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基因工程在番茄抗病毒病育种中的应用

基因工程在番茄抗病毒病育种中的应用

孙 敏① 张华峰② 康 慧② 仪 宏② 

(①河北省化工医药职业技术学院,②河北科技大学生物科学与工程学院)

关键词 番茄 基因工程 病毒病 抗性

番茄是重要的蔬菜和水果.罹患病毒病常使番茄生产遭受重大损失.传统育种在番茄抗病毒病方面往往难以奏效,于是人们开展了大量番茄抗病毒病基因工程研究.本文介绍了番茄抗病毒基因的常规转化系统,总结了番茄抗T M V基因工程的研究进展,着重综述了基因工程在番茄抗C M V育种和复合抗病育种中的应用进展.展望了番茄抗病毒病基因工程的技术策略以及基因工程在番茄抗病毒病育种中的应用前景.

番茄病毒病是一种世界性的病害[1].长期以来,番茄病毒病一直是影响番茄高产、稳产、优质的主要因素之一.自1909年美国发现第一种番茄病毒———T M V(烟草花叶病毒)以来,世界各地共相继报道了近30种可侵染番茄的病毒.据调查,我国番茄病毒病的主要毒原为T M V、C M V(黄瓜花叶病毒)、PVX(马铃薯X病毒)和PVY (马铃薯Y病毒)[2].病毒病传播广、危害重,又几乎无药可治,这就使得抗病毒病育种成为消除番茄病毒病威胁的主要策略.然而传统的育种艰苦费时,从而大大限制了育种工作的进展.与之相比,基因工程育种具有明显的优越性:①育种周期短;②适用范围广,尤其适用于传统育种因缺乏抗原而难以进行的抗C M V育种;③在育种过程中不会带入其他不良农艺性状的基因等.因此,基因工程在番茄抗病毒病育种中的应用日益受到人们的重视.

一、番茄抗病毒病基因工程

1.番茄抗CMV基因工程

C M V是一种危害严重、传播广泛的蚜传病毒,能侵染单子叶和双子叶植物的85科365属中的800多种植物[1],素有植物界“流感”、“癌症”之称.我国对C M V十分重视,先后将其列为“七五”、“八五”番茄抗病育种攻关项目,然而由于栽培番茄中很难找到抗原,致使传统育种进展极缓.20世纪80年代起,科学家们开始利用基因工程进行番茄抗C M V育种,取得了一系列成果.

(1)抗C M V基因的来源

获得适用的抗病毒基因是番茄抗病毒病基因工程的前提.利用基因工程将抗病毒基因导入番茄细胞的基因组,改变其遗传组成,即可获得抗病毒病转基因番茄.迄今为止,已经从番茄染色体中分离克隆出了9种抗病基因:C f-2、C f-4、C f-5、C f-9、C f-ECP2、Pto、Prf、I2和Fen.遗憾的是,这些基因所对应的病原均为细菌或真菌,没有病毒.Stam ova等[1]研究发现,野生番茄(L. chilense)的C M V抗性是由显性单基因控制的,该基因定位于番茄的第12号染色体上,但是尚未分离克隆出该基因.

1981年,我国科学家首先提出将病毒的卫星RNA (satRNA)用于植物病毒病防治.satRNA是一个在复制和包装时需要依赖辅助病毒(helper virus)的小分子RNA,它与辅助病毒在核酸序列上没有任何同源性,但是它的存在与复制能严重干扰辅助病毒的复制,因而被认为是病毒的分子寄生物.1987年,Harrison等首次将C M V的satRNA的cDNA转入番茄,获得了世界上第一株抗C M V 的转基因番茄.G al2On等[3]将C M V的satRNA和复制酶(replicase)基因导入番茄,也获得了抗C M V的转基因番茄.

病毒的外壳蛋白(CP)基因是目前应用最广泛的抗C M V基因[4].以往,人们通常以病毒外壳蛋白包被理论解释CP介导的保护作用.但是最近的研究却表明该理论并不完善.因此,CP介导的保护作用机制尚需继续深入研究.

(2)抗C M V转基因番茄的生物学特性

抗病毒病转基因番茄的生物学特性研究,是番茄抗病毒病育种的重要环节之一.研究发现,利用satRNA的cDNA获得的抗C M V转基因番茄人工接种C M V1个月后,未出现任何感染症状,而未转化的对照植株则明显呈现系统感染症状;2个月后,转化植株仅表现花叶症状,不矮化,可开花结果,病情指数为1~2级,而未转化

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的对照植株则严重矮化,叶片变为蕨叶,大多不能正常开花结果,病情指数高达4级(赵淑珍等,1990年).转C M V2CP基因的番茄植株对C M V侵染表现出显著的抗性,温室中接种C M V的转化植株无症率依次为:R1代94.0%,R2代95.1%,R3代95.4%,R4代95.0%,而对照的未转化植株则依次为:R1代10.0%,R2代0%,R3代5.3%,R4代0%;大田中自然发病的转化植株的无症率亦显著高于对照的未转化植株[5].

