964细胞工程杨淑慎

第二章细胞工程实验室组成及无菌操作技术

植物细胞培养基的组成成分

1.无机化合物

大量元素(major element) ：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S

微量元素(minor element) ：Fe、B、Zn、Cu、Mn、Co、Mo

2.有机化合物

（1）维生素：直接参与酶的形成以及蛋白质、脂肪的代谢，常用的有维生素VB1(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、VB3（烟酸）、VB9(叶酸)、肌醇以及维生素?C(抗坏血酸)等（2）氨基酸：甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等

（3）其他有机附加物：水解酪蛋白（CH）、椰子汁（CM）、麦芽浸出物（ME）、酵母浸出物（YE）等

3.碳源和能源

常用蔗糖，作为碳源和能源，同时也可维持一定的渗透压；也可用葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖等。

4.植物生长调节物质(Plant growth regulator)

（1）生长素类(auxin)：促进细胞生长和分裂，用于诱导愈伤组织的形成和根的分化，常用的有2,4-D、IAA、NAA和IBA等

（2）细胞分裂素类(cytokinin)：促进细胞分裂；诱导愈伤组织或器官的分化，常用6-BA、KT、ZT等

（3）赤霉素类:常用赤霉酸(GA3)，可促进幼苗茎的伸长生长和胚状体发育成小植株

（4）脱落酸

（5）乙烯

5.固化剂

常用琼脂，一般用量为0.6～1.0％，有时可配成不加固化剂的液体培养基，进行液体浅层培养，液体培养有如下优点：低成本、生长快、移栽成活率高等。

6.其他成分：

活性炭、硝酸银、抗生素等

动物细胞培养基的组成、常用培养基类型、常用溶液

培养基的成分

1.糖类：作为碳源和能源，主要是葡萄糖，含量一般为1g/L（低糖）或4.5g/L（高糖）

2.氨基酸：12种必需氨基酸

3.维生素：包括叶酸、维生素B、烟酰胺和吡哆醇等

4.无机盐类：大量元素包括Na+、K+、Ca2+、Mg2+、PO43-等，微量元素包括Cu2+ ，Zn2+ 和Mn2+等。

5.生长类因子及激素：血清中含有生长因子、促进细胞贴壁的因子、矿物质、激素、脂类等，另外血清可以抑制胰酶的活性。

常用培养基

1.天然培养基：直接取自动物组织提取液或体液作为培养基，如血清、淋巴液、血浆凝块、水解乳蛋白、胶原等，成分复杂，来源有限

2.合成培养基：常用的有BME、MEM、DMEM、IMEM、199、F10、F12、PRMI-1640等，人工设计、化学成分明确，但缺乏各种激素和生长因子，往往需加入5%-10%小牛血清

3.无血清培养基：组成成分已知，一般由基础培养基、激素和生长因子、基质三部分组成

其他常用溶液

平衡盐溶液(BSS)：主要由无机盐和葡萄糖配制而成，用于维持细胞的渗透压、维持pH

值和细胞正常的代谢等；最常用的有PBS、Earl液和Hank’s液。

PH调节液：NaHCO3溶液和HEPES缓冲液

消化液：常用的有胰蛋白酶溶液、EDTA溶液、胶原酶溶液

抗生素溶液：双抗溶液（链霉素、青霉素）

第三章植物组织与细胞培养的基本原理

植物组织培养

植物细胞全能性：（totipotent）是指每个植物细胞都具有该物种的全部遗传信息，在适宜条件下具有发育成完整植株的能力。

脱分化(dedifferentiation)：在离体培养条件下，一个已分化的细胞回复到原始分生组织细胞状态的过程就叫脱分化（或去分化）。

再分化(redifferentiation)：脱分化状态的细胞在特定条件下，重新恢复细胞的分化能力，最终形成各种组织、器官或胚状体等，这一过程称为再分化。

愈伤组织（callus）：脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团，称为愈伤组织。

继代培养(subculture)：对来自于外植体所增殖的培养物(包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代的培养，就称为继代培养。

外植体：植物组织培养中用来进行离体培养的材料,可以是器官、组织、细胞和原生质体。器官发生：是指离体培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。

胚状体：（embryoid）是由组织培养产生的具有胚芽、胚根双极性、类似天然种子胚的结构，具有萌发长成植株的能力。胚状体是由体细胞发育而来，又称体细胞胚(somatic embryo)。人工种子：通过将植物组织培养中所产生的体细胞胚或珠芽等包埋在“人工胚乳”和“人工种皮”里，制成的具有播种功能、类似天然种子的颗粒就称为人工种子。

植物组织培养的理论基础:细胞的全能性。

离体条件下的脱分化和再分化过程

1.诱导期：表现为细胞质增生，细胞核增大并向中央移动，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。

