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protocol 实验

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流式protocol

收获P3代生长状态良好细胞,0.25%胰酶消化,4 ℃离心,1 000 r/min,5 min。 ↓ 用PBS(含1%BSA)清洗细胞3次,计数细胞。 ↓ 各管依次加入单克隆抗体CD29、CD34、CD45、CD90。 ↓ 同时每管样品设立同型阴性对照。 ↓ 避光冰上孵育45 min。 ↓ 用PBS(含1%BSA)洗涤细胞3次,以除去未结合抗体,用500 μL PBS(含1%BSA)重悬细胞,流式细胞仪进行检测分析。 (四个CD抗原分子,四个阴性对照,一个空白对照。九个EP管)细胞一定要足够量,一般要求1×106个细胞。对于直接标记单色样本,应该设置空白对照、阴性对照(同型抗体对照)和待测样本。对于直接标记多色样本,在单色基础上另加补偿对照。阴性对照的设置:在实验过程中,假设做直接标记法,可将实验组细胞,取一管,加上与实验抗体所标记的荧光颜色相同的同型对照来作为阴性对照。空白对照:即不进行任何标记的细胞。但是我们买的是pe和fitc荧光标记的抗体,那一管样品内可以同时加两中不同标记的抗体,那它们的同型对照怎么设置?我们的样品可以放在EP管里面吗?检测时,样品至少需要多少量? 取第3代第3~5d BMSCs,胰蛋白酶-EDTA消化成为单细胞悬液; ↓ PBS(1到2ml)洗三次,离心,1000rpm,5min弃液; ↓ 4%多聚甲醛1ml室温下固定40min,1000r/min,离心5min后弃去上清液 ↓ PBS(1到2ml)洗两次,离心,1000rpm,5min弃液; ↓ 分别加入500ul已经稀释的大鼠CD29、CD34、CD45及CD90单克隆抗体; ↓ 避光孵育30min ↓ 用PBS洗涤细胞两次,以除去未结合抗体; ↓ 用PBS重悬细胞,流式细胞仪进行检测分析。 PBS洗涤细胞的过程中细胞丢失?

动物微生物实验仪器操作规程汇总(DOC)

高压蒸汽灭菌锅操作规程 一、操作步骤 1、开盖:向左转动手轮数圈,直至转动到顶,使锅盖充分提起,拉起左立柱上的保险销,向右推开横梁移开锅盖。 2、通电:接通电源,此时欠压蜂鸣器响,显示本机锅内无压力(当锅内压力升至约0.03Mpa 时蜂鸣器自动关闭),控制面板上的低水位灯亮,锅内属断水状态。 3、加水:将纯水或生活用水直接注入蒸发锅内约8升,同时观察控制面板上的水位灯,当加水至低水位灯灭,高水位灯亮时停止加水。当加水过多发现内胆有存水,开启下排汽阀放去内胆中的多余水量。 4、放样:将灭菌物品仪器堆放在灭菌筐内,各包之间留有间隙,有利于蒸气的穿透,提高灭菌效果。密封:把横梁推向左立柱内,横梁必须全部推入立柱槽内,手动保险销自动下落锁住横梁,旋紧锅盖。 5、设定温度和时间:按一下确认键,进入温度设定状态,按上下键可以调节温度值,再次按下确认键,进入时间设定状态,按左键或上下键设置需要的时间,再次按动确认键,设定完成,仪器进入工作状态,开始加热升温。 6、灭菌结束后,关闭电源,待压力表指针回落零位后,开启安全阀或排汽排水总阀,放净灭菌室内余气。若灭菌后需迅速干燥,须打开安全阀或排汽排水总阀,让灭菌器内的蒸汽迅速排出,使物品上残留水蒸气快速挥发。灭菌液体时严禁使用干燥方法。 7、启盖:同第一步。 二、注意事项 1、堆放灭菌包时应注意安全阀放汽孔位置必须留出空气,保障其畅通,否则易造成锅体爆裂事故。 2、灭菌液体时,应将液体灌装在耐热玻璃瓶中,以不超过3/4体积为好,瓶口选用棉花纱塞。 3、本器尽量使用纯水,以防产生水垢。 动物微生物生实训室

生物显微镜操作规程 一、操作步骤 1、将所需观察的标本放在工作台上卡夹住。 2、将各倍率物镜顺序装于物镜转换器上,目镜插入目镜筒中。 3、操作时将标本移动到工作台中间,先用10×物镜观察,打开电源开关把亮度调节钮移至适当位置,转动粗调手轮将工作台上升到能见到标本的影形,转动微调手轮即可得到清晰的物象。光亮的选择可转动聚光镜架手轮使聚光镜上升或下降,再调节可变光栏,使改变交栏孔径以便获得适合各类细节标本的照明亮度。(为光源和观察需要备有滤色片供使用,滤色片装于可变光栏下部的托架上,可得到选择的色泽。如用低倍物镜观察液体及用高位物镜时感到光源太强时,可将毛玻片装于可变光栏下部托架上使用,可得到暗淡光线)转动工作台上纵向手轮,使工作台同标本作前后方向移动,转动横向手轮使标本作左右方向移动。将所需观察的物体移至中心观察,然后转至高倍物镜或油浸物镜进行观察(用油镜时需加注香切片物体)仍能看见物体的影象,需再转动微调手轮即可达到清晰的物象。例用完毕只要转动粗调手轮将工作台下降到底,再将亮度调节钮移到最小亮度处最后关上电源开关。 4、调节亮度调节钮可以改变灯泡发光亮度以获得最佳亮度。 5、更换灯泡方法:把钨卤素灯插入灯座,然后将它插入底座下方插口处即可。