周北雁等[4]把从大田C M V主流病毒株系中克隆得到的C M V-CP基因导入番茄,经连续选择后得到了纯合转基因番茄株系.人工接种试验表明,该株系田间表现和农艺性状良好,并且抗C M V性状可稳定遗传.目前,该番茄品种已获准在辽宁省进行商品化生产.

综上可见,利用基因工程获得的抗C M V转基因番茄具有明显的抗C M V特性.这些转基因番茄为番茄抗病毒病育种提供了极其有价值的种质资源,同时也证明,基因工程是番茄抗C M V育种的一条省时、高效而且可靠的新途径.

2.番茄抗TMV基因工程

T M V是番茄病毒病的第二大毒原,在我国北方发病尤为严重[2].T M V是一种正链RNA病毒,基因组全长6395个核苷酸[6].抗T M V基因的来源既可以是病毒[6],也可以是植物[7,8]等.目前,已从野生番茄中发现了3个抗T M V基因:T m-1,T m-2,T m-22(T m-2a)[8].1988年,Nelson等将T M V-CP基因导入番茄细胞的基因组,获得了抗T M V的转基因番茄.接种T M V的大田试验证明,该转基因番茄不仅对T M V有明显的抗性,而且对T oM V(番茄花叶病毒)也具有一定的抗性.程英豪等[6]将T M V的54×103蛋白cDNA转入番茄.DNA的酶联聚合反应PCR扩增和N orthern杂交结果表明,54×103蛋白基因已整合到番茄基因组上.人工接种T M V发现,未转化番茄2周后即出现花叶,并且随着时间的推移,花叶症状越发典型;而转基因番茄直到开花结果都未发病,即没有花叶出现.此外,植物N基因可使植物对某些病毒的侵染产生强烈的过敏性坏死斑反应.Whitham等将烟草N基因导入番茄,也获得了对T M V产生强烈过敏反应的转基因番茄.

3.番茄复合抗病性基因工程

人们发现,栝楼的TCS基因可编码一种具有广谱抗植物病毒活性的核糖体失活蛋白(RIP).利用基因工程将TCS基因导入番茄,获得了具有广谱抗番茄病毒活性的转基因番茄.人工接种T M V、C M V、T BRV(番茄黑环病毒)发现,转化植株的叶片未出现典型症状,而未转化的对照植株感染率达到50%~60%,表现出褪绿、环斑或局部坏死等症状[7].

毕玉平等构建了C M V-CP基因和T M V-CP基因的双价植物表达载体并转化番茄,获得了双抗C M V和T M V的转基因番茄.将转化植株定植到带有C M V和T M V活体毒源的温室中,40天后发现转化植株生长良好,能正常开花结果,无病症发生或感病很轻,而未转化的对照植株则出现感染症状,叶片严重卷曲.对双抗C M V和T M V转基因番茄后代进行遗传分析,发现T1代转化植株中有C M V-T M V双价CP基因的遗传和分离,其遗传行为符合显性单基因的孟德尔遗传,T2代部分植株的C M V-T M V双价CP基因获得稳定性遗传[9].王傲雪等[10]也采用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导的番茄遗传基因转化系统获得了一株同时表达C M V-CP基因和T M V-CP基因的转基因番茄植株.

提高番茄对多种病害的抗性、培育具有复合抗病性的番茄品种是番茄抗病毒病育种的重要方向.目前,这方面研究仍在深入进行.

番茄病毒病种类较多,除了抗T M V、C M V基因工程以外,各国学者还开展了抗其他病毒病的基因工程研究.Ultzen等将AIM V-CP基因转入番茄,获得了双抗TSW V(番茄斑萎病毒)和C M V的转化番茄.K unik等则获得了抗TY LCV的转基因番茄.

二、番茄抗病毒基因的转化系统

迄今为止,番茄抗病毒基因转化成功的例子主要是采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的植物遗传转化系统.王傲雪等[10]建立了发根农杆菌介导的番茄抗病毒基因遗传转化系统.研究发现,发根农杆菌介导的遗传转化系统的转化频率主要与番茄的基因型以及发根农杆菌的浓度有关,而外植体的部位对转化频率则没有显著影响.在国内外学者的共同努力下,番茄抗病毒基因的转化系统日臻完善和成熟.