2.分裂期：细胞进行活跃分裂，形成愈伤组织

3.分化期

维管组织分化：脱分化形成的分生细胞再分化形成薄壁细胞，并形成TE（tachary elements 管状分子）细胞。通常把离体培养中管状分子的出现作为组织分化的标志。

形态发生：从愈伤组织上产生不定根或不定芽、胚状体

愈伤组织的类型及其特点

胚性愈伤组织（embryonic callus）：表面光滑、组织结构紧凑、生长缓慢；由等径细胞组成，细胞小、原生质浓厚、无液泡、富含淀粉粒、核大；再生能力强，可再分化形成胚状体或不定芽；

非胚性愈伤组织（non-embryonic callus）：表面粗糙、组织结构松散、生长快速；由不规则薄壁细胞组成，细胞大，高度液泡化，核质比小，可分化出不定根但很难再生出不定芽。影响植物细胞脱分化和再分化的因素

养基：基本培养基、添加物、渗透压

外植体：1.外植体基因型：外植体基因型不同，愈伤组织的诱导及植株再生能力不同；

2.外植体类型：根、茎、叶、花、果等均可作为外植体，但器官分化能力有所不同；

3.外植体发育状态：植物不同部位、不同年龄的外植体，其器官分化能力也不相同（幼态

组织较成年组织具有较高的形态发生能力）；

4.外植体大小不同，其器官分化能力也不同（如茎尖培养）;

5.取材季节不同,其器官分化能力也不同；

6.外植体极性

器官发生的途径、影响器官发生的因素

1.器官直接发生途径：

在外植体上直接产生不定芽/根，通常由表皮细胞或表皮以下几层细胞脱分化后直接转变为胚性细胞而产生

2.器官间接发生途径：（1）外植体经过诱导形成愈伤组织

（2）生长中心的形成：

当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，称之为生长中心或拟分生组织，它们是愈伤组织形成器官的部位。

（3）器官原基及器官形成：

生长中心形成后，按照其已确立的极性，某些细胞开始分化形成维管组织和器官原基，进而分化出相应的组织和器官。

因素

1.外源激素的影响

生长素/细胞分裂素的比例高,促进生根；

生长素/细胞分裂素的比例低,促进长芽。

2.物理因素：光照周期、温度

3.外植体的生理状态：详见四（二）

4.培养物的年龄

胚状体的特性

具有两极性，在其发育早期，在其方向相反的两端分化出茎端和根端，可以直接形成再生植株；胚状体的维管组织与母体植物或外植体的维管组织没有结构上的联系。

人工种子的研制意义

（1）解决了有些作物品种繁殖能力差的问题；

（2）有利于保持杂种一代高产的优势，防止第二代退化；

（3）可以工业化生产，提高农业的自动化程度；

（4）便于贮存、运输和机械化播种，避免试管苗移植的适应阶段；

（5）繁殖速度快，效率高（1升液体培养基可产生10万个胚状体）；

（6）可在人工胚乳中添加营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等，以利胚状体的健康生长。

人工种子的包埋技术

1.繁殖体的处理

（1）体细胞胚的后熟培养与脱水处理

（2）微型变态器官繁殖体适度脱水与表面消毒处理以及必要时的强制休眠处理

（3）微芽为繁殖体的老化处理与筛选

2.繁殖体的包埋

包埋方法：液胶包埋法、干燥包埋法、水凝胶法

3.人工种皮的装配

第四章植物离体无性繁殖和脱毒技术

概念：繁殖系数（breeding coefficient）：也叫增殖系（倍)数或增殖率，是指繁殖材料在一个培养周期内增殖的倍数。

褐变：指在组织培养中，由于材料被切割而使多酚氧化酶活化将组织中的酚类物质氧化形成棕褐色的醌类物质，并向培养基中扩散，抑制培养物生长甚至导致其死亡的现象。离体无性繁殖的类型及其特点

（一）腋生枝型

特点：培养方法简单，苗壮，能保持遗传的稳定性，能长期继代繁殖，嵌合体的性状不易分离。

（二）不定芽型

特点：直接发生：繁殖系数大，遗传稳定性较好，但继代次数有限，且对于嵌合体植株的性状容易发生分离。

间接发生：繁殖系数大，但遗传稳定性较差，容易发生变异。对品种遗传稳定性高的作物一般不采用这种方法。

（三）体细胞胚型

特点：增殖率高，具有双极性，免去生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率仍不高。目前这一途径只局限于柑橘、油棕、咖啡等少数植物。

（四）原球茎型外植体经诱导后，在其周围产生由胚性细胞组成，类似嫩茎的小圆锥状器官（解剖镜下呈桑果形状的圆球突起），称为原球茎，培养一段时间后，原球茎逐渐转绿，叶原基发育成幼叶，再诱导生根后就形成完整的再生植株。如兰花的茎尖培养就是通过这种方式繁殖的。