(完整版)泛素化蛋白检测方法

泛素化蛋白检测方法 蛋白质泛素化简介蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样,泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程,它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76 个氨基酸残基组成的非常保守的多肽,它能在E1、E2、E3 酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7 个赖氨酸残基,因此它们之间也可以通过这些位点互相连接,形成多泛素蛋白链(polyubiquitin chain)。目前研究显示,如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48 位赖氨酸残基相连,会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解;如果与被修饰蛋白上其它位点,比如第63 位赖氨酸残基相连,则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样,泛素化修饰途径也是可逆的,即可以通过去泛素化酶(DUB )将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后,连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域(UBD )所 识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90 种DUB 酶和20 种UBD ,这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3 酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶,它可以分为两大类,即含有HECT 结构域的E3 酶和其它含有RING 结构域或RING 样结构域(比如U-box 或PHD 结构域)的E3 酶。这两种E3 酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 蛋白质泛素化的检测方法研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点:哪些蛋白发生了泛素化;发生了泛素化的蛋白质,具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化;进行定量。 明确了上述几点后,进一步需要弄清楚的是,我们感兴趣的泛素化蛋白,是 如何发生泛素化的,影响这一泛素化过程的关键分子是什么?或者说这一过程中的E3 酶是什么? 然后需要研究的是,这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应?对下游

常用实验动物

常用实验动物 1、小鼠 喜欢群居,怕热,高温容易中暑 雌雄性小鼠交配后10~12小时,在雌性小鼠阴道口会形成白色的阴道栓 主要解剖学特性 消化系统:食管内壁有角质化鳞状上皮,利于灌胃;有胆囊;胰腺分散,色淡红,似脂肪组织。 生殖系统:雌性小鼠为双子宫型,呈“Y”形,卵巢不予腹腔相通,无宫外孕。 骨髓为红骨髓,无黄骨髓,终身造血。 皮肤无汗腺。 小鼠常用品种、品系 1. 近交系小鼠 C3H:1975年从美国引进,野生色毛; ? C57BL/6:1975年从日本引进,黑色毛; ? BALB/c:Bagg1913年获得小鼠白化株,经近亲繁殖20代以上育成,毛色为白色; ? DBA:分为DBA/1和DBA/2两个品系,1977年由美国实验动物中心引进,毛色均为浅灰色。 2、封闭群小鼠 ①KM小鼠:我国使用量最大的远交种小鼠,白色,抗病、适应力强,繁殖、成活率高。 ②ICR:1973年由日本国立肿瘤研究所引入我国,白色,其显著特点是繁殖

力强。 ③LACA :1973年由英国实验动物中心引入我国,白色。其实是小鼠改名而成。 ④NIH :由美国国立卫生研究院培育,白色,繁殖力强,幼仔成活率高,雄性好斗 3、突变系 1、裸鼠:第11对染色体上的裸基因(nu)导致无毛裸体、无胸腺 2、SCID小鼠:第16对染色体上的Scid隐性基因突变基因导致T、B淋巴细胞联合免疫缺陷.外观与普通小鼠差别不大,被毛白色,体重发育正常 3、快速老化模型小鼠:4~6月龄以前与普通小鼠的生长一样,4~6月龄以后迅速出现老化症状。如心、肺、脑、皮肤等器官老化,出现骨质疏松和老化淀粉样变。侏儒症:比正常小鼠体型小,缺少生长素和促甲状腺素,用于内分泌研究。小鼠在医学、生物学的应用 1、重组近交系小鼠将双亲品系的基因自由组合和重组产生一系列的子系,是遗传分析的重要依据,用作基因定位及其连锁关系的研究 2、提供自然的动物模型 2、大鼠染色体数2n=42 喜独居,喜啃咬,性情较凶猛、抗病力强,对新环境适应力强,但对环境刺激、炎症反应敏感。强烈噪音可引起食仔或抽搐;湿度低于40%易发生环尾巴症。行为表现多样,情绪反应敏感,易接受通过正负强化进行的多种感觉指令的训练雌性2.5月龄达到性成熟,具有产后发情、产后妊娠的特点。寿命2.5~3年。解剖学特征

标准操作规程实验动物隔离检疫标准操作规程【模板】

标 准 操 作 规 程 (Standard Operating Procedure) 实验动物隔离检疫 标准操作规程 Standard Operating Procedure for ethical review system of Laboratory Animal 制定者 Author 兽医办公室/兽医师 Veterinary office 审查者 Reviewer 肖春兰 动物质量办公室/技术员 Technican of Animal Quality Lab 审查者 Reviewer 王婧 办公室主任 Office Director 机构负责人批准Facility Manager Approver 周正宇 中心最高领导者 Top Manager of the Center

修订记录(Revision History)

发放记录(Revision History)

