抗原偶联选择方法

载体的选择：

1.载体表面应首先应具有化学活性基团，这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶联，这

是化学偶联制备抗原的前提；

2.其次,载体应具备一定的容量,可以偶联足够的分子；

3.载体还应该是惰性的,不应干扰偶联分子的功能；

4.而且载体应具有足够的稳定性,且应该是廉价易得的.

载体蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等

这些蛋白质分子中的α和ε-氨基（等电点8和10）、苯酚基、巯基（等电点为9）、咪唑基（等电点为7）、羧基（等电点2～4,大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ-羧基）等在等电点pH条件下,一部分成为质子,另一部分未质子化的亲核基团则具有反应活性,可与半抗原中的对应基团结合.当然,这些基团的反应性也取决于蛋白质各种氨基酸残基的微环境.牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HAS）分子中含有大量的赖氨酸,故有许多自由氨基存在,且在不同pH和离子强度下能保持较大的溶解度.此外,这些蛋白质在用有机溶剂（如吡啶、二甲基甲酰胺）溶解时,其活性基团仍呈可溶状态,因此,这两种蛋白质是最常用的载体蛋白质.近年来,有研究报道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚赖氨酸)作载体,表现出能增加半抗原的免疫原性,从而使产生征对半抗原的特异性抗体可能性增加,被广泛应用。

人工抗原合成方法：

小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响.通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合,不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行.一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法,常用的方法如下：分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联

1）混合酸酐法（mixed anhydride method）：也称氯甲酸异丁酯法。偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride)，然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。

2）碳二亚胺法（CDI）：碳二亚胺(EDC)使羟基和氨基间脱水形成酰胺键,半抗原上的羧基先与EDC反应生成一个中间物,然后再与蛋白质上的氨基反应,形成半抗原与蛋白质的结合物（见图1.5）.EDC被称作零长度交联剂之一,因为它作为酰胺键的形成介质并没有形成手臂分子.

此连接方法十分简便,只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液中,然后加入水溶性碳化二亚胺,搅拌1～2h,置室温24h,再经透析即可。如果半抗原分子中不含羧基,可通过某些化学反应引入羧基.在引入羧基后,也可用上述方法进行偶联。

含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联

1）戊二醛法：双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiff键(-N=C<，在半抗原和蛋白质间引入一个5碳桥。这一反应条件温和，可在4～40℃及pH6.0～8.0内进行，操作亦简便，因此应用广泛。戊二醛受到光照、温度和碱性的影响，可能发生自我聚合，减弱其交联作用，因此最好使用新鲜的戊二醛。

2）重氮化法：用于活性基团是芳香胺基的半抗原，芳香胺基与NaNO2和HCl反应得到一个重氮盐，它可直接接到蛋白质酪氨酸羧基的邻位上，形成一个偶氮化合物。

含羟基半抗原的偶联

1）琥珀酸酐法：半抗原的羟基与琥珀酸酐在无水吡啶中反应得到一个琥珀酸半酯(带有羧基的中间体)，再经碳二亚胺法或混合酸酐法与蛋白质氨基结合，在半抗原与蛋白质载体间插入一个琥珀酰基。

2）羰基二咪唑法：N，N’-羰基二咪唑是引入羰基的高活性试剂，在肽合成中首次表明了是形成极好的酰胺键试剂[33]。含羟基的分子同羰基二咪唑反应，形成中间体咪唑基甲酸酯，它能和N-亲核试剂反应，得到N-烷基化的甲酸酯键，通常蛋白质通过N-端(α-氨基)和赖氨酸侧链的(ε-氨基)和分子形成不带电的类似尿烷的衍生物，具有极好的化学稳定性。

含巯基半抗原的偶联

可用马来酰亚胺方法与蛋白偶联。此外，将载体蛋白用溴乙酰胺激活。或将载体蛋白与半抗原在pH4.0的醋酸缓冲液中，通过过氧化氢的作用形成二硫键，也可以将半抗原连接到蛋白质分子上。

影响人工抗原质量的因素主要有：1) 偶联比2) 偶联桥3）半抗原的分子空间结

构

人工抗原的质量评定：

1.浓度测定（mg/ml，每ml抗原溶液中含有蛋白质多少mg）紫外吸收法、Folin-酚法、

双缩脲法、微量凯式定量法、染色结合法和荧光法

2.纯度鉴定和结构分析分配层析和电泳技术

3.偶联比的测定分光光度法标记抗原示踪法

反应实例

氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法

1、5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。

2、1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。

3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0，q然后4度过夜。

4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）、NaN3 0.02%(w/v)的缓冲液中。

碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤

1、取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液）

2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg , 用0.2mol/L NaOH溶液2ml 溶解(II液)