离体无性繁殖的概念和意义

概念：离体无性繁殖（clonal propagation in vitro）：是指在离体培养条件下，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行无菌培养，经过不断地切割和重复培养，使其增殖并再生形成完整植株，在短期内获得大量遗传性状均一的个体的方法，又称微繁殖(micropropagation)或快速繁殖（rapid clone propagation）

意义

1.取材少；生长周期短，繁殖率高；占用空间小，人为控制培养条件，不受季节和外界环境的影响，便于实现规模化连续生产；

2.与脱毒技术相结合，可提供健康无病毒植株；

3.繁殖苗体积小，不携带病原菌，便于储运和种质材料交换；

4.可以保持F1代的杂种优势以及植物的倍性。

离体无性繁殖的技术步骤

1.供体植株的准备

2.无菌培养物的建立：包括外植体的采集、消毒灭菌、接种及启动培养等

3.培养物的增殖

4.生根培养

5.试管苗的移栽及鉴定

外植体的选择与采集

1.从生长旺盛、无病虫害的健康母株上选材，不要有伤口；

2.最好在晴天的中午或下午取材，不要再雨天、阴天或露水未干时取材；

3.最好避开选用田间材料，可以将其种植在温室或培养箱内；

4.选择易起始培养的组织作为外植体；

5.外植体采集下来以后，如果需要运送的距离较远，则需要冷藏保湿运输。

促进试管苗生根的措施

降低矿质元素和蔗糖；

去掉细胞分裂素；

加入适量的NAA、IBA等生长素；

有时可加入一些酚类化合物（如间苯三酚等）。这些处理可促进生根和壮苗。

试管苗的特点

根：无根毛，根与茎的输导组织不相连，吸收及运输水分效率低。

叶：角质层和蜡质层不发达，容易蒸腾失水；无表皮毛，保水和反光能力差；叶细胞结构疏松，气孔突出，不能关闭，存在排水孔；叶片面积小，光合能力差。

防止褐变的措施

（1）选择适宜的外植体和培养基；

（2）将褐变外植体及时转移到新鲜培养基上；

（3）在弱光或黑暗中培养一段时间；

（4）降低培养温度；

（5）添加吸附剂（如活性炭、聚乙烯吡咯烷酮等）

（6）添加抗氧化剂（硫代硫酸钠、苏糖二硫醇、Vc、间苯三酚等）。

玻璃苗的特征及解决措施

特征：（1）叶、嫩梢呈水晶透明或半透明水渍状，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；

（2）叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；

（3）体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低；

（4）组织畸形，吸收养料与光合器官功能不全，分化能力大大降低，因而很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料；加上生根困难，很难移栽成活。

措施：1）降低细胞分裂素的浓度，调整激素配比；

（2）提高琼脂含量；

（3）适当降低铵态氮、提高硝态氮浓度；

（4）改善容器的通风条件降低容器内的相对湿度；

（5）降低培养温度，增加自然光照；

（6）在培养基中添加间苯三酚、根皮苷或生长抑制剂。

脱除病毒的方法及其基本原理

（一）物理方法

1.热处理

2.低温处理：又称冷冻疗法

（二）化学方法

如孔雀绿、硫脲嘧啶、蛋白质和核酸合成抑制剂、抗生素等

（三）生物学方法

1.茎尖分生组织培养

2.微型嫁接

3.愈伤组织诱导

4.珠心胚培养

植物病毒的检测方法

1.指示植物检测法：利用病毒在已感染的指示植物上出现症状的特征作为鉴别病毒的依据，可采用汁液感染法或嫁接法进行鉴定。

2.血清学检测法：利用抗原和抗体的特异性结合进行病毒检测

3.电子显微镜检测法：可以直接观察病毒是否存在及病毒颗粒的大小、形态和结构

4.分子生物学检测法：通过检测病毒核酸来证实该病毒的存在

第五章植物细胞培养和次生代谢产物生产

概念：细胞起始密度：即开始培养时最低的有效密度，是能使细胞分裂、增殖的最低接种量，不能低于某一临界值，一般为104-105个/ml。

细胞密度：是指单位体积内的细胞数目，常以每ml培养基中所含的细胞数目表示。

悬浮培养：将游离的单细胞或小的细胞团，按照一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。

有丝分裂指数：指在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数。

次生代谢产物：由糖类、脂肪、核酸和蛋白质等基本有机物代谢衍生出来的物质，如酚类、香豆素、生物碱、萜类、甾类、蛋白质和多肽等。

初级代谢物：植物生长、繁殖不可缺少的代谢物质，如氨基酸、蛋白质、核酸、糖类、脂质等。

细胞株：通过单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单个细胞经持续分裂、增殖形成的细胞团，称为细胞株（cell strain）。