1、目的(Purpose) 规范苏州大学实验动物中心实验动物隔离检疫标准操作规程。 2、适用范围 (Scope) 此文件适合苏州大学实验动物中心所有动物隔离检疫。 3、职责(Responsibility) 3.1 文件编写、批准人员对该文件编写和修改的有效性负责。 3.2 文件编写人员负责根据此文件,对担任实验动物隔离检疫的工作人进行 培训和指导。 3.3 担任实验动物隔离检疫的工作人,负责执行本标准操作规程,并负责反馈 相关信息。 4、操作规程(Procedures) 凡自主采购且来源为不是免检单位(见附表1)的SPF级实验动物,均需在进入我中心SPF动物房前,接受隔离检疫。 4.1 提交自购申请 凡自主采购实验动物的个人及单位,均需向我中心提交自购实验动物申请。 4.1.1 登陆动物管理系统 科研计划人以科研计划用户身份登陆苏州大学实验动物管理系统。 4.1.2 提交动物订购申请 科研计划人点击动物订购项,添加动物订购申报。 4.1.3 注意事项

蛋白质泛素化研究进展—探索蛋白修饰的秘密

蛋白质泛素化研究进展——探索蛋白修饰的秘密 泛素是一种含76个氨基酸的多肽,存在于除细菌外的许多不同组织和器官中,具有标记待降解蛋白质的功能。被泛素标记的蛋白质在蛋白酶体中被降解。由泛素控制的蛋白质降解具有重要的生理意义,它不仅能够清除错误的蛋白质,还对细胞周期调控、DNA修复、细胞生长、免疫功能等都有重要的调控作用。 2004年,以色列科学家Aaron Ciechanover、Avram Hershko和美国科学家Irwin Rose就因发现泛素调节的蛋白质降解而被授予2004年诺贝尔化学奖。正是因为泛素调节的蛋白质降解在生物体中如此重要,因而对它的开创性研究也就具有了特殊意义。目前,在世界各地的很多实验室中,科学家不断发现和研究与这一降解过程相关的细胞新功能。现在,研究人员已发现泛素具有多种非蛋白水解功能,包括参与囊泡转运通路、调控组蛋白修饰以及参与病毒的出芽过程等。 鉴于蛋白质降解异常与许多疾病,例如癌症、神经退行性病变以及免疫功能紊乱的发生密切相关,而基因的功能是通过蛋白质的表达实现的,因此,泛素在蛋白质降解中的作用机制如能被阐明将对解释多种疾病的发生机制和遗传信息的调控表达有重要意义。 《生命奥秘》本月专题将介绍泛素系统的来源、研究进展,并重点介绍以“泛素-蛋白酶”为靶位的抗癌疗法,希望能给相关领域的研究人员带来崭新的思路。 一、泛素样蛋白的来源及功能 1. 泛素样蛋白及其相关蛋白结构域 2. 泛素样蛋白连接后的结果 3. 泛素样蛋白修饰途径的起源 4. 前景展望 二、泛素化途径与人体免疫系统调节 1. 泛素修饰途径与NF-κB信号通路的关系 2. 泛素蛋白在天然免疫中的作用 3. 泛素化修饰途径在获得性免疫机制中的作用

植物(拟南芥水稻)原位杂交详细protocol试验方法

植物材料的固定、包埋和制片 一、植物材料的固定和包埋 在此过程应注意避免Rnase的污染。所使用的熔蜡管(管盖不能耐受180℃烘,只需高压湿热灭菌即可)、量筒、三角瓶和药勺均需180℃烘5小时以上。所用蒸馏水无需用DEPC处理。所固定的材料越小越好,尽可能切除多余的材料。材料取下后应立即固定。取材后若不能立即固定,则应置于冰上运输。配试剂前请计算一下所需用量,用多少配多少,节约试剂。 300 ml量为例) 1、先打开一个60℃左右的水浴锅。 2、在通风橱中往三角瓶中加入12 g多聚甲醛(终浓度为4%)。 3、用量筒配300 ml PBS缓冲液(30 ml 10×PBS+270 ml水),另加1粒NaOH,盖好锡 箔纸后,轻轻摇动,稍微溶化后置于水浴锅中溶解。 4、完全溶解后,取出,加0.1% Tween-20 (300 ul)和0.1% Triton(300 ul)混匀(包 埋水稻时还要再加3 ml 25%的戊二醛)。 5、置于冰上或4℃冰箱降至室温,然后用硫酸调pH 至7.0。 6、把配制好的甲醛溶液分装到小瓶中,(一般用10 ml的小瓶)。 7、分装好的甲醛溶液应放置在冰浴中当天使用。 二、固定材料 1、取植物新鲜材料,去除不需要的部分至适当大小。注意:所固定的材料越小越好, 尽可能去除无用多余的部分。 2、把取好材料放入冰浴的装有甲醛溶液的小瓶中。注意每瓶中的切块数:太多固定不 好;太少则浪费固定液(固定液:材料≥20:1)。 3、材料放入固定液后,应通过抽真空(1至数分钟,视具体情况而定:尽可能短时间, 以材料沉入固定液中为准),帮助固定液进入组织中,以达到迅速固定植物材料的目 的。抽气减压时,尽量不要使液体过分沸腾。抽真空时,材料一般在固定液中浮起; 抽完真空的材料应该沉入固定液中,有时可能要反复多次抽真空,直至材料沉没在 固定液中。一般抽真空多于5分钟大部份材料还不沉没在固定液中的情况极少见, 如果此情况发生,建议抽真空达10分钟后,继续做步骤4。 4、抽真空后需要更换一次新鲜的固定液。 5、更换新鲜固定液后,材料在4℃过夜。 注意:甲醛有剧毒,因此药品的称取和溶液的配置必须在通风橱中进行!多聚甲醛极易飞散;称取时通风橱可暂不抽风;要避免将多聚甲醛洒落在天平或台面上造成污染,如有洒落,要及 按以下序列对材料进行脱水(水为高压灭过菌的双蒸水)。 0.85% NaCl 冰浴,30 分钟 2、50%乙醇/0.85% NaCl 冰浴,5 小时 3、70%乙醇/0.85% NaCl 冰浴,5 小时 4、85%乙醇/0.85% NaCl 4℃,过夜 50%乙醇后,材料应开始脱色。 /水 4℃,5小时 2、100%乙醇 4℃,5小时 3、100%乙醇 4℃,过夜 注:第三天起,每个脱水步骤时间可延长至一天。两次100%乙醇脱水后,材料应为无色。