3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液）

4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下0.5ml）

5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液

6、4度搅拌12小时

7、静置10小时（4度）

8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原

芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤

1、用0.1 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。

2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。

3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。

4、用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。

5、边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。

6、冰箱中搅拌反应2小时，不断调节pH到9.0。

7、用PBS透析2天

8、-20度保存（浓度为20mg/mL）

解偶联蛋白2的功能调控方式

解偶联蛋白2的功能调控方式 解偶联蛋白（uncoupling protein，UCP）是线粒体内膜的一类线粒体载体蛋白。大量的研究结果显示，UCP功能的异常与多种疾病关系密切。UCP2是UCP的一种重要类型，现综述概括UCP2的主要功能调控方式以及这些调控的生理意义。 肥胖、动脉粥样硬化、糖尿病、免疫失调等慢性疾病是严重影响人民群众身心健康的重要公共卫生问题。深入探讨这些疾病发生的分子机制并在此基础上探索有效的防护措施具有重要的意义。解偶联蛋白（uncoupling protein，UCP）属于一类存在于线粒体内膜的线粒体离子转运体家族成员。近年的研究发现解偶联蛋白在前述多种慢性疾病的发生发展过程中发挥着重要作用。而其本身的功能又受到多种机制的调控，现对这方面的进展进行综述。 1 解偶联蛋白概述 线粒体是真核细胞内主要的供能细胞器，通过对底物的降解反应产生ATP。在这个过程中，通过质子电化学梯度将底物的氧化与A TP合成偶联起来。但这种偶联并不是绝对的，质子可以通过线粒体内膜漏出（质子漏）而不引起A TP的产生，这个过程中一部分氧化产生的能量最后以热量的形式被消耗掉。质子漏与解偶联蛋白相关联，通过允许质子进入线粒体基质的方式，解偶联蛋白使质子梯度下将，从而导致氧化呼吸链的解偶联以及热量的产生[1]。最具特征性的解偶联蛋白为UCP1，UCP1在1978年被鉴定并在1988年被首次克隆。UCP1表达于棕色组织，在寒冷和食物所导致的非寒战性产热过程中发挥重要作用[2]。1997年，2种与UCP1相似的基因被克隆并分别命名为UCP2和UCP3。随后又筛选出2种新的UCP1相似物，并被分别命名为UCP4和UCP5/BMCP[3]。在各种UCP中，UCP2的组织分布最为广泛。 2 UCP2功能概述 人类的UCP2基因定位于11号染色体，主要表达于脂肪组织、骨骼肌、脾、肺、胰腺的β细胞以及巨噬细胞。虽然结构与UCP1相似，但是干扰、抑制UCP2的表达不会导致肥胖以及对寒冷敏感性的升高[4]。关于UCP2是否参与对寒冷应答的研究结果不尽一致，一般认为它不是主要的产热调控因子。但当特定的效应因子激活时，UCP2同样可以发挥促进产热的作用。由于对偶联过程、活性氧产物（ROS）产生以及脂肪酸代谢等多方面都有着广泛的影响，UCP2已经被发现参与多种生理、病理过程，如糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、感染、衰老、肿瘤发生等。例如UCP2能够抑制β细胞分泌胰岛素，从而与Ⅱ型糖尿病有关[5]。UCP2诱导质子漏的一个重要作用是减少线粒体ROS的产生。UCP2的高表达可预防氧化损伤，而抑制UCP2的表达则可在多种细胞类型中促进氧化损伤[6]。此外，UCP2还通过缓解氧化应激抑制结肠癌以及动脉粥样硬化的发生[7]。 3 UCP2功能调控 3.1 遗传多态性在加拿大魁北克开展的一项人群研究发现UCP2基因的3个微随体与能量消耗有关[8]。此外，UCP2启动子866有一个G/A单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。而该SNP被证实与血液三酰甘油、总胆固醇以及低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）胆固醇水平有关[9]。在Ⅱ型糖尿病患者，866-A等位基因携带者的胰岛素分泌能力比G等位基因携带者要低得多[10]。在德国的高加索人中，携带同样等位基因的糖尿病患者神经病变发生危险性显著降低[11]。而在中国人、马来人以及印度人，携带同样等位基因者拥有更高的腰/臀比，同时代谢性综合征的危险性也增高[12]。虽然在女性韩国人866-G等位基因携带者UCP2的表达和转录水平都显著降低，同时具有更高的体重指数（body mass index，BMI）以及脂肪量[13]，拥有866-G等位基因的澳大利亚高加索人却拥有较低的血清三酰甘油以及较高的胰岛素敏感性水平[14]。另外，UCP2基因4号

关于半抗原制备的小结

关于半抗原制备的小结 小分子抗原现在做的最多的是农药和兽药，这方面的文献也很多。以前查过一些材料，作者觉得小分子抗原能否制备出高性能的单克隆抗体主要以下几点决定。 1、对于半抗原结构的选择，如果待测物本身含有NH ，COOH，OH等活性基团， 2 可以利用待测物活性基团加入间隔臂，然后联入载体蛋白就可以成功合成人工抗原，制备特异性良好的抗体。但大部分待测物上并不含有活性基团或活性基团对药物的特异性和极性影响很大，所以大部分用于人工抗原合成的半抗原要经过改造或从头合成。例如在关于有机磷农药倍硫磷的免疫检测方法的研究中，半抗原物的获得采用的合成方法并不是从倍硫磷开始合成，而是采用另一途径，从起始物重新合成，这样反而能取得较好的效果，这一点对于制备具有多残留检测能力的抗体来说更为重要，只需合成出几种待测药物共有的结构就有可能制备出具有多残留检测能力的抗体。 2、待测物本身的结构有时对建立方法的性能有很重要的影响，在分子量在111－1202Da的化合物制备的单克隆抗体的亲和系数的试验中，半抗原的分子量在334–374Da之间时，制备的单克隆抗体具有很高的亲和系数。但当要检测的小分子化合物的分子量小于300Da时，产生具有良好灵敏度和特异性单克隆抗体的可能性下降。这说明药物的分子量是影响抗体性能的重要因素。同时待测物的结构对于制备人工抗原的难易程度有重要影响，有些半抗原经过理论分析能制备出高质量的抗体，但从化学合成的角度，这些化合物可能是合成不出来的或工艺过于复杂，所以半抗原结构能否合成出来，也是半抗原结构设计过程中要考虑的问题。 3、如果待测物结构过于简单，可能也是不能建立免疫检测方法的。待测物的结构最好含有特征性的环状结构或侧链结构，甚至含有杂原子，都能够增加制备出高质量抗体的可能性。在对脂肪酸类物质制备抗体的试验中，对于脂肪酸类物质来说，如果含有两个以上的羰基，及与蛋白偶联之后还有多余的羰基增强亲水性，同时酰基的不饱和双键和极性的头部结构都可以做为B细胞的抗原决定簇，可以将其他抗原性很弱的部分变成强抗原性。再者如果脂肪酸含有平面结构，也可以作为抗原决定表位，使产生特异性的抗体。这说明小分子的极性以及不饱和键，

如何用碳二亚胺法将半抗原偶联到蛋白上

如何用碳二亚胺法将半抗原偶联到 【摘要】用碳二亚胺（EDC）法将14位羟基修饰的雷公藤内酯醇(TP)和不同的蛋白载体（阳离子化牛血清白蛋白、鸡卵清蛋白）偶联合成TP的人工免疫抗原和检测抗原，紫外光谱鉴定偶联效果，计算偶联率。利用免疫抗原免疫小鼠，制备小鼠多克隆抗体，用检测抗原分析血清抗体效价，利用抗原竞争ELISA分析抗体特异性，为进一步研究TP的分子作用机理以及制备TP的单克隆抗体奠定基础。 【关键词】雷公藤内酯醇；14位羟基修饰；人工抗原；多克隆抗体 雷公藤内酯醇（triptolide，TP）分子式C20H24O6，分子结构如图1，相对分子质量360.41，为二萜类三环氧内酯化合物，是从植物雷公藤（Tripterygium Wilfordii Hook.f.）中提取的有效成分里活性最强的部分，具有消炎散结、清热解毒、抗菌、免疫抑制以及抗生育等功效。长期以来，TP作为临床上公认的免疫抑制剂，主要用于各种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎以及器官移植排斥反应的治疗。近年来研究发现，该药对多种肿瘤细胞有诱导凋亡的作用，与化疗药物联合应用能协同杀伤肿瘤细胞或逆转肿瘤耐药，说明它具有抗肿瘤效果，因此在肿瘤治疗方面的应用也日益受到人们的关注。除此以外，它还对细胞发育增殖、细胞周期等有调控作用。近年来，国内外对TP具有如此广泛作用的分子机理产生了越来越浓厚的兴趣，从多个不同的角度进行了研究。但是，由于缺少方便快捷的TP检测手段，长期以来对TP直接作用位点的研究一直十分困难，对TP作用的靶蛋白和作用途径知之甚少。细胞免疫化学是追踪分子在细胞内作用过程的有力工具，如果能够得到TP的抗体，就为利用细胞免疫化学研究TP的作用靶点和在细胞内的定位等提供了分子探针，为最终研究TP作用机制和寻找其靶蛋白提供了可能。作为小分子半抗原，TP需要和大分子蛋白载体偶联才能成为能够诱导产生抗体的免疫原。为了不影响小分子的生物活性，提高偶联效率，我们需要选择合适的反应基团。已有的TP结构 活性研究显示，TP的不同生物效应依赖于不同的功能基团。研究证实，对于12，13位环氧进行开环反应所获得的稳定的衍生物雷公藤内酯三醇（triptriolide）会丧失免疫抑制和抗炎的生物活性。14位羟基是TP最容易被改造修饰的基团，研究表明，14位羟基被改造为水溶性的基团作为前药能极大改善小分子的水溶性，促进体内代谢，降低毒性，甚至能改善TP在体内的免疫抑制活性和抗肿瘤活性［1 2］。 综合考虑，TP的14位羟基是最合适的偶联基团。TP的水溶性不理想，且14位羟基不容易在温和条件下和蛋白载体反应，我们首先对14位羟基进行结构修饰，改造为水溶性的羧基，利用缩合反应偶联阳离子化牛血清白蛋白（cationized BSA，cBSA）和鸡卵清蛋白（OVA），合成TP的免疫抗原TP cBSA和检测抗原TP OVA。用免疫抗原免疫小鼠，顺利得到了TP的多抗。 1 实验部分 1.1 试剂和仪器 TP（购自SIGMA公司），cBSA（购自PIERCE公司），OVA，1 乙基 （3 二甲基氨

