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Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统

Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统,大大简化基因克隆和亚克隆步骤,同时克隆效率高达95%,当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时,还可保证正确的方向和阅读框。

Gateway技术基于λ噬菌体位点特异重组系统(attB ×attP →attL ×attR)。BP和LR两个反应就构成Gateway技术,BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应,创建一个入门克隆;LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应,用于在平行的反应中把目的序列转移到一个或更多目的载体。Gateway技术也利用了ccdB选择方法,确保高效率的分离重组克隆。

完成构建Gateway表达克隆仅需两步:

⑴创建入门克隆,通过PCR将目的基因克隆进入门载体;⑵混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway LR Clonase,产生表达克隆(用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析)。

构建入门载体

PCR重组克隆

重组是从PCR产物创建Gateway入门克隆的一种方法。通过合并attB位点到上游和下游引物上,然后共同孵育扩增PCR产物和pDONR载体(包含attP位点)及GatewayBP ClonaseTM酶混合物。接着转化进大肠杆菌中,您将会获得包含目的基因的入门克隆,同时目的基因两侧具有attL重组位点。这个入门克隆可以与任何Gateway目的载体进行重组。

表达系统

一旦您构建好Gateway入门克隆,就可以使用Gateway技术进入到几乎是无数种的表达系统。 Gateway技术为进行基因功能分析和蛋白表达提供了广泛深入的方法,通过把目的基因转移到优化构建的体外表达载体,pEXP1-DEST 或pEXP2-DEST,然后开始体外蛋白合成。目前有很多具有不同启动子的大肠杆菌目的载体,提供一系列表达选择,Gateway目的载体也提供N端或/和C端融合标签的选择,简化表达蛋白的纯化和检测。

Gateway attR2, ccdB, CmR, attR1 orientation= WG ; gfp= F

将载体导入E. coli DB3.1中。载体中包含细菌中编码抗DNA促旋酶的ccdB 基因,E. coli DB3.1 中DNA促旋酶基因突变,从而ccdB蛋白无法结合突变体的DNA促旋酶,因此在此菌株中,DNA正常复制,克隆体生长。对于二聚体载体,可以使用奇霉素使构建体生长。