动物实验标准操作规程

动物实验标准操作规程 一、人流线路工作人员进入第一更衣室→脱去个人外衣(饰品)放入衣柜→脱去蓝色拖鞋后(→淋浴室)进入第二更衣室→穿上红色拖鞋→手消毒(0.1%新洁尔灭)→按操作规范穿上无菌连体衣,戴上一次性无菌口罩、手套→进入缓冲间→风淋→进入清洁走廊→进入洁净区域工作→进入饲养室或检疫室→所有工作结束后→进入污物走廊、脱掉红色拖鞋→进入缓冲间→穿上蓝色拖鞋,进入洗刷、消毒区域,取掉手套、口罩、连体衣,分别放入指定的回收桶中→进入第一更衣室,穿上个人衣(饰)→出屏障系统。 二、物流线路物品→高压蒸汽灭菌器或传递窗或渡槽→消毒传递间→清洁准备室→清洁走廊→饲养室或动物实验室→污物经包装处理→(后室缓冲间)→次清洁走廊→气闸(缓冲间)→清洗消毒室→外部区域。 三、动物流线路外来SPF级实验动物→传递窗→消毒传递间→清洁准备室→清洁走廊→饲养室或动物实验室→生产繁殖或实验处理后→(后室缓冲间)→次清洁走廊→气闸(缓冲间)→清洗消毒室→外部区域。 四、空气(压力)流程新风口→空气初效过滤器→空气中效过滤器→空气高效过滤器→屏障系统内各区域并产生压力梯度: ①清洁走廊→饲养室或动物实验室→(后室缓冲间)→次清洁走廊→气闸(缓冲间)→室外。②(进入屏障系统内)气闸(缓冲间)→第2更衣室→淋浴室→第1更衣室→室外。③(离开屏障系统内)气闸(缓冲间)→清洗准备间

(消毒室)→外部区域。④消毒传递间→传递窗→清洗消毒室→外部区域。 五、注意事项为了防止空气倒流,必须调节并保持4.4中各区域间的压力梯度,同时,必须时刻保证2更衣室、消毒传递间、气闸(缓冲间)至少20Pa的正压。 六、质量记录动物/物品传递管理记录表、动物饲养环境参数与异常情况记录表。

清华大学实验动物研究和使用计划(AnimalProtocol)(201312

清华大学实验动物研究及使用计划(Animal Protocol)(201312版) 此处供IACUC使用: 研究计划编号 批准日期 终止日期 1)为节省审批时间和节约纸张,请首先e-mail本申请书电子版至清华大学实验动物使用与管理委员会(IACUC)工 作邮箱(lac@https://www.wendangku.net/doc/532582261.html,)。 2)接收后将由IACUC秘书进行格式审查,假如符合要求,将递交给IACUC委员会所有成员进行审阅。IACUC秘书将 收集修改意见反馈给申请者。时间间隔一般为2周。 3)研究计划被批准后,PI签字后正式生效。请递交一式一份纸质版到实验动物中心1182房间订购动物。 A.管理信息:□初次申请□3年复审,请填写已有的研究计划号:() 列出在本计划中所有动物实验操作人员: 注:职责可为:课题设计、主要操作、辅助操作、手术操作、小鼠管理等 列出每个人相对于职责,已有的实验经验和资格 B.研究或教学的目的: 以一般非生物医学背景人员为对象,简述研究目的,以及对人类或动物的健康与解决的科学问题。一般只需要以非科学术语描述做什么以及做这个实验的必要性。 C.危险试剂或感染性试剂: □本计划不使用任何有害物质 □本计划使用有害物质,假如使用 危险试剂的使用需要取得清华大学生物安全委员会的认可。危险试剂包括下列几个范畴: □1. 放射性性物质□2. 致癌物/致突变物□3. 感染物质□4. 重组DNA □5. 肿瘤等细胞系□6. 组织或抗血清□7.其他有害物质 1.请详细描述具体的试剂名称、拟使用剂量,以及给药或使用方式: 2. 请详细描述对人或动物的潜在毒性、并简述安全操作和处理受污染动物及材料的方法及程序:

抗肿瘤药物体内筛选试验标准操作规程(SOP)