硅烷偶联剂的使用(完整篇)

硅烷偶联剂的使用（完整篇） 一、选用硅烷偶联剂的一般原则 已知，硅烷偶联剂的水解速度取于硅能团Si-X，而与有机聚合物的反应活性则取于碳官能团C-Y。因此，对于不同基材或处理对象，选择适用的硅烷偶联剂至关重要。选择的方法主要通过试验预选，并应在既有经验或规律的基础上进行。例如，在一般情况下，不饱和聚酯多选用含CH2=CMeCOO、Vi及 CH2-CHOCH2O－的硅烷偶联剂；环氧树脂多选用含CH2－CHCH2O及H2N－硅烷偶联剂；酚醛树脂多选用含H2N－及H2NCONH－硅烷偶联剂；聚烯烃选用乙烯基硅烷；使用硫黄硫化的橡胶则多选用烃基硅烷等。由于异种材料间的黏接可度受到一系列因素的影响，诸如润湿、表面能、界面层及极性吸附、酸碱的作用、互穿网络及共价键反应等。因而，光靠试验预选有时还不够精确，还需综合考虑材料的组成及其对硅烷偶联剂反应的敏感度等。为了提高水解稳定性及降低改性成本，硅烷偶联剂中可掺入三烃基硅烷使用；对于难黏材料，还可将硅烷偶联剂交联的聚合物共用。硅烷偶联剂用作增黏剂时，主要是通过与聚合物生成化学键、氢键；润湿及表面能效应；改善聚合物结晶性、酸碱反应以及互穿聚合物网络的生成等而实现的。增黏主要围绕3种体系：即（1）无机材料对有机材料；（2）无机材料对无机材料；（3）有机材料对有机材料。对于第一种黏接，通常要求将无机材料黏接到聚合物上，故需优先考虑硅烷偶联剂中Y与聚合物所含官能团的反应活性；后两种属于同类型材料间的黏接，故硅烷偶联剂自身的反亲水型聚合物以及无机材料要求增黏时所选用的硅烷偶联剂。 二、使用方法 如同前述，硅烷偶联剂的主要应用领域之一是处理有机聚合物使用的无机填料。后者经硅烷偶联剂处理，即可将其亲水性表面转变成亲有机表面，既可避免体系中粒子集结及聚合物急剧稠化，还可提高有机聚合物对补强填料的润湿性，通过碳官能硅烷还可使补强填料与聚合物实现牢固键合。但是，硅烷偶联剂的使用效果，还与硅烷偶联剂的种类及用量、基材的特征、树脂或聚合物的性质以及应用的场合、方法及条件等有关。本节侧重介绍硅烷偶联剂的两种使用方法，即表面处理法及整体掺混法。前法是用硅烷偶联剂稀溶液处理基体表面；后法是将硅烷偶联剂原液或溶液，直接加入由聚合物及填料配成的混合物中，因而特别适用于需要搅拌混合的物料体系。 1、硅烷偶联剂用量计算 被处理物（基体）单位比表面积所占的反应活性点数目以及硅烷偶联剂覆盖表面的厚度是决定基体表面硅基化所需偶联剂用量的关键因素。为获得单分子层覆盖，需先测定基体的Si－OH含量。已知，多数硅质基体的Si－OH含是来4-12个/μ㎡，因而均匀分布时，1mol硅烷偶联剂可覆盖约7500m2的基体。具有多个可水解基团的硅烷偶联剂，由于自身缩合反应，多少要影响计算的准确性。若使用Y3SiX处理基体，则可得到与计算值一致的单分子层覆盖。但因Y3SiX价昂，且覆盖耐水解性差，故无实用价值。此外，基体表面的Si-OH数，也随加热条件而变化。例如，常态下Si－OH数为5.3个/μ㎡硅质基体，经在400℃或800℃下加热处理后，则Si－OH值可相应降为2.6个/μ㎡或＜1个/μ㎡。反之，使用湿热盐酸处理基体，则可得到高Si－OH含量；使用碱性洗涤剂处理基体表面，则可形成硅醇阴离子。硅烷偶联剂的可润湿面积（WS），是指1g硅烷偶联剂的溶液所能覆盖基体的面积（㎡/g）。若将其与含硅基体的表面积值（㎡/g）关连，即可计算出单分子层覆盖所需的硅烷偶联剂用量。以处理填料为例，填料表面形成单分子