两相培养技术：是在培养体系中加入对细胞无毒性的吸附剂和萃取剂，及时将次生代谢物分离出培养系统，防止代谢物积累在细胞中造成反馈抑制和酶类水解，以提高代谢物的产率。

发状根：是用发根农杆菌转化植物细胞而形成的特化器官。发状根具有自主合成植物激素的能力，生长快、分支多，具有比悬浮细胞培养更强的次生代谢产物合成能力。

诱导子：（elicitor）是指能引起植物细胞某些代谢强度或代谢途径改变的物质。它能够刺激植物次级代谢的某一特殊环节，尤其是能够激发植物对微生物的防御机制，诱导植物抗毒素的形成。

植物单细胞培养的意义、培养技术

1.有利于观察细胞个体的分裂、生长和繁殖、分化情况；

2.建立单细胞无性系，进行优良细胞株的选择，有利于生物转化和天然化合物的生产；

3.有利于进行细胞特性、细胞生长规律、细胞代谢过程及其调节控制规律等方面的研究。大规模悬浮培养技术及特点

1.成批培养/分批培养

特点：（1）培养基体积固定

（2）培养过程中，细胞生长，其数目不断发生变化，呈S形增长。

2.连续培养

特点：一方面以一定速率不断地加入新的培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物（细胞和代谢产物）。通过调节流入和流出的速度，使培养物的生长速度一直保持在接近最高值的恒定水平上。

3.半连续培养

特点：培养物的体积逐步增加，反应器内培养液的总体积保持不变；细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续很长时间；可进行多次收获。

分批培养细胞生长曲线及各个时期的特点

延滞期：细胞很少分裂，其长短与接种量大小和继代时细胞所处的生长期有关

对数生长期：细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变

直线生长期：细胞生长和发育最明显的时期

减慢期：生长逐渐缓慢，培养液消耗将近，有毒代谢物质增多，氧气减少

静止期：生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡

细胞活力的测定方法

1.相差显微镜观察法

观察细胞质环流和细胞核存在与否鉴别细胞的死活。环流正常、核存在表明有活力。

2.FDA染色法

先用丙酮配制的0.5%FDA溶液，用时再加入细胞悬浮液中，最终浓度为0.01%，发出绿色荧光的细胞为活细胞。

3.伊凡蓝染色法

用0.025%的伊凡蓝溶液处理细胞，不染色的细胞为活细胞。

植物细胞固定化培养的优点、技术

固定化培养的优点（1）可以减少剪切力对细胞的损伤作用

（2）细胞的生长速度比在悬浮液中的慢，有利于促进次生代谢产物的积累

（3）便于次生代谢产物的收集

（4）细胞位置相对固定，可以建立细胞间的物理、化学梯度，有利于产物的合成

植物细胞固定化的技术

1.包埋法

海藻酸盐包埋法

卡拉胶包埋法

琼脂糖包埋法

琼脂包埋法

膜包埋法

2.吸附法

聚氨酯泡沫吸附法

尼龙网膜固定法

壳聚糖吸附法

植物细胞悬浮培养生物反应器的类型

机械搅拌式生物反应器

气升式反应器

鼓泡式反应器

转鼓式反应器

植物细胞规模化培养生产次生代谢产物的技术要点

1.优良细胞系（株）的建立与筛选

2.扩大培养

3.大型生物反应器培养

4.次生代谢产物的提纯、纯化与测定

提高次生代谢产物生产效率的途径与方法

（一）选择适宜的起始材料

（二）筛选得到高产细胞系（株）

（三）最佳培养基的筛选

（四）最适培养条件的调控

（五）前体饲喂

（六）两步培养法

（七）两相培养技术

（八）发状根的诱导培养

（九）诱导子剌激

第六章植物原生质体培养和体细胞杂交

原生质体分离材料的预处理方法

1.暗处理: 将室温下生长5-7个星期的植物材料在黑暗中放置30h以上，取其叶片制备

的原生质体有活力；

2.预培养: 将除去下表皮的叶片于诱导愈伤组织培养基上培养7天，再用酶消化去壁，

所得原生质体分裂频率较高；

3.预质壁分离：17-20℃酶液中静置半小时，再于28-34℃保温，或将材料置于与酶液中

糖浓度相同的溶液中预培养1h左右，再浸于酶液中消化即可达到质壁分离目的；

4.萎蔫处理: 将叶片于日光或灯光下照射2-6h令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生质体分

离；

5.低温处理:夏季应用的实验材料，其萌动种子应于4℃过夜后再播种，从其植株叶片上

分离的原生质体培养效果较佳。

制备原生质体常用的酶类

A.纤维素酶：如Onozuka R-10及RS，国内常用的为EA3-867，其中含少量果胶酶；

B.果胶酶：如Macerozyme R-10，又叫离析酶，主要含果胶酶，活力较高，其含杂酶较

多，用量不超过2％，作用时间长有毒害作用；此外亦用Pectalyase Y-23，也叫离析软化酶，活力极高，叶片用量一般为0.1％，悬浮细胞为0.05％；

C.半纤维素酶：如Rhozyme HP-150，用于悬浮细胞、豆科根瘤、幼苗子叶及根细胞原

生质体的分离;