抗肿瘤药物体内筛选标准操作规程概述: 抗肿瘤药物是指能够直接杀伤或抑制肿瘤细胞生长或增殖的一类药物,作用机制包括抑制肿瘤细胞核酸或蛋白质的合成、干扰大分子物质代谢、干扰微管系统、抑制拓扑异构酶等。 本操作规程包括与抗肿瘤药物申请临床试验和申请上市有关的非临床有效性和安全性研究的内容,其中着力强调非临床有效性和安全性之间的关联性,以及非临床研究和临床试验之间的关联性。旨在一方面为抗肿瘤药物的非临床研究提供技术参考;另一方面,通过技术要求引导科学有序的研发过程,使国内此类药物的研发更趋规范和合理。 本操作规程仅代表目前对抗肿瘤药物非临床研究的一般性认识。具体药物的非临床研究应在本指导原则的基础上,根据药物的自身特点制订研究方案。 研究目的: 建立一套包括抗肿瘤药物体内作用的药效学研究和评价体系及相应的标准操作规程以 及抗肿瘤药物安全性和作用新机制的研究。 ①有效性研究 抗肿瘤药物有效性研究的目的主要在于探索受试物的作用机制、作用强度、抗瘤谱等,为之后的安全性评价以及临床试验中适应症、给药方案的选择提参考信息。 ②安全性评价 安全性评价的目的主要包括:(1)估算 I 期临床试验的起始剂量;(2)预测药物的毒性靶器官或靶组织;(3)预测药物毒性的性质、程度和可逆性;(4)为临床试验方案的制订提供参考。 研究计划: (a)小鼠急性毒性测试

按照急性毒性测试的常规方法,选用昆明种小鼠,通过腹腔注射方式给药,测定体外抗肿瘤活性突出的化合物的半数致死量(LD50),参考给药小鼠体重变化情况,评价化合物的急性毒性,并确定小鼠体内抗肿瘤活性测试的给药剂量。 (b)小鼠体内抗肿瘤活性测试 根据动物体内抗肿瘤活性测试的标准方法,选用昆明种小鼠,皮下接种肉瘤S180或肺癌H22瘤株,选择体外活性突出且急性毒性较低的化合物,设定合适的剂量通过腹腔注射方式给药,以临床常用抗肿瘤药物环磷酰胺作为阳性对照药物,测定肿瘤生长抑制作为体内活性评价指标。 (c)专利保护范围内的化合物的继续合成 申请保护范围较大的专利,合成部分可能具有良好活性的新的化合物,拓展研究范围,发现活性更强的化合物,并申请新的发明专利。并可针对具体化合物申请从属专利,延长高活性化合物的保护期限。 (d)体外抗肿瘤活性的广泛筛选 采用MTT法或台盼蓝染色法,测定化合物对多种人肿瘤细胞株的增殖抑制活性,确定化合物在不同瘤株间抗肿瘤活性的选择性,为裸鼠模型实验提供依据。 (e)抗肿瘤作用机理的深入研究 根据抗肿瘤(f)人癌裸鼠移植瘤模型实验活性化合物作用机理特征,选用微管蛋白聚合等实验从分子水平确认化合物的作用机理;利用人脐静脉血管内皮细胞探讨化合物对内皮细胞骨架的影响及诱导凋亡的途经,从细胞水平上阐明化合物的作用机理。 根据抗肿瘤新药审批办法的要求,采用裸小鼠皮下接种模型和/或原位移植瘤模型,以相对肿瘤增值率和生存时间为指标,确定化合物的抗肿瘤活性。 (g)动物体内药物代谢动力学实验

自噬与泛素化蛋白降解途径的分子机制及其功能

HEREDITAS (Beijing) 2012年1月, 34(1): 5―18 ISSN 0253-9772 https://www.wendangku.net/doc/532582261.html, 综 述 收稿日期: 2011?06?03; 修回日期: 2011?08?19 基金项目:转基因生物新品种培育重大专项(编号:2009ZX08009-148B)资助 作者简介:陈科, 博士研究生, 研究方向:动物发育遗传学。E-mail: chenke@https://www.wendangku.net/doc/532582261.html, 通讯作者:周荣家, 教授, 博士生导师, 研究方向:动物发育遗传学。E-mail: rjzhou@https://www.wendangku.net/doc/532582261.html, 网络出版时间: 2011-8-24 11:11:40 URL: https://www.wendangku.net/doc/532582261.html,/kcms/detail/11.1913.R.20110824.1111.004.html DOI: 10.3724/SP.J.1005.2012.00005 自噬与泛素化蛋白降解途径的分子机制及其功能 陈科, 程汉华, 周荣家 武汉大学生命科学学院, 武汉 430072 摘要: 细胞内所有的蛋白质和大多数的细胞外蛋白都在不断的进行更新, 即它们在不断地被降解, 并被新合成 的蛋白质取代。细胞内蛋白的降解主要通过两个途径, 即自噬和泛素蛋白酶体系统。自噬是一种由溶酶体介导的细胞内过多或异常蛋白质的降解机制。在细胞内主要有3种类型的自噬, 即分子伴侣介导的自噬、微自噬和巨自噬。泛素蛋白酶体系统是由泛素介导的一种高度复杂的蛋白降解机制, 它参与降解细胞内许多蛋白质并且这个过程具有高度特异性。细胞内蛋白质的降解参与调节许多细胞过程, 包括细胞周期、DNA 修复、细胞生长和分化、细胞质量的控制、病原生物的感染反应和细胞凋亡等。许多严重的人类疾病被认为是由于蛋白质降解系统的紊乱而引起的。文章综述了自噬和泛素化途径及其分子机制, 以及蛋白质降解系统紊乱的病理学意义。 关键词: 蛋白质降解; 自噬; 泛素蛋白酶体系统 Molecular mechanisms and functions of autophagy and the ubiq-uitin-proteasome pathway CHEN Ke, CHENG Han-Hua, ZHOU Rong-Jia Life Science College , Wuhan University , Wuhan 430072, China Abstract: All proteins in eukaryotic cells are continually being degraded and replaced. Autophagy and the ubiq-uitin-proteasome system are two mechanisms for intracellular protein degradation. Autophagy is mediated by lysosome, and is further divided into chaperone-mediated autophagy, microautophagy and macroautophagy. The ubiquitin-proteasome system is highly complex and mediated by ubiquitin, which participates in intracellular protein degradation in a specific manner. It is now known that degradation of intracellular proteins is involved in regulation of a series of cellular processes, including cell-cycle division, DNA repair, cell growth and differentiation, quality control, pathogen infection, and apoptosis. The aberrations in the protein degradation systems are involved in many serious human diseases. The present review sum-marizes the mechanisms of protein degradation and related human diseases. Keywords: protein degradation; autophagy; ubiquitin-proteasome system 细胞内所有的蛋白质和大多数的细胞外蛋白都在不断的进行更新, 即它们在不断地被降解和被新 合成的蛋白质取代。虽然不断降解细胞内的蛋白似乎很浪费, 但是这个过程在功能上却是非常重要