硅烷偶联剂使用说明

硅烷偶联剂使用说明 一、选用硅烷偶联剂的一般原则 已知，硅烷偶联剂的水解速度取于硅能团Si-X，而与有机聚合物的反应活性则取于碳官能团C-Y。因此，对于不同基材或处理对象，选择适用的硅烷偶联剂至关重要。选择的方法主要通过试验预选，并应在既有经验或规律的基础上进行。例如，在一般情况下，不饱和聚酯多选用含CH2=CMeCOO、Vi及CH2-CHOCH2O－的硅烷偶联剂；环氧树脂多选用含CH2－CHCH2O及H2N－硅烷偶联剂；酚醛树脂多选用含H2N－及H2NCONH－硅烷偶联剂；聚烯烃多选用乙烯基硅烷；使用硫黄硫化的橡胶则多选用烃基硅烷等。由于异种材料间的黏接可度受到一系列因素的影响，诸如润湿、表面能、界面层及极性吸附、酸碱的作用、互穿网络及共价键反应等。因而，光靠试验预选有时还不够精确，还需综合考虑材料的组成及其对硅烷偶联剂反应的敏感度等。为了提高水解稳定性及降低改性成本，硅烷偶联剂中可掺入三烃基硅烷使用；对于难黏材料，还可将硅烷偶联剂交联的聚合物共用。 硅烷偶联剂用作增黏剂时，主要是通过与聚合物生成化学键、氢键；润湿及表面能效应；改善聚合物结晶性、酸碱反应以及互穿聚合物网络的生成等而实现的。增黏主要围绕3种体系：即（1）无机材料对有机材料；（2）无机材料对无机材料；（3）有机材料对有机材料。对于第一种黏接，通常要求将无机材料黏接到聚合物上，故需优先考虑硅烷偶联剂中Y与聚合物所含官能团的反应活性；后两种属于同类型材料间的黏接，故硅烷偶联剂自身的反亲水型聚合物以及无机材料要求增黏时所选用的硅烷偶联剂。 二、使用方法 如同前述，硅烷偶联剂的主要应用领域之一是处理有机聚合物使用的无机填料。后者经硅烷偶联剂处理，即可将其亲水性表面转变成亲有机表面，既可避免体系中粒子集结及聚合物急剧稠化，还可提高有机聚合物对补强填料的润湿性，通过碳官能硅烷还可使补强填料与聚合物实现牢固键合。但是，硅烷偶联剂的使用效果，还与硅烷偶联剂的种类及用量、基材的特征、树脂或聚合物的性质以及应用的场合、方法及条件等有关。本节侧重介绍硅烷偶联剂的两种使用方法，即表面处理法及整体掺混法。前法是用硅烷偶联剂稀溶液处理基体表面；后法是将硅烷偶联剂原液或溶液，直接加入由聚合物及填料配成的混合物中，因而特别适用于需要搅拌混合的物料体系。 1、硅烷偶联剂用量计算 被处理物（基体）单位比表面积所占的反应活性点数目以及硅烷偶联剂覆盖表面的厚度是决定基体表面硅基化所需偶联剂用量的关键因素。为获得单分子层覆盖，需先测定基体的

抗原偶联选择方法

抗原偶联选择方法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1

载体的选择： 1.载体表面应首先应具有化学活性基团，这些基团可以直接与抗生素或农药分子偶联， 这是化学偶联制备抗原的前提； 2.其次,载体应具备一定的容量,可以偶联足够的分子； 3.载体还应该是惰性的,不应干扰偶联分子的功能； 4.而且载体应具有足够的稳定性,且应该是廉价易得的. 载体蛋白质有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚赖氨酸(PLL)等 这些蛋白质分子中的α和ε-氨基（等电点8和10）、苯酚基、巯基（等电点为9）、咪唑基（等电点为7）、羧基（等电点2～4,大部分来自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ-羧基）等在等电点pH条件下,一部分成为质子,另一部分未质子化的亲核基团则具有反应活性,可与半抗原中的对应基团结合.当然,这些基团的反应性也取决于蛋白质各种氨基酸残基的微环境.牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HAS）分子中含有大量的赖氨酸,故有许多自由氨基存在,且在不同pH 和离子强度下能保持较大的溶解度.此外,这些蛋白质在用有机溶剂（如吡啶、二甲基甲酰胺）溶解时,其活性基团仍呈可溶状态,因此,这两种蛋白质是最常用的载体蛋白质.近年来,有研究报道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚赖氨酸)作载体,表现出能增加半抗原的免疫原性,从而使产生征对半抗原的特异性抗体可能性增加,被广泛应用。 人工抗原合成方法： 小分子半抗原与载体蛋白偶联效果会到偶联物的浓度及其相对比例、偶联剂的有效浓度及其相对量、缓冲液成分及其纯度和离子强度、pH以及半抗原的稳定性、可溶性和理化特性等因素的影响.通常是在条件温和的水溶液中将半抗原与载体蛋白共价结合,不宜在高温、低温、强碱、强酸条件下进行.一般是由半抗原上的活性基团决定偶联合成的方法,常用的方法如下： 分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶联 1）混合酸酐法（mixed anhydride method）：也称氯甲酸异丁酯法。偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixedacidanhydride)，然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 2）碳二亚胺法（CDI）：碳二亚胺(EDC)使羟基和氨基间脱水形成酰胺键,半抗原上的羧基先与EDC反应生成一个中间物,然后再与蛋白质上的氨基反应,形成半抗原与蛋白质的结合物（见图）.EDC被称作零长度交联剂之一,因为它作为酰胺键的形成介质并没有形成手臂分子. 此连接方法十分简便,只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液中,然后加入水溶性碳化二亚胺,搅拌1～2h,置室温24h,再经透析即可。如果半抗原分子中不含羧基,可通过某些化学反应引入羧基.在引入羧基后,也可用上述方法进行偶联。 含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 1）戊二醛法：双功能试剂戊二醛的两个醛基分别与半抗原和蛋白质上的氨基形成schiff键(-N=C<，在半抗原和蛋白质间引入一个5碳桥。这一反应条件温和，可在4～40℃及～内进行，操作亦简便，因此应用广泛。戊二醛受到光照、温度和碱性的影响，可能发生自我聚合，减弱其交联作用，因此最好使用新鲜的戊二醛。