D.崩溃酶：为一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果胶酶活性，主要用于一些细胞壁难降解

的植物。

E.蜗牛酶：主要用于花粉母细胞、四分体、小包子或较老组织的原生质体分离。

F.胼胝质酶：主要用于胼胝质的分解，常与蜗牛酶一起用于成熟花粉粒、四分体、小孢

子的原生质体分离。

原生质体的分离方法、纯化方法、鉴定方法、活力测定方法

分离方法：

机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再借助利器或机械磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。

优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。

缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。

酶解分离法

指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。

优点：获得量大，适用广泛。

缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质，会影响所获原生质体的活力。

纯化方法

过滤-离心法

漂浮法

界面法

鉴定方法

1.细胞壁染色法

2.低渗爆破法

活力测定方法

1.识别法：态完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形，放入低渗溶液中，可正常膨大。

2.色法

1FDA染色法

2.伊凡蓝染色法

3.酚藏花红染色法

影响原生质体数量和活力的因素

（一）材料的基因型和外植体

（二）酶的种类、浓度与酶解时间

（三）渗透压稳定剂

（四）质膜稳定剂

（五）酶解方式

（六）pH值

（七）温度和光照

原生质体培养的意义及方法

原生质体培养的意义

1.建立单细胞无性系。

2.用于原生质体融合产生杂种细胞。

3.原生质体容易从外界摄入病毒、细菌、细胞器、细胞核、蛋白质、核酸等，是遗传转

化的良好受体。

4.为细胞生理、细胞分化和发育、原生质体膜与细胞的结构功能、细胞壁再生等理论研

究提供实验材料。

方法

1.体浅层培养

2.固体平板培养

3.固-液双层培养

4.琼脂糖珠培养

影响原生质体培养的因素

1.材料

2.培养基

3.渗透压稳定剂

4.培养密度

5.原生质体的培养条件

体细胞杂交的含义及意义

1.实现远缘杂交，形成新的物种；

2.创造细胞质杂种；

3.培育作物新种质和新品种。

原生质体融合的方法

一）化学诱导融合法

1.NaNO3诱导融合法

2.高钙、高pH法

3.聚乙二醇（PEG）法

（二）物理诱导融合法：电融合法

融合体的类型

1.同质融合：相同亲本原生质体发生融合，结果得到同核体。

2.异质融合：不同来源的双亲原生质体融合而得到异核体。异核体通过细胞有丝分裂进

行核融合、最终形成单核的杂种细胞。

A．谐和的细胞杂种

B．部分谐和的细胞杂种

C．胞质杂种

D．嵌合细胞杂种

杂种细胞的筛选方法

（一）互补选择法

1.激素自主性互补选择法

2.营养缺陷型互补选择法

3.抗性互补选择法

4.遗传互补选择法

（二）机械选择法

1.可见标记选择法

2.荧光标记选择法

3.应用荧光激活细胞分选仪自动分离

细胞杂种的鉴定方法

1.形态学鉴定

2.细胞学鉴定

3.同工酶分析

4.分子生物学方法

第七章植物花药和花粉培养及单倍体育种

花药培养与花粉培养的概念及意义，二者的异同点

花药培养：是指用植物组织培养技术将发育到一定程度的花药剥离下来接种到培养基上进行培养，最终形成完整植株的过程。

花粉培养：又称小孢子培养，是指在无菌条件下，将花粉从花药中游离出来，使其成为分散或游离态，发育成单倍体植株的过程。

意义:1.迅速获得纯合材料，提高选择效率，缩短育种年限：常规育种需4-6年获得纯系，而小孢子培养仅需一年。

2.利用获得的纯合二倍体材料进行植物遗传规律研究，为遗传育种提供依据，减少育种

的盲目性。

3.克服远远杂种的不育性，获得具有双亲优良性状的可育远缘杂种。

4.为细胞遗传学、生理学基因调控等基础性研究提供材料。

花药和花粉培养的异同点：

培养目的相同，均获得小孢子植株。

花药培养属于器官培养；而花粉培养属于细胞培养。

花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；

单倍体产量高。但技术更复杂。

花药培养的一般程序

1.取材

2.预处理

3.外植体消毒

4.接种

5.培养

6.植株再生

7.单倍体植株的染色体加倍

花药预处理方法

1.温度预处理

（1）低温预处理：指在接种之前将材料用0℃以上低温处理一段时间后再接种。应用较多。

处理温度一般在1-14℃，时间从几小时至几十天不等。不同作物所用的预处理温度及时间差异较大。烟草7～9℃，7～14 d；水稻7～1O℃，10～15 d；黑麦1～3℃，7～14 d；大麦3～7℃，7～14d。