AFLP实验流程protocol(精)

AFLP实验流程protocol Step1 DNA提取(DNA extraction) Using CTAB method (这个我们现在都是用试剂盒提取了,不知道你们用什么提取,还是发给你,AFLP对DNA纯度和浓度的要求很高,CTAB很难满足这个要求,尤其是纯度要 求) 1.裂解液的制备:检查水浴锅是否有水,打开设温65℃,将CTAB母液预热溶解,按照每 管1ml的体积取CTAB母液,加入3%PVP(即0.03g/管),加热溶解,使用前 ...加入1~2%β-巯基乙醇(即10~20μl/管) 2.取样:称取0.02~0.025g(即20~30mg)硅胶干燥的样品,放入fastprep管中,做好标 记。※NOTE:样品在放入管中时,挑取幼嫩的叶片,尽量不要将叶脉等维管组织放入,切误将一个管中的样品溅入另一个管中。 3.打碎:将称好的样品放入fastprep打碎机中打碎,speed 5.0 time 30s, 取出加入制备好的 CTAB裂解缓冲液800μl/管,(※NOTE:裂解液的体积应该在fastprep管的一半以上,注意盖好管冒,防止裂解液在打碎和裂解的时候溢出。),混匀,使裂解液和样品充分接触,再打一次speed 5.0 time 30s。 4.裂解:水浴65℃,1h,注意在裂解的过程中每隔10min要混匀一次,(※NOTE:越到 裂解的后期动作越要温和,防止DNA剪切破碎。) 5.抽提:取出水浴样品,冷却至室温 .....,加入-20℃等体积(800μl/管)氯仿:异戊醇(24: 1),手摇晃混合均匀 .......,离心:室温,12000r/min,10min。 6.再次抽提:取上层液体约550μl,(※NOTE:尽量少取,不要将杂质一并取出)转入 一个灭菌1.5ml离心管中,做好标记,加入等体积加入-20℃等体积(800μl/管)氯 仿:异戊醇(24:1),手摇晃混合均 ......匀.,离心:4℃,14000r/min,10min。 7.初沉:取上清约。。。μl,转入一个灭菌1.5ml离心管中,做好标记,加入4℃ 0.1倍 体积NaAc (3mol/L pH 5.2),-20℃ 0.6倍体积异丙醇,-20℃沉淀40min,离心:4℃,12000r/min,10min。 8.干燥:弃上清,用小枪头吸干,在超经工作台中倒置干燥40min。打开水浴锅37℃水 浴锅,预热TE。 9.除RNA: 10.抽提RNAse 11.再沉 12.洗涤 13.干燥 14.溶解 15.检测 Using 试剂盒