硅烷偶联剂的使用方法

一、选用硅烷偶联剂的一般原则 已知，硅烷偶联剂的水解速度取于硅能团Si-X ，而与有机聚合物的反应活性则取于碳官能团C-丫。因此，对于不同基材或处理对象，选择适用的硅烷偶联剂至关重要。选择的方法主要通过试验预选，并应在既有经验或规律的基础上进行。例如，在一般情况下，不饱和聚酯多选用含CH2=CMeC、OOVi 及CH2-CHOCH－2O 的硅烷偶联剂；环氧树脂多选用含CH2- CHCH2及H2N-硅烷偶联剂；酚醛树脂多选用含H2N-及H2NC0NH硅烷偶联剂；聚烯烃选用乙烯基硅烷；使用硫黄硫化的橡胶则多选用烃基硅烷等。由于异种材料间的黏接可度受到一系列因素的影响，诸如润湿、表面能、界面层及极性吸附、酸碱的作用、互穿网络及共价键反应等。因而， 光靠试验预选有时还不够精确，还需综合考虑材料的组成及其对硅烷偶联剂反应的敏感度等。为了提高水解稳定性及降低改性成本，硅烷偶联剂中可掺入三烃基硅烷使用；对于难黏材料，还可将硅烷偶联剂交联的聚合物共用。硅烷偶联剂用作增黏剂时，主要是通过与聚合物生成化学键、氢键；润湿及表面能效应；改善聚合物结晶性、酸碱反应以及互穿聚合物网络的生成等而实现的。增黏主要围绕 3 种体系：即（1）无机材料对有机材料；（2）无机材料对无机材料；（3）有机材料对有机材料。对于第一种黏接，通常要求将无机材料黏接到聚合物上，故需优先考虑硅烷偶联剂中丫与聚合物所含官能团的反应活性；后两种属于同类型材料间的黏接，故硅烷偶联剂自身的反亲水型聚合物以及无机材料要求增黏时所选用的硅烷偶联剂。 二、使用方法 如同前述，硅烷偶联剂的主要应用领域之一是处理有机聚合物使用的无机填料。后者经硅烷偶联剂处理，即可将其亲水性表面转变成亲有机表面，既可避免体系中粒子集结及聚合物急剧稠化，还可提高有机聚合物对补强填料的润湿性，通过碳官能硅烷还可使补强填料与聚合物实现牢固键合。但是，硅烷偶联剂的使用效果，还与硅烷偶联剂的种类及用量、基材的特征、树脂或聚合物的性质以及应用的场合、方法及条件等有关。本节侧重介绍硅烷偶联剂的两种使用方法，即表面处理法及整体掺混法。前法是用硅烷偶联剂稀溶液处理基体表面；后法是将硅烷偶联剂原液或溶液，直接加入由聚合物及填料配成的混合物中，因而特别适用于需要搅拌混合的物料体系。 1、硅烷偶联剂用量计算 被处理物（基体）单位比表面积所占的反应活性点数目以及硅烷偶联剂覆盖表面的厚度是决定基体表面硅基化所需偶联剂用量的关键因素。为获得单分子层覆盖，需先测定基体的Si—OH含量。已知，多数硅质基体的Si —OH含是来4-12 个/卩叭因而均匀分布时，1mol硅烷偶联剂可覆盖约7500m2的基体。具有多个可水解基团的硅烷偶联剂，由于自身缩合反应，多少要影响计算的准确性。若使用丫3SiX处理基体，则可得到与计算值一致的单分子层覆盖。但因丫3SiX价昂，且覆盖耐水解性差，故无实用价值。此外，基体表面的Si-OH数，也随加热条件而变化。例如，常态下Si —OH数为5.3个/卩川硅质基体，经在400C或800C 下加热处理后，则Si —OH值可相应降为2.6个/卩卅或V 1个/卩讥反之，使用湿热盐酸处理基体，则可得到高Si —OH含量；使用碱性洗涤剂处理基体表面，则可形成硅醇阴离子。硅烷偶联剂的可润湿面积（WS，是指ig硅烷偶联剂的溶液所能覆

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介 （一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用0.1ml二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、1.5mg酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为9.0，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液(pH7.5)平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA 0.1％（w/v）、NaN3 0.02%(w/v)的缓冲液中。 碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、取EDC 100mg , 用pH8.0的10 m mol/L PBS液2.5ml使之充分溶解（I液） 2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸25mg , 用0.2mol/L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （pH8.0）液中（III液） 4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下0.5ml） 5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、 4度搅拌12小时 7、静置10小时（4度） 8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。 孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。 2、加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用pH7.4，浓度50 m mol/L 的磷酸缓冲液溶解）中。 5、 （二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、用0.1 mol/L HCl溶液配制4 m mol/L浓度的半抗原。 2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。 3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。 4、用pH9.0、浓度为200m mol/L的硼酸或碳酸缓冲液溶解蛋白。 5、边搅拌，边加入重氮化的半抗原（防止局部发生酸过量现象），调节pH到9.5。

硅烷偶联剂的使用方法

硅烷偶联剂的使用方法 硅烷偶联剂的使用方法主要有表面预处理法和直接加入法，前者是用稀释的偶联剂处理填料表面，后者是在树脂和填料预混时，加入偶联剂的原液。 (1)表面预处理法 将硅烷偶联剂配成0.5～1%浓度的稀溶液，使用时只需在清洁的被粘表面涂上薄薄的一层，干燥后即可上胶。所用溶剂多为水、醇（甲氧基硅烷选择甲醇，乙氧基硅烷选择乙醇）、或水醇混合物，并以不含氟离子的水及价廉无毒的乙醇、异丙醇为宜。除氨烃基硅烷外，由其它硅烷偶联剂配制的溶液均需加入醋酸作水解催化剂，并将pH值调至3.5～5.5。长链烷基及苯基硅烷由于稳定性较差，不宜配成水溶液使用。氯硅烷及乙氧基硅烷水解过程中伴随有严重的缩合反应，也不宜配成水溶液或水醇溶液使用，而多配成醇溶液使用。水溶性较差的硅烷偶联剂，可先加入0.1～0.2%(质量分数)的非离子型表面活性剂，然后再加水加工成水乳液使用。硅烷偶联剂配成溶液，有利于硅烷偶联剂在材料表面的分散，溶剂是水和醇配制成的溶液，溶液一般为硅烷（20%）、醇（72%）、水（8%），醇一般为乙醇（对乙氧基硅烷）甲醇（对甲氧基硅烷）及异丙醇（对不易溶于乙醇、甲醇的硅烷）因硅烷水解速度与PH值有关，中性最慢，偏酸、偏碱都较快，因此一般需调节溶液的PH值，除氨基硅烷外，其他硅烷可加入少量醋酸，调节PH值至4—5，氨基硅烷因具碱性，不必调节。因硅烷水解后，不能久存，最好现配现用，最好在一小时内用完。 (2)直接添加方法 将硅烷偶联剂直接加入到胶粘剂组分中，一般加入量为基体树脂量的1～5%。涂胶后依靠分子的扩散作用，偶联剂分子迁移到粘接界面处产生偶联作用。对于需要固化的胶粘剂，涂胶后需放置一段时间再进行固化，以使偶联剂完成迁移过程，方能获得较好的效果。实际使用时，偶联剂常常在表面形成一个沉积层，但真正起作用的只是单分子层，因此，偶联剂用量不必过多。 硅烷偶联剂具体使用方法 （1）预处理填料法 将填料放入固体搅拌机(高速固体搅拌机HENSHEL（亨舍尔）或V型固体搅拌机等)，并将上述硅烷溶液直接喷洒在填料上并搅拌，转速越高，分散效果越好。

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介

常用的半抗原与蛋白偶联 方法简介 Last revision date: 13 December 2020.

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介 （一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。 碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液） 2、取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III液） 4、将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下） 5、室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、4度搅拌12小时 7、静置10小时（4度） 8、有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。 孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L的溶液。 2、加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和 DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用，浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。 5、 （二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、用 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。 2、滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。 3、溶液变成蓝黑色后，继续反应15分钟。