1.农杆菌介导的番茄抗病毒基因转化程序

图1为农秆菌介导的番茄抗病毒基因转化程序框图.

2.外植体

番茄抗病毒病基因工程中常用的外植体为叶片、子叶或胚轴.外植体的种类、年龄和预培养等均可能影响转化频率.根据强弱排序,外植体的再生能力一般为:叶

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片>子叶>下胚轴,再生芽的发生速度按大小排序则为:下胚轴>子叶>叶片[11,12]

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基因工程在番茄抗病毒病育种中的应用

图1 农杆菌介导的番茄抗病毒基因转化程序

3.选择标记基因与报告基因

在番茄抗病毒病基因工程中,通常以卡那霉素(kan )

抗性基因(npt Ⅱ

)作为选择标记基因,以β-D -葡糖醛酸苷酶(G US )基因(gus )作为报告基因.研究发现,不同浓度的kan 对未转化番茄子叶叶盘分化具有不同的抑制作用.随着kan 浓度的增加,番茄愈伤组织分化率逐渐下降.因此,一般以50mg/L K an 作为番茄转化的最佳选择压.值得注意的是,由于番茄属于果蔬食品,因此,选择标记基因与报告基因的存在可能使消费者产生恐惧心理[13].由此推断,番茄抗病毒基因无标记(marker 2free )转化将可能成为今后的重要研究课题.

4.检测方法

抗病毒病转基因番茄的验证,必须要有分子生物学的证据,目前主要采用S outhern 杂交、N orthern 杂交、

Western 杂交、斑点杂交、PCR 以及E LISA 等方法(详见相

关文献).最终也最直观的检测方法是观察转基因番茄的抗病性表现.

三、展 望

1.番茄抗病毒病基因工程的技术策略

前文列举的番茄抗病毒基因转化成功的例子主要采用以下技术策略:①导入病毒的CP 基因[4];②利用病毒satRNA [3];③利用植物的抗病毒基因(如TCS 基因)[7];④利用病毒复制酶基因[3,6].但是近期的研究发现,前两种技术策略在抗病毒效果、机制或安全性方面存在一定的问题,这就要求人们不得不继续开创和完善番茄抗病毒病基因工程的技术策略.除上述技术策略外,番茄抗病毒病基因工程的技术策略还可以从以下几个主要方面拓展:①利用反义RNA 技术.业已获得了表达T M V 基因组3’端非编码区的反义RNA 的转基因烟草.②设计核酶(ribozyme )剪切病毒RNA.从理论上讲,任何生物的RNA 都可以作为核酶的底物.因此,只要已知番茄病毒RNA 序列,就可能设计出剪切它的核酶,并获得相应的转基因番茄.目前,已有学者开始这方面研究.③利用动物防御素基因.如前所述,目前番茄抗病毒基因主要来源于植物或病毒.事实上,某些动物防御素对多种细菌、真菌或病毒都具有抗性.将兔防御素基因NP

-1基因转入番茄,获得了抗青枯病的转化番茄[14].这

对于抗病毒病转基因番茄研究也具有一定的参考意义.④导入非结构性蛋白基因[15].⑤利用中和抗体技术.⑥利用病毒复制的干扰分子(DI ).

2.前景展望

基因工程日新月异,其在番茄抗病毒病育种中的作用与贡献也日益显现.据报道,我国培育的具有优良抗

C M V 特性的转基因番茄已被农业部批准进行商品化生

产[4].从基因工程已经取得的进展和目前的发展趋势可以预见,基因工程在番茄抗病毒病育种中大有作为.笔者认为,今后应注重以下几方面研究:①不断开创和完善番茄抗病毒病基因工程的技术策略.②培育具有复合抗病性的转基因番茄品种是今后的重要研究方向,但是必须注意转基因番茄遗传稳定性的研究.③组培是番茄基因工程育种研究的重要环节.笔者发现,在通过组培使外植体生长发育成植株的过程中,容易受到很多外界因素的影响,因此,必须重视番茄组培研究.④建立多种抗病毒基因的分子标记,并利用这些分子标记[16]快速准确地甄别组培苗中的转化番茄,加强分子生物学辅助育种.⑤注重转基因番茄的安全性研究.⑥将基因工程抗病毒病育种与传统育种结合起来,优势互补.