动物实验室管理规定

动物实验室管理规定 为加强对动物实验室的规范化管理,保证实验动物质量,确保实验研究和检测结果准确可靠以及安全评价符合标准,同时为了防止人畜共患病的发生及蔓延,根据我动物实验室实际情况规定如下: 1.实验动物的管理及使用必须严格按照《实验动物管理条例》和《广东省实验动物管理条例》的有关条款执行。 2.国家对实验动物生产和使用实行许可证制度。本动物实验室(屏障环境)已获得《广东省实验动物使用许可证》,面向广大科研工作者开放。需要开展动物实验的单位和个人,可向动物实验室提出申请,经审批通过并按规定办理相关手续后,即可进入实验室进行实验动物的饲养和实验操作。 3.本办法所称实验动物,是指经人工饲养培育,遗传背景明确或者来源清楚,对其质量实行控制,用于科学研究、教学、医药、生产和检定以及其他科学实验的动物。 4.在动物实验室进行动物实验活动的人员必须严格遵守动物实验实验室各项规章制度,服从工作人员的管理和安排。 5.深圳第三人民医院实验动物管理委员会负责指导和监督实验动物工作,动物实验室具体负责动物实验的管理、监督和检查工作。 6.动物实验室的工作人员(包括管理人员、实验动物技术人员和饲养人员)必须经过正规的实验动物培训,并持有“广东省实验动物学会”颁发的《实验动物技术培训班结业证书》或相关实验动物从业人员资格证书。实验动物从业人员实行定期健康体检制度,确认无传染病(含微生物和寄生虫)和其他影响实验动物工作疾病的人员方可上岗。 7.凡申请进入动物实验室进行动物实验操作的人员(包括研究生)必须提交相关实验动物从业人员资格证书,无证人员必须参加本动物实验室举办的岗前培训,经考核合格并取得深圳第三人民医院动物实验室颁发的《实验动物上岗培训合格证》后,方可申请进入动物实验室从事动物实验操作。 8.购买实验动物必须选择有资质的实验动物生产单位,在动物进入动物实验室的同时提交《实验动物生产许可证》复印件和《实验动物质量合格证》原件。

定点突变protocol

基因定点突变试剂盒 产品简介: 碧云天生产的基因定点突变试剂盒(Site-directed Gene Mutagenesis Kit)可 以用于点突变,多个邻近密码子的突变,单个或多个邻近密码子的缺失 (deletion)或插入(insertion)。 本试剂盒是一个利用目前最新的基因点突变技术设计而成的试剂盒。只 需通过基于PCR的突变质粒的合成,和基于Dpn I的模板质粒的消化,转 化培养以及后续的酶切或测序鉴定,即可得到预期的突变质粒(参考图 1)。累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。 参考图1,使用本试剂盒时需要先设计长度通常为30个碱基以上的互补的 两个引物,在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为模 板,用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位 点的双链质粒,但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来 源于大肠杆菌等细菌,在细菌中会被甲基化修饰,而在体外通过PCR扩 增得到的质粒不会被甲基化。这样用甲基化酶Dpn I处理,可以消化掉待 突变的质粒模板,而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择 性地保留下来。这样把Dpn I处理过的产物转化细菌后,质粒中有两个 nick位点可以被大肠杆菌修复,得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。 本试剂盒提供了DH5α甘油菌,可用于感受态细菌的制备。 本试剂盒共可以进行十次基因定点突变反应。图1. 基因定点突变试剂盒原理图 保存条件: -20℃保存,一年有效。 注意事项: 需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养。 需自行设计和合成用于基因定点突变的引物。需自备用于细菌转化的试剂。 使用本试剂盒前请先阅读后面的常见问题。 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 使用说明: 1. 引物设计: 用于特定基因突变的引物需要单独设计,请参考如下一些基本原则进行设计: (1) 共需设计两条互补的引物。可以先集中设计一条,然后就可以得到互补的另一条引物。 (2) 引物的长度通常为25-45个碱基。 (3) 引物中突变位点任何一侧都必需满足 4X(GC碱基数)+2X(AT碱基数) ≥45。但引物也不宜过长,否则通常会形成非常 稳定的二级结构。通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右,且使两侧按照上述计算得到的数值相近。 例如引物为agtcaggccaattcg aag cagtcgaattgccaag,其中蓝色的aag为突变位点,则

实验室相关标准操作规程完整

实验室生物安全实施标准操作规程 1、目的:预防与控制院感管理工作达到预期目标,防止医务人员发生职业暴露。 2、适用范围:检验部门工作人员。 3、定义:无 4、管理要求: 4.1进入规定 4.1.1在实验室入口处应贴生物危害警告标志。注明病原微生物、实验室生物安全等级和负责人电话。 4.1.2未经许可,非授权人员不应进入实验室。 4.1.3. 实验室门应保持关闭状态。 4.1.4. 与实验室工作无关的动物、个人衣物不应带入实验室。 4.2.个人防护 4.2.1.工作服 4.2.1.1. 在实验室工作时,应穿着工作服。 4.2.1.2. 不应穿着实验室工作服离开实验室。 4.2.1.3. 实验室工作服不应与日常服装放在一起。 4.2.2.手套 在进行可能直接或意外接触到血液、体液以及其他具有潜在感染性材料的操作时,应戴上合适的手套。脱手套后应洗手。用过的一次性手套应丢入感染性医疗废物袋内。 4.2.3.洗手 脱手套后以及离开实验室前,都应洗手。 4.2.4.其他防护 4.2.4.1. 当有可能受到喷溅物污染、碰撞或人工紫外线辐射伤害时,应戴合适的护目镜。 4.2.4.2. 不应再实验室内穿露脚趾的鞋子。 4.2.4.3. 不应在实验室工作区域进食、饮水、吸烟、化妆和处理接触镜(隐形眼镜)。 4.2.4.4. 不应在实验室工作区域内储存食品和饮料。 4.3.实验室工作区 4.3.1. 实验室应保持清洁整齐,严禁摆放和实验无关的物品。 4.3.2. 每天工作结束后,应消毒工作台面和生物安全柜台面。活性物质溅出后要随时消毒。 4.3.3. 所有受到污染的材料、标本和培养物应废弃于医疗废物容器内,不得与普通垃圾混放。需要清洁再利用的材料,应先压力蒸汽灭菌处理。 4.3.4. 需要带出实验室的手写文件应保证在实验室内没有受到污染。 参考文献:[1] WHO. 实验室生物安全手册,第3版.2004. 5、标准无 6、流程(无) 7、表单(无) 8、相关文件 8.1参考文献:[1] 中华人民共和国卫生部. 公共场所集中空调通风系统卫生规范[S].2006. [2] 中华人民共和国卫生部.医院空气净化管理规范[WS/T 368-2012].

