒置培养24~36h，进行平板菌落计数。同时选取合适浓度的菌悬液0.1ml涂布营养琼脂+Str平板（Str终浓度8ug/ml），37℃倒置培养24~36h,进行诱变前抗药菌落计数。 （二）UV诱变 1. 将紫外灯打开，预热30min； 2. 取直径6cm的无菌培养皿（含转子），加入菌悬液5ml，控制细胞密度为107~108个/ml；
多肽类抗肿瘤药物研究进展
多肽类抗肿瘤药物研究进展 【摘要】目前，恶性肿瘤已严重威胁人类的健康，传统的手术、化疗、放疗等治疗手段不仅选择性低，毒副作用大，且易产生耐药性。而多肽具有良好的靶向性，且分子量小、来源广泛，具有低毒性、易于穿透肿瘤细胞且不产生耐药性的优点。抗肿瘤活性肽可特异性结合并作用于肿瘤组织，与肿瘤生长转移相关的信号转导分子相互作用，从而抑制肿瘤生长或促进肿瘤细胞发生凋亡。本文将从抗肿瘤多肽药物的来源、作用机制及发展现状进行概述。 【关键词】多肽来源抗肿瘤作用机制 恶性肿瘤是一类严重威胁人类健康和生命的疾病，仅次于心血管疾病，每年死于癌症的患者约占总死亡人数的1/4，且中国占相当庞大的病例数。药物治疗是当今治疗肿瘤的主要手段之一，但目前的抗肿瘤药物不良反应较大。对此，寻找新型高效低毒的抗肿瘤药物一直是国内外医药研发的热点。随着免疫和分子生物学的发展，以及生物技术与多肽合成技术的成熟，人们发现多肽类药物不仅毒性低、活性高、易于吸收，还可以通过提高机体免疫功能抑制肿瘤的生长和转移，增强抗肿瘤作用，而且其广泛存在于动物、植物、微生物体内，因此，越来越多的多肽药物被开发并应用于临床。 一、抗肿瘤多肽的来源 1、天然来源的抗肿瘤活性肽 天然活性多肽是存在于动物、植物和微生物等生物体内的一类生物活性肽，可经过特殊提取分离工艺直接得到。近年来，对某些多肽经修饰加工后发现其具有显著的抗肿瘤作用，它们可针对肿瘤细胞发生、发展的不同环节，特异性杀伤、抑制肿瘤细胞，显示出极好的应用前景。 1.1微生物源抗肿瘤多肽 微生物源抗肿瘤多肽主要是指广泛存在于生物体内的一种小分子多肤，它们是非核糖体合成的抗菌肽，如多黏菌素(polymyxin)、杆菌肽(bacitracin)、短杆菌肽(gramicidin)等，主要是由细菌产生，并经结构修饰而获得，这类微生物产生的抗菌多肽的研究近年来取得了较大的进展。 细菌抗菌肽又称细菌素，是最常见的一类抗菌肽，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均可分泌。细菌中已发现杆菌肽、短杆菌肽S、多黏菌素E和乳链菌肽(Nisin) 4种类型抗菌肽，能特异性杀死竞争菌，而对宿主自身无害。例如[1]，枯草芽孢杆菌可以产生多种抗微生物物质，如表面活性素(surfactin)，该物质具有抗病毒、抗肿瘤、抗支原体、抗真菌活性和一定程度的抗细菌活性。除此之外，人们还发现某些抗菌肽对部分病毒、真菌和癌细胞等有杀灭作用，甚至能提高免疫力、加速伤口愈合。 1.2动物源抗肿瘤多肽 动物源多肽主要是指从哺乳动物、两栖动物、昆虫中分离提取出来的抗肿瘤多肽。如，有些哺乳动物来源的抗肿瘤多肽对淋巴瘤细胞有较强的抗肿瘤活性且免疫原性低；此外，还有Berge [2]等通过体内实验验证来源于牛科动物乳铁蛋白Lfcin B的9肽LTX-302 ( WKKWDipKKWK )的抗肿瘤效果，结果表明其对淋巴瘤细胞A20具有抗肿瘤活性，IC50为16 μmol·L￣1。 多数研究表明，从天蚕中分离出的天蚕素Cecropins具有较强的抗肿瘤活性。Cecropin A 和Cecropin B对膀胱癌细胞有选择性细胞毒作用，以剂量依赖的方式抑制膀胱癌细胞增殖，对所有膀胱癌细胞系的IC50为73.29~220.05 μmol·L￣1，它们的作用机制可能是破坏靶细胞膜导致不可逆的细胞溶解和细胞破坏[3]。