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致谢:本文承蒙河北科技大学工业生物技术研究室王丽丽副教授指教,深表谢忱.(2002年12月22日收到)

孙 敏 理学硕士,副教授,河北省化工医药职业技术学院,石家庄050031

张华峰 理学硕士,讲师,河北科技大学生物科学与工程学院,石家庄050018

康 慧 工学学士,河北科技大学生物科学与工程学院,石家庄050018

仪 宏 教授,院长,河北科技大学生物科学与工程学院,石家庄050018

1 S tam ova B.S.,Chetelat R.T.Theor Appl G enet,2000;101:5272537

2 孔庆国,于喜燕.长江蔬菜,2000;7:122

3 G al2On A.,et al.Phytopathology,1998;88:110121107

4 周北雁,李毅,陈章良.生物技术通报,1999;3:42245

5 施曼玲,薛宝娣.浙江农业科学,1999;6:2762279

6 程英豪等.北京师范大学学报(自然科学版),1999;35(1):93296 7 姜国勇等.园艺学报,1998;25(4):3952396

8 S obir,et al.Theor Appl G enet,2000;101:64269

9 单雷等.山东农业科学,1998;4:11212,21

10 王傲雪等.东北农业大学学报,2000;31(3):2332240

11 G isbert C.,et al.Journal o f Horticultural Science&Biotechnology, 1999;74(1):105210912 P ozueta2R omero J.,et al.Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2001;

67:1732180

13 K ai G.Y.,et al.Acta Botanica Sinica,2002;44(8):8832888

14 张秀海等.遗传学报,2000;27(1):9532958

15 Li HW,et al.EMBO J.,1999;18(10):268322691

16 田苗英等.植物病理学报,2000;30(2):1582161

Application of the G enetic E ngineering in B reeding for Tom ato R esistance to Viral Diseases

Sun Y i2min①,Zhang Hua2feng②,K ang Hui③,

Y i H ong④

①Master,Associate Pro fessor,H ebei Chemical Engineering and Medicine Col2 lege,Shijiazhuang050031

②Master,Lectuer,School o f Biological Science and Engineering,H ebei Uni2 versity o f Science and Technology,Shijiazhuang050018

③Bachelor,School o f Biological Science and Engineering,H ebei University o f Science and Technology,Shijiazhuang050018

④Pro fessor,Dean,School o f Biological Science and Engineering,H ebei Uni2 versity o f Science and Technology,Shijiazhuang050018

K ey w ords tomato,genetic engineering,viral disease,resistance

胚胎发育基因表达的时-空模式

朱新产 王宝维 张庭荣 (莱阳农学院生命科学学院)

关键词 胚胎发育 基因表达 时-空变化模式

精子和卵子的结合启动了胚胎发育,其一系列变化过程中最引人注目的是:①卵母细胞结构与卵裂球命运间的关系;②卵裂球获得定位或修饰中细胞遗传及相互作用的重要性;③胚胎细胞中迟早出现决定状态的性质.胚胎发育是基因选择性的按一定的时-空顺序模式表达的过程,某个基因在特定阶段的表达和在表达时间上的相对稳定性对发育中的相应细胞生长分化起着非常关键的作用[1,2],基因表达的变化决定着整个生命过程.

一、基因表达的变化

哺乳动物早期胚胎发育的特征表现是细胞分裂的增殖,基因差别表达和分化.其细胞分裂基本上属母型调控[3,4],即由源自卵母细胞发生期间合成的大量蛋白质和mRNA(母型物质)调控.母型物质的逐渐消耗,必然需要合子基因(ZG-zyg otic gene)的适时激活表达,以实现由母型向ZG调控的过渡.ZG表达的80%~90%转录本与母型mRNA相同,10%~20%转录本为不同于母型的新mRNA,于受精后的胚胎发育调控过渡中逐步表达和积累[5],因此ZG转录本包含着等同母型转录本的mRNA和ZG基因组新表达而在卵母细胞中不存在的mRNA.这些物质支持并指导了早期胚胎发育过程.

早期胚胎发育阶段,基因表达变化的最显著证据是1-cell胚胎的转录抑制、蛋白质合成阻断和第一次分裂后所有后续发育及2-cell胚胎期各类RNA合成的起动(ZG早期激活点)[6,7].合子基因激活(ZG A)诱导了基因组转录或特异阶段独立转录的RNA合成,转录的瞬间变化模式可预示卵裂的完成和最初差别细胞的形成[IC M (内细胞团)/TE(滋养外胚层)].哺乳动物早期胚胎发育将导致一个活性(感受态)可植入胚胎.胚胎似乎利用一

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