去泛素化

[分享]讲座教授朱健康《Nature》文章解析表观遗传学[复制链接] bbioo Administrator 积分 17006 秀蛋白 3487 个 秀基因 7845 个 帖子 367 楼主 发表于 2009-8-26 08:21 |只看该作者|倒序浏览 |打印 摘要:来自美国加州大学河滨分校植物科学系,植物分子生 物学中心,普渡大学园艺及园林系的研究人员发现了组蛋白 H2B去泛素化(deubiquitination)在表观遗传DNA甲基化和 异染色质沉默方面的调控作用,在DNA甲基化修饰与泛素化之 间建立了新联系,也为DNA甲基化修饰研究提出了新观点,这 一研究成果公布在6月7日《Nature》上。 生物通报道:来自美国加州大学河滨分校植物科学系,植物分 子生物学中心,普渡大学园艺及园林系的研究人员发现了组蛋 白H2B去泛素化(deubiquitination)在表观遗传DNA甲基化 和异染色质沉默方面的调控作用,在DNA甲基化修饰与泛素化 之间建立了新联系,也为DNA甲基化修饰研究提出了新观点, 这一研究成果公布在6月7日《Nature》上。 这一文章的通讯作者是加州大学河滨分校的朱健康教授,其早 年毕业于中国农业大学,现任加州大学河滨分校教授,整合基 因研究所所长,2005年被聘为中国农业大学长江学者讲座教 授。 原文检索: Nature 447, 735-738 (7 June 2007) | doi:10.1038/nature05864; Received 23 February 2007; Accepted 24 April 2007 Control of DNA methylation and heterochromatic silencing by histone H2B deubiquitination [Abstract] 在基因组中除了DNA和RNA序列以外,还有许多调控基因的信 息,它们虽然本身不改变基因的序列,但是可以通过基因修饰, 蛋白质与蛋白质、DNA和其它分子的相互作用,而影响和调节 遗传的基因的功能和特性,并且通过细胞分裂和增殖周期影响 遗传,这就是表观遗传学(epigenetics)。 在表观遗传学研究中,小分子RNAs(Short interfering RNAs, siRNAs)可以引导DNA甲基化,以及异染色质组蛋白修饰,导 致序列特异性转录基因沉默。目前已知动物和酵母组蛋白H2B 能单泛素化(monoubiquitinate),这能调控H3组蛋白的甲

RNA提取protocol

TRIzol 提取RNA 实验试剂: TRIzol、氯仿、异丙醇、75%酒精、DEPC水 实验用具: 4℃离心机,1mL、200uL、100uL移液器,1.5mL、200uL EP管,一次性手套、口罩等 操作步骤 1. 样品处理 取新鲜或-70℃冻存小鼠视网膜尽量剪碎,每50-100 mg组织加入1 ml TRIzol,匀浆仪进行匀浆处理。(可先加200uLTRIzol直接用移液枪打碎视网膜,再加TRIzol至1mL) 可选步骤:当样品富含蛋白质,脂肪,多糖或是细胞外物质例如肌肉,脂肪组织和植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。匀浆化后在2~8°C的条件下以12,000×g的离心力离心10分钟,移除匀浆中不溶解的物质,余下的沉淀中包含有细胞外膜,多糖,以及高分子量DNA,而RNA存在于上清中。对于脂肪组织的样品中,大量的脂肪漂在最上层也应该除掉。吸取上清备用。 2. 将匀浆样品反复吹打几次,在室温条件下静置5min,使蛋白核酸复合物完全分离。 3. 向以上溶液中加入氯仿,每使用1ml TRIzon加入0.2ml氯仿,盖好管盖,剧烈振荡15秒,室温放置2-3min。 4. 4℃12,000 rpm离心15分钟,此时样品分成三层:红色有机相,中间层和上层无色水相,RNA主要在水相中,把水相(约600μl)转移到一个新的离心管(自备)中。 5. 在得到的水相溶液中加入0.5mL异丙醇(每使用1mLTRIzol加入0.5mL异丙醇),颠倒混匀,室温放置10分钟。 6. 4℃ 12,000 rpm离心10分钟,弃上清。 7. 加入75%乙醇(用无RNase的水配制)洗涤沉淀。每使用1 ml TRIzol用1 ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤一次。 8. 4℃7500rpm离心5分钟,小心吸弃上清,注意不要吸弃RNA沉淀。 9. 室温放置5分钟,晾干。加入30-100 μl无RNase的水,充分溶解RNA(可55~60℃溶解10min),得到的RNA分装于200uL EP管中(每管10uL)。测浓度后保存在-70℃,防止降解。 注意:沉淀不要过分干燥,以免难于溶解。

免疫共沉淀(Co-IP)protocol

免疫共沉淀(Co-IP)Protocol 一、原理: 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X 的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。 二、准备工作: 预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机 1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS; 2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶) 3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到 1.5EP 管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上) 4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中 5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠

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