解偶联蛋白2与2型糖尿病

?综述与讲座?解偶联蛋白2与2型糖尿病 杨璐 2型糖尿病发病的中心环节之一是胰腺β细胞功能衰竭,其表现为胰岛素分泌功能进行性降低。最近,一种参与下调胰岛素分泌的线粒体上的蛋白质———解偶联蛋白(un2 coupling protein,Ucp)引起普遍关注。其中Ucp2在胰岛素分泌过程中究竟起什么作用,它与2型糖尿病的关系又如何呢?现就线粒体内膜上的Ucp2与2型糖尿病的发病及相关研究进展作一综述。 一、Ucp2的结构和功能 最先,Ucp1的发现是在棕色脂肪,其作用是产热,并能减少A TP的产生,与能量供给作用以及与哺乳动物的体重调节有关。但是成人棕色脂肪含量太少,Ucp1似乎不能起到调节体重的作用,因此相关的研究减少了许多。直到1997年,Ucp2和Ucp3的发现使解偶联蛋白再次成为焦点。研究[1]发现了Ucp2基因,其定位于人类染色体11q13,全长8.7kb,分子质量为33098u,编码308个氨基酸,由8个外显子和7个内含子组成。Ucp2和Ucp3定位的染色体11q13被认为是与人类肥胖相关的候选基因。在植物和啮齿类动物体内都发现Ucp,在啮齿类动物至少已有5种(Ucp1～Ucp5)并被克隆,亚细胞定位均在线粒体内膜,各成员间序列同源性较高,组织分布有一定特异性。Ucp2是该家族中分布最广的成员,在体内分布广泛,脂肪、胎盘、骨骼肌、心脏、脾脏、肾脏、淋巴结以及中枢神经系统都有存在,其中在胰腺中的分布是Ucp2特异表达。 二、Ucp2在β细胞的基本功能 1.Ucp2是胰岛素分泌的负性调节因子:线粒体氧化磷酸化是葡萄糖代谢胰岛β细胞分泌过程的一个重要环节。Ucp2通过使细胞线粒体的氧化磷酸化过程解偶联,降低A TP产生,A TP/ADP比值下降,来减少A TP敏感的钾离子通道的关闭,进而影响细胞除极。使电压依赖性的钙离子通道开放迟缓或幅度减低,钙离子内流抑制,含有胰岛素的颗粒细胞不能释放,胰岛素分泌减少[2]。机体为此所必须付出的代价是能量通过Ucp的作用以热能的形式被消耗,而不是以A TP形式被储存,Ucp2的这种质子传递作用能被细胞内的ADP抑制。 2.抑制活性氧簇(ROS),减少氧化损伤:在Ucp2含量丰富的巨噬细胞中发现,把Ucp2敲除则巨噬细胞内ROS含量增加,表明Ucp2能抑制ROS的生成[3]。活性氧是细胞氧化损伤的主要来源,损伤的后果是加重疾病和老化。ROS 在线粒体中的产生来源于呼吸链产物中一部分氧经单电子 作者单位:524000湛江,广东医学院附属医院内分泌科 还原为水的过程中经过呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ形成,包括超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等。当线粒体内的抗氧化防御系统如谷胱甘肽、MnSOD、CoQ及维生素E不能有效清除超氧化物时,ROS积聚会引发膜磷脂过氧化,蛋白质DNA的损伤激发级联反应最终导致线粒体破坏和细胞凋亡。 三、影响Ucp2mRNA表达的因素 1.脂肪酸的影响:脂肪酸对非胰岛组织Ucp2的诱导作用已经得到证实[4],用250μm油脂酸培养12～16h能使肝细胞内Ucp2的表达增加8倍以上。高脂饮食喂养2d就能明显上调A/J大鼠棕色脂肪组织中Ucp2mRNA的表达。Vettor等[5]发现用脂肪乳剂持续24h灌注能明显增加大鼠心脏和骨骼肌中Ucp2的表达,同时胰岛素调节的葡萄糖转运被抑制。同样游离脂肪酸对胰腺组织中Ucp2上调的影响也被许多实验证实。Tokuyuki等[6]通过将脂肪形成的关键转录因子即固醇调节元件结合蛋白(Sreb-1c)的腺病毒插入胰岛细胞,使细胞内脂肪酸合成大大增加,甘油三酯含量随之增加,Ucp2表达增加。另一项研究是应用高脂高糖和普通饲料喂养GK大鼠,观察其对β细胞胰岛素分泌功能的不同影响发现,高脂高糖能增加胰岛细胞内甘油三酯含量并且影响GK大鼠的胰岛素分泌,而且Ucp2蛋白表达水平增加,这些作用通过胰岛素治疗得到改善,表明Ucp2是β细胞胰岛素分泌的重要负性调节因子[7]。Joseph等[8]通过对Ucp2基因敲除小鼠和野生性小鼠胰岛细胞分别在体外用软脂酸培养48h后观察并比较细胞内甘油三酯含量和软脂酸代谢速率发现,Ucp2基因敲除鼠的β细胞游离脂肪酸的代谢速率提高,避免了甘油三酯细胞内堆积,从而避免脂毒性对β细胞损伤,这可能就是Ucp2表达过度损伤胰岛细胞功能的机制之一。 2.高血糖:高血糖对Ucp2mRNA表达的影响研究结果不尽相同,但多数研究[9-10]表明,高血糖能上调胰岛细胞线粒体的Ucp2表达,而且ROS的产生增加,进而抑制胰岛素的分泌,在协同高脂的环境下,ROS生成的增多有诱导Ucp2的表达增多,表明Ucp2活性增加对胰岛素分泌产生不利作用。同样在Ucp2基因敲除小鼠中发现其β细胞数量增加但在高脂高糖环境中仍能维持一定的胰岛素分泌功能。 3.其他因素:脂联素能减少A Y/a肥胖小鼠的内脏脂肪,可能与上调解偶联蛋白在棕色脂肪、白色脂肪以及骨骼肌中的表达有关[11]。瘦素通过提高白色脂肪中Ucp2的表达来加强或激活脂肪酸类代谢和利用[12]。甲状腺素能增加心脏、骨骼肌以及脂肪组织中Ucp2的mRNA表达。选择性β-3肾上腺素能激动剂能降低肥胖KK小鼠体重,可能是通

常用的半抗原与蛋白偶联方法简介

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常用的半抗原与蛋白偶联方法简介 （一）分子中含有羧基或可羧化的半抗原的偶联） 1、混合酸酐法，也称氯甲酸异丁酯法（isobutyl chloroformate method） 偶联时，半抗原分子中的羧基可与氯甲酸异丁酯在有机溶剂中形成混合酸酐(mixed acid anhydride),然后与蛋白分子中的氨基形成肽键。 氨甲喋呤（MIT）与β-半乳糖苷酶偶联的混合酐法 1、5．8mg MIT用二甲基甲酰胺溶解，冷却至10度，加2ul氯甲酸异丁酯，10度搅拌反应30分钟。 2、酶用2ml 50 m mol/L Na2CO3溶解。 3、10度反应4小时（必要时加NaOH,以维持溶液的pH为，q然后4度过夜。 4、过sephadex G-25层析柱，柱用含NaCl 100m mol/L、MgCl2 10 m mol/L、2-巯基乙醇10 m mol/L的50m mol/L Tris-醋酸缓冲液平衡和洗脱，合并含酶的洗脱管内液体，进一步纯化后，保存于含BSA ％（w/v）、NaN3 %(w/v)的缓冲液中。 碳化二亚胺法制备3,3`,5-三碘甲腺氨酸-血蓝蛋白免疫原的操作步骤 1、??取EDC 100mg , 用的10 m mol/L PBS液使之充分溶解（I液） 2、??取3，3`,5-三碘甲腺原氨酸 25mg , 用L NaOH 溶液2ml 溶解(II液) 3、??取血蓝蛋白(lemocyanin) 25mg, 溶于10mmol/L PBS （）液中（III 液） 4、??将II液与III液混合，在磁力搅拌下逐滴加入I液（余下） 5、??室温下避光搅拌1小时，逐滴加入余下的I液 6、??4度搅拌12小时 7、??静置10小时（4度） 8、??有蒸馏水使之充分透析（约48小时），得免疫原。 孕酮与与β-半乳糖苷酶偶联的N-羟琥珀酰亚胺酯法 1、??用二垩烷(dioxane)溶解孕酮-11-半琥珀酸酯，配成浓度为100m mol/L 的溶液。 2、??加羟琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide) 100 m mol/L 和 DCC（二环已基碳化二亚胺），200 m mol/L, 4度反应16小时。 3、??用簿层扫描方法纯化(氯仿：水=9：1) 4、??按孕酮/酶摩尔浓度比约为10的比例，将上述溶液加入到酶液（用，浓度50 m mol/L的磷酸缓冲液溶解）中。 5、?? （二）含有氨基或可还原硝基半抗原的偶联 芳香胺类半抗原与蛋白质重氮化偶联的操作步骤 1、??用 mol/L HCl溶液配制 4 m mol/L浓度的半抗原。 2、??滴加1％NaNO2(过量)，4度持续搅拌。NaNO2的加入量可用淀粉-碘化物试纸或在白色磁砖上加1％淀粉和50m mol/L KI进行监控。游离亚硝酸可将氧化物氧化成碘，碘再与淀粉反应变成蓝黑色。