（2）低温后处理：指在接种之后将材料置于适宜低温条件下处理一段时间，再转移到正常温度下培养。

（3）高温处理（热击处理）：指花药接种后，先在较高温度下（30-35℃）培养数天，然后再移至正常温度下继续培养。

例子:如烟草，32℃高温；小麦，33℃高温预处理显著地提高了小孢子胚胎发生能力（Touraev，1996）

2.化学预处理

包括高糖、甘露醇、秋水仙素、乙烯利等进行处理。甘露醇仅能维持渗透压，不能提供碳源，其主要原理是造成小孢子营养饥饿，从而使小孢子脱分化。

3.其他:包括γ射线、离心、磁场等。

花粉的分离方法、培养方式

分离方法

1.挤压法

在烧杯或研钵中挤压花药，将花粉挤出后收集培养。

2.自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法)

将花药接种在预处理液或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。

3.机械游离

（1）磁搅拌法：用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来。

（2）超速旋切法：通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。

4.小孢子纯化

对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子

花粉培养方式

1.平板培养

将花粉置于琼脂固体培养基上培养。

2.液体培养

将花粉悬浮在液体培养基中培养，需振荡，以利通气。

3.双层培养

花粉置于固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。

4.看护培养

利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。

5.微室培养

利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养

6.条件培养基培养

利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。

影响花药和花粉培养的因素

1.基因型

2.供体植株生长条件和生理状态

3.花粉的发育时期

4.培养基

5.预处理

6.培养条件

7.接种密度

雄核发育的途径

1、A途径小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成营养细胞和生殖细胞

（1）A-V途径由营养细胞重复分裂形成单倍体

（2）A-G途径由生殖细胞重复分裂形成单倍体

（3）A-VG途径（E途径）由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂，共同形成单倍体（4）C途径营养细胞和生殖细胞通过核融合，形成多倍体植株

2、B途径小孢子第一次有丝分裂为均等分裂，形成大小相近的两个细胞。然后由

这两细胞边续分裂形成单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株

花粉和花药植株的倍性鉴定

（一）染色体计数法

（二）间接鉴定

1.植株形态观察法：株高、叶形、花粉粒外观、结实性等

2.细胞形态学鉴定：叶片保卫细胞的大小、气孔密度、保卫细胞中叶绿体的大小和数

目与染色体倍性具有高度相关性

3.DNA含量测定：流式细胞仪

4.核体积测量法：单倍体核体积较小

5.生化标记鉴定：如同工酶鉴定等

6.分子标记鉴定：DNA分子标记等

第八章植物胚胎培养

概念：植物胚胎培养:是指对胚或具胚器官进行离体培养，使其发育成幼苗的技术。

包括胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养、离体受精等类型。

胚培养:是指在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离出来，置于培养基上进行培养的技术。

胚乳培养:是指将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术。

胚珠培养：在人工控制的条件下，对胚珠进行离体培养，使其生长发育形成幼苗的技术。

离体授粉:指无菌条件下培养离体的未授粉子房或胚珠和花粉，使花粉萌发产生的花粉管进入胚珠完成受精而结实的过程。（60年代）

离体受精:指在离体及人工控制的环境下，精卵细胞融合形成合子，并培养形成再生植株的过程。（90年代）

胚培养的意义、类型

意义1.克服远缘杂交不孕和幼胚败育，获得种间或属间杂种

2.提高种子萌发率，缩短育种周期

3.获得单倍体植株

4.打破种子休眠，促进胚萌发

5.建立高频再生体系

6.胚培养材料可作为转基因受体材料

类型：分为成熟胚培养和幼胚培养两种

胚珠和子房培养的意义

1.防止杂种胚早期败育，获得杂种植株；

2.未受精胚珠培养，可作为试管受精的基础；

3.未受精胚珠和子房培养，能培养获得单倍体植株，用于单倍体育种。

离体授粉和离体受精的意义

（一）可以克服远缘杂交不亲和性，特别是离体子房授粉和离体胚珠授粉，能消除柱头和花柱所造成的受精前障碍。

（二）克服自交不亲和性

（三）诱导孤雌生殖

（四）双受精及胚胎早期发育机理的研究

离体授粉的类型

（1）离体柱头授粉

（2）离体子房授粉

（3）离体胚珠授粉

离体受精的技术要点

1.配子的分离

(1)精细胞的分离：研磨法、渗透压冲击法

(2)卵细胞的分离：酶解法、酶解-解剖法、直接解剖法

2.精卵融合技术

（1）微电融合：85%融合率，只有此法融合的产物再生了植株。

（2）高钙-高PH介导融合：电融合方法的代替技术。

（3）一般钙条件下融合

（3）PEG诱导的融合

3.人工合子的培养与植株再生技术

第九章植物体细胞无性系变异与突变体的筛选

概念：体细胞无性系变异：（somaclonal variation）是指在组织培养植株上表现出来的变异，有时也指培养物（细胞或愈伤组织等）表现出来的变异。

体细胞无性系：Larkinhe Scowcroft(1980)提出把由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系。

