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KCM法转化大肠杆菌(我的方法)

转化大肠杆菌(KCM法)

(1)试剂

TSS 配方:10% PEG8000;5% DMSO;20 mmol/L MgSO4或MgCl2;以上各成分溶于LB培养液中定容至100 mL,过滤除菌。

5×KCM溶液配方(配置数毫升分装成小管,-20 ℃保存,可反复冻融):

0.5 M KCI,0.15 M CaCl2,0.25 M MgCl2

(2)大肠杆菌DH5 α感受态细胞的制备

A. 挑单菌落接于5 ml LB液体培养液过夜培养,按1%接种量接种于三角瓶中,培养菌至OD600 0.4~0.5;

B. 菌液冰浴1~2 min预冷细胞;

C. 用无菌预冷的离心管,4℃,5000 rpm离心5 min收集细胞;

D. 用20 ml冰浴的TSS重悬细胞;

E. 再次离心(5000 rpm离心5 min)沉淀细胞;

F. 用2.5ml预冷的TSS重悬细胞后分装至无菌Eppendorf管,-70℃保存。

(3)大肠杆菌转化

A. 将盛有感受态细胞的Eppendorf管置于冰上,使其缓慢融化;

B. 取一支Eppendorf管加入20 μl的5×KCM,5 μl 连接产物和75 μl ddH2O (质粒的话1-2μl,加ddH2O至80ul),混匀,放置冰上;

C. 向上述管中加入100 μl感受态细胞,混匀,冰上放置20 min;

D. 热激细胞(37℃5 min或42℃90S),加入1 ml 37℃预热的LB培养液,37℃震荡培养45min-1 h;

E. 取200 μl转化物在含有抗生素的LB培养基上涂板,剩余细胞离心沉淀后重悬,100 μl再次涂板,于37℃倒置培养过夜。

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