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硅烷偶联剂介绍

目录 1 硅烷偶联剂 (1) 有机硅烷偶联剂的选择原则 (3) 偶联剂用量 (4) 硅烷偶联剂作用机理 (5) 硅烷偶联剂使用方法 (6) 硅烷偶联剂分类与用途 (7) 硅烷偶联剂A-151 (7) 硅烷偶联剂A-171 (8) 硅烷偶联剂A-172 (9) 硅烷偶联剂KH-540 (9) 硅烷偶联剂KH-550 (10) 硅烷偶联剂KH-551 (10) 硅烷偶联剂KH-560 (11) 硅烷偶联剂KH-570 (12) 硅烷偶联剂KH-580 (13) 硅烷偶联剂KH-602 (13) 硅烷偶联剂KH-791 (14) 硅烷偶联剂KH-792 (15) 硅烷偶联剂KH-901 (16) 硅烷偶联剂KH-902 (16) 硅烷偶联剂nd-22 (17) 硅烷偶联剂ND-42(南大42) (17) 硅烷偶联剂ND-43 (17) 硅烷偶联剂SI-69 (18) 苯基三甲氧基硅烷 (18) 苯基三乙氧基硅烷 (19) 甲基三乙氧基硅烷 (20)

钛酸酯偶联剂 (20) 钛酸酯偶联剂101(钛酸酯TTS) (20) 钛酸酯偶联剂102 (21) 钛酸酯偶联剂105 (21) 有机硅烷偶联剂的选择原则 有机硅烷偶联剂的选择一般凭借对有机硅烷偶联剂侧试数据进行经脸总结，准确.地预测有机硅烷偶联剂是非常困难的。使用有机硅烷偶联剂后增大的键强度是一系列复杂因素的综合，如浸润、表面能、边界层的吸附、极性吸附，酸碱相互作用等. 预选有机硅烷偶联剂可遵循以下规津:不饱和聚醋可选用乙烯纂、环氧基及甲基丙烯陈氧基型有机硅烷偶联剂;环氧树脂宜选用环氧基或氨基型有机硅烷偶联剂;酚醛树脂宜选用氨基或服基型有机硅烷偶联剂;烯烃聚合物宜选用乙烯基型右机硅烷偶联剂;硫磺硫化的橡胶宜选用疏基型有机硅烷偶联剂等， 一、选用硅烷偶联剂的一般原则已知，硅烷偶联剂的水解速度取于硅能团Si-X，而与有机聚合物的反应活性则取于碳官能团C-Y。因此，对于不同基材或处理对象，选择适用的硅烷偶联剂至关重要。选择的方法主要通过试验，预选并应在既有经验或规律的基础上进行。例如，在一般情况下，不饱和聚酯多选用含CH2=CMeCOOVi及CH2-CHOCH2O的硅烷偶联剂：环氧树脂多选用含CH2CHCH2O及H2N硅烷偶联剂：酚醛树脂多选用含H2N及H2NCONH硅烷偶联剂：聚烯烃多选用乙烯基硅烷：使用硫黄硫化的橡胶则多选用烃基硅烷等。由于异种材料间的黏接强度受到一系列因素的影响，诸如润湿、表面能、界面层及极性吸附、酸碱的作用、互穿网络及共价键反应等。因而，光靠试验预选有时还不够精确，还需综合考虑材料的组成及其对硅烷偶联剂反应的敏感度等。为了提高水解稳定性及降低改性成本，硅烷偶联剂中可掺入三烃基硅烷使用；对于难黏材料，还可将硅烷偶联剂交联的聚合物共用。 硅烷偶联剂用作增黏剂时，主要是通过与聚合物生成化学键、氢键；润湿及表面能效应：改善聚合物结晶性、酸碱反应以及互穿聚合物网络的生成等而实现的。增黏主要围绕3种体系：即（1）无机材料对有机材料；（2）无机材料对无机材料；（3）有机材料对有机材料。对于第一种黏接，通常要求将无机材料黏接到聚合物上，故需优先考虑硅烷偶联剂中Y与聚合物所含官能团的反应活性：后两种属于同类型材料间的黏接，故硅烷偶联剂自身的反亲水型聚合物以及无机材料要求增黏时所选用的硅烷偶联剂。 硅烷偶联剂牌号偶联剂应用领 域 偶联剂作用 KH-540 KH-550 胶黏剂行业●提高粘接力及粘接寿命 ●在潮湿和干燥的条件下仍具有良好的粘结效果●更佳的耐溶剂性、提高储存寿命 KH-560 KH-570 KH-792 Si-602 Si-563 KH-540 KH-550 涂料行业●有机聚合物和无机表面之间的附着力促进剂●粘合体系的交联剂和固化剂，共聚单体 ●填料和颜料的分散剂 ●在抗刮和抗腐蚀涂料中充当粘结组分及涂层 KH-560 KH-570 KH-792 Si-602 Si-563 A-151