后生遗传变异：又称为外遗传变异，是指由于外部影响导致基因表达的改变，从而引起表型上的变异，在有性世代和无性世代都不能稳定保持。例如复幼现象、驯化作用、短暂矮化等。

体细胞无性系变异的类型：分为遗传变异和非遗传变异两种。

遗传基础：

影响体细胞无性系自发变异的因素

1.供体植物

（1）生理状态

以分生组织为外植体的再生植株通常可以维持供体植物的典型性，体细胞变异频率很低。

以分化组织为外植体的再生植株容易发生体细胞变异，其频率与分化程度有关。

（2）供体植物的遗传背景

?基因型：植物基因型不同，其变异频率差异较大。

?倍性水平：多倍体和染色体数目较多的植物，其变异频率比二倍体和单倍体高。

2.培养基

（1）激素：

?培养基激素浓度和不同激素配比对再生植株的染色体倍性有一定的影响。

?激素引起的变异大多为倍性增加；少数情况下激素引起类减数分裂而使倍性减少。

（2）物理状态：

?一般来讲，悬浮培养的细胞较半固体培养的细胞易产生变异。

3.培养类型

?体细胞变异：原生质体培养的植株＞细胞培养＞组织、器官培养

?在细胞培养中，性细胞培养再生植株的变异＞体细胞培养的植株

4.继代次数

?由继代次数引起的体细胞变异普遍存在。一般来说，培养时间越长，继代次数越

多，细胞变异的几率就越高。例如

?玉米从刚诱导的愈伤组织中分化的植株，在形态上与供体植物基本一致，但培养

3年后愈伤组织的再生能力显著下降，再生植株生长异常，细胞学分析显示染色体断裂和带型变异。

体细胞无性系变异的人工诱导方法

1.物理诱变

常用的射线处理包括：X射线、γ射线、中子、紫外线等。选择辐射类型应根据培养类型进行：

?以组织器官为诱导材料，可以选择辐射强度较大的γ射线、中子等进行辐射。

?以细胞或原生质体，则可选择X射线、紫外线等。特别是以原生质体为诱导材料

时，可以使用紫外线照射。因为常用紫外线的波长为270nm，与DNA的吸收波长260nm相近，而原生质体没有细胞壁的屏障，对紫外线的敏感性较强，从而可以达到较好的诱导效果。