解偶联蛋白-2及缺氧诱导因子-1在肿瘤细胞中表达的意义

现代医药卫生2012年7月30日第28卷第14期J Mod Med Health ，July 30，2012，Vol.28，No.14解偶联蛋白-2及缺氧诱导因子-1在肿瘤细胞中表达的意义 戴纪刚1，汤兴平2，闵家新1，余祖滨1，张在永1（1.第三军医大学新桥医院胸外科，重庆400037；2.赤水市人民医院，贵州赤水564700） 【提 要】 解偶联蛋白-2（uncoupling protein -2，UCP -2）是线粒体内膜上的一种蛋白，能降低线粒体膜电位，限制三磷 酸腺苷（ATP ）合成，参与转运丙酮酸，与能量代谢关系密切；同时，UCP -2能控制线粒体内活性氧簇（ROS ）生成，与氧化应激、凋亡、肿瘤发生等过程也有密切联系。恶性肿瘤由于组织增生过快造成局部组织严重缺氧，但处于缺氧状态的肿瘤细胞仍能不断增殖和浸润，主要原因之一是缺氧引起肿瘤细胞一些基因和蛋白的表达发生改变，其中既有UCP -2的参与。有关研究结果证明，UCP -2在人结肠癌细胞中表达明显增加，且癌细胞的恶化程度与UCP -2的含量有正相关性。 【关键词】 肿瘤细胞； 缺氧； 转录因子； 膜转运蛋白质类； 线粒体蛋白质类； 解偶联蛋白-2； 缺氧诱导因子-1 文章编号：1009-5519（2012）14-2167-03 中图法分类号：R730.1 文献标识码：A 课题资助：国家自然科学基金面上项目（81172238）； 重庆市自然科学基金资助项目（2009C195）。 解偶联蛋白（uncoupling proteins ，UCPs ）是位于线粒体内膜上参与质子转运的一类蛋白家族，其可将呼吸链与三磷酸腺苷（adenosine triphosphate ，ATP ）产生过程解偶联，能降低线粒体膜电位，限制ATP 合成，参与转运丙酮酸，导致能量以热的形式消耗掉，从而调控机体能量代谢[1]，与能量代谢关系密切。早在1977年，在褐色脂肪细胞线粒体内膜上发现这种质子转运蛋白。当它被激活时，可产生质子的渗漏，使氧化磷酸化解偶联，ATP 合成降低，使产能转化为产热作用。此现象表明耗氧和二磷酸腺苷（ADP ）磷酸化之间并不是完全偶联的，该质子转运蛋白被称为UCPs [2] 。 目前，UCPs 家族主要分为5个亚型，各亚型在结构上有相互关联性，但组织分布不同。最初发现的UCP1只在棕色脂肪中表达，介导机体的产热反应，从而调控体温和机体能量代谢，在肥胖、糖尿病等代谢性疾病中发挥重要作用 [3] 。该蛋白家族的另一成员UCP2表达广泛，其主要生理功能与UCP1相差甚远，在产热和体 温调控中的作用有限，更主要的是通过介导“质子漏”，降低线粒体内膜的质子梯度，从而减少活性氧簇（reactive oxygen species ， ROS ）的产生和减轻氧化应激（oxidative stress ）反应[4]。UCP2分布 广泛，在多种组织如棕色脂肪组织、心、肺、肾和淋巴细胞等均有表达[5]。现已发现其与多种疾病密切相关，包括代谢综合征、糖尿病、高血压、心血管疾病以及肿瘤等[6]。而UCP2在肿瘤中的具体调控作用及其分子机制尚不清楚，本文就UCP2的基本生理功能及其在肿瘤中的病理生理调控作用进行综述[7]。 1UCP2的表达分布和活性调控 人UCP2基因位于第11号染色体，其基因在1997年被首次克隆，随后啮齿类动物的UCP2基因也被相继克隆[2]。各物种之间的UCP2基因序列一般是高度保守的，大鼠UCP2氨基酸序列与小鼠序列有99%一致，而与人UCP2氨基酸序列的一致性也高达 95%[8]，可见UCP2在机体生命活动中的重要性。UCP2蛋白氨基 酸序列与UCP1的一致性约为58%，而这也是两者生理功能有所偏重的结构基础。 UCP2是UCPs 蛋白家族中分布最广泛的蛋白，在心脏、肾脏、 肌肉、白色脂肪组织、肝脏、胰岛、脾、胃、肺及胸腺中都有相对高水平的表达[5，8-9]。 目前UCP2的基因表达和蛋白活性的调控机制尚不明确。现有的证据提示，机体代谢率、某些激素（如甲状腺激素），以及其他 一些生物活性分子（如脂多糖类、辅酶Q 和超氧阴离子等）都对 UCP2基因转录、翻译和蛋白表达功能有不同程度的调控作用，且 具有一定的组织特异性[10-11]。各种类型的激素及其代谢产物对 UCP2的调控作用提示其可能在机体物质和能量代谢中发挥着重 要的作用，而UCP2在出生后不同时期的表达差异提示其可能还参与调控机体的生长发育[12]。除此之外，多种生理和病理状态下 UCP2的表达上调，如禁食、高脂饮食、糖尿病等状态的共同生化 特征是超氧阴离子产生显著增加，这提示超氧阴离子有可能都是调控UCP2的表达和功能的重要分子[11，13-14]。 2UCP2基本生理功能和作用 UCP2同UCPs 蛋白家族的其他蛋白一样，基本生理功能都 是介导氧化磷酸化解偶联。线粒体内膜上的电子传递链在氧化底物的同时将质子泵到线粒体内外膜间隙，从而形成跨内膜质子梯度，由此产生质子势能导致质子在通过ATP 合成酶回流到线粒体基质的同时驱动ATP 合成酶将ADP 转化成ATP [15]。而UCP2可以提供一条质子回流基质的旁路途径而使其不产生ATP 。与UCP1不同的地方在于，UCP2发挥解偶联的主要作用并不是导致产热，而是调控ROS ，尤其是超氧阴离子的产生。 2.1线粒体ATP 的产生UCP2通过解偶联导致线粒体ATP 产 生减少，使能量以热能的形式消耗，而ATP 产量的减少可能会影响细胞的生理功能。UCP2基因敲除小鼠胰岛细胞中，ATP/ADP 比值的升高可支持上述观点，且这一现象与胰岛素分泌增加相关[1]。而与之不符的是大脑中UCP2的解偶联作用反而导致ATP/ADP 比值的升高，可能的解释是UCP2也有可能促进了脑细胞中线粒体密度的增加[12]。 2.2线粒体内钙离子摄取细胞内钙离子浓度的稳态是细胞生 理活动的必要条件。细胞内钙离子浓度受细胞膜上各种钙离子通道和细胞内钙库的精确调控。线粒体是重要的细胞内钙库，其对胞内钙离子浓度的调控依赖于线粒体内膜的电势[16]。UCP2可以通过解偶联降低线粒体内膜电势，从而影响线粒体对钙离子的摄取[5]。但UCP2的这种作用对肿瘤细胞调控中的作用机制尚不清楚。 2.3线粒体超氧阴离子的产生超氧阴离子及其他自由基都是 电子流经线粒体呼吸链时的副产物。正常细胞产生的超氧阴离子可被线粒体中的锰超氧化物歧化酶（manganese superoxide dis - mutase ，MnSOD ）和存在于胞浆中的铜锌超氧化物歧化酶（copper -zinc superoxide dismutase ，Cu/Zn -SOD ）转化为过氧化氢。过量产生 ·综述与讲座· ·2167·