2.化学诱变

常用的化学诱变剂有：

?碱基类似物：核酸复制时，可掺入到新合成的DNA分子中引起错配；

?烷化剂：如环氧乙烷，可改变DNA结构而引起突变；

?DNA分子结构插入物：如亚硝酸，可改变遗传密码的阅读顺序而导致突变。

突变体的筛选方法

1.田间表型选择法

2.离体筛选

（1）直接筛选

（2）间接选择

第十章植物种质资源的离体保存

概念：种质：是指亲代直接传递给子代的遗传物质。

种质资源：一切具有一定种质或基因并能繁殖的生物类型的总称。

种质保存：是指利用天然或人工创造的适宜环境，借以保存种质资源，使个体中所含有的遗传物质保持其遗传完整性，并能通过繁殖将其遗传特性传递下去。

超低温保存：是指将植物的离体材料经过一定的方法处理后在超低温（-196℃液氮）条件下进行保存的方法

玻璃化超低温保存：是指将植物材料经高浓度玻璃化保护剂处理使其快速脱水后直接投入液氮，使材料和玻璃化保护剂进入玻璃化状态。

种质资源保存的意义

?保护生物多样性的需要：防止资源灭绝

?植物育种工作的基础：节约人力物力、便于交流

种质资源离体保存的优点

?占用空间少，节省人力、物力和土地；

?便于种质资源的交流利用及濒危物种挽救和快繁；

?需要时，可以利用离体培养方法很快大量繁殖；

?避免自然灾害引起的种质丢失。

不足

?对于限制或延缓生长的处理，需要定期转移，连续继代培养；

?易受微生物污染或发生人为差错；

?多次继代培养由可能造成遗传性变异及材料的分化、再生能力的逐渐丧失。

?超低温保存可在一定程度上避免这些问题。

常温限制生长保存的方法

（一）高渗保存法

?通过提高培养基的渗透压，达到抑制培养物生长的保存方法。

（二）生长抑制剂（或延缓剂）保存法

?如ABA、B9、CCC、PP333等

（三）降低氧分压保存法

?降低培养容器内的氧分压，改变培养环境的气体状况、抑制细胞的生理活性、延缓

衰老

（四）饥饿法：

?减去培养基中的一种或几种营养元素，或降低某些营养物质的浓度，使植株处于最

小生长阶段。

（五）干燥保存法

?对愈伤组织或体细胞胚进行脱水处理，然后置于特定的培养基条件下保存。

超低温保存的基本原理

?离体材料在液氮中几乎所有的细胞代谢活动、生长都停止，当解冻后，又能恢复再

生能力。因而排除了遗传性状的变异，同时保存了细胞的活力和形态发生潜能。?降温冰冻过程中，细胞内水分结冰会直接破坏细胞结构。因此在冰冻过程中，通过

避免或尽量减少其细胞内水分结冰而达到冰冻保存的目的。

超低温保存的程序

?植物材料（培养物）的选取

?材料的预处理

?冷冻处理

?冷冻贮存

?解冻

?再培养

超低温保存冷冻处理的方法

（1）传统的降温冷冻方法

A.快速冷冻法：从0℃直接投入液氮中保存，降温速度在1000℃/min以上，适于高度脱

水的材料，如种子、花粉球茎或块根等。

B.慢速冷冻法：在冷冻保护剂存在下，以0.1-10℃/min降温速度从0℃降到-70℃，然后

投入液氮中。此法适合于大多数植物材料。

C.两步冷冻法：在冷冻保护剂存在下，先以0.1-4℃/min降温速度从0℃降到-40℃，平

衡0.5-2h，使细胞达到保护性脱水状态，然后投入液氮中。

D.逐级冷冻法：材料经保护剂0℃预处理后，依次经过-10℃、-15℃、-23℃、-40℃、-70℃

冰浴处理（约5min），然后投入液氮中。

（2）玻璃化保存法

玻璃化是指液体转变为非晶体（玻璃态）的固化过程。

使溶液玻璃化有两条途径：

一是大幅度提高溶液冷冻速度；二是增加溶液浓度

（3）包埋脱水法超低温保存

（4）包埋玻璃化法超低温保存

第十二章动物细胞培养技术

概念：动物细胞培养:是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。

培养细胞生命期:

原代培养:也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周。

特点：细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。

传代培养:当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代或传代培养。初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。

特点：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。

细胞系:原代细胞经第一次传代后，形成的细胞群体，即具有增殖能力、类型均匀的培养细胞，一般为有限细胞系。

细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得到的单一类型的细胞群体。

器官培养:是指从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离而直接在体外培养，保持其原有器官细胞的结构和联系。

体外培养细胞的形态分类

贴附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。

悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。

粘附型细胞的生长类型及其特点

1.成纤维细胞型

生长特点：排列成放射状、漩涡状，并不紧靠连成片，细胞与细胞间接触易断开而单独行动。

2.上皮细胞型

生长特点：易相连成片，生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动。

3.游走细胞型

生长特点：在支持物上散在生长，一般不连接成片，细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动。

4.多形细胞型

生长特点：有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，生长时呈多角形生长，并伸出较长的神经纤维，难以确定他们的规律和稳定的形态，可通归入多形细胞型。

消化细胞常用的酶类

胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、黏蛋白酶、蜗牛酶、透明质酸酶、溶菌酶、木瓜酶等动物细胞体外培养的一般过程

1.取材

2.原代培养

3.传代培养

4.细胞的冻存复苏

原代培养的方法

1.组织块培养法

（1）薄层培养法

（2）翻转干涸法

2.分散细胞培养法

（1）机械分散法

（2）消化分散法

动物细胞大规模培养的方法

1.转瓶培养：培养过程中转瓶不断旋转，是细胞交替接触培养液和空气。

2.反应器贴壁培养：细胞贴附于反应器内固定的表面生长。

特点：比较容易更换培养液，不需要特殊的分离和培养设备，但难以扩大规模。

3.悬浮培养

主要用于非贴壁依赖型细胞的培养。

特点：成本较低，可连续收集部分细胞进行传代培养，传代时无需消化分散。

4.固定化培养

将细胞与非水溶性载体结合起来，在生物反应器中进行大规模培养。

大规模培养的工艺类型

1.分批式培养：细胞和培养液一次性加入和取出

2.流加式培养：培养过程中连续或半连续流加浓缩培养液，培养结束后取出反应体系。

3.半连续式培养：也称反复分批式培养，培养过程中多次取出部分培养物，再补充等量新的培养液。

4.连续式培养：培养过程中连续排出培养物，同时连续加入新鲜的培养液

5.灌流式培养：培养过程中不断排出部分旧培养液，同时不断灌注新的培养液。

固定化培养的方法

（1）微载体培养法

以葡聚糖或其他聚合物制成直径从几十微米到几百微米的固体小珠——微载体。将细胞吸附在其表面，共同悬浮于培养容器中培养。每毫升培养基可达到1000万个细胞的密度。

（2）多孔微载体培养法

其内部具有网状结构的小孔，能最大限度地扩大比表面积，细胞在孔内生长，可免受机械损伤。

（3）中空纤维培养法

由丙烯聚合物制成中空纤维，能高度透过小分子营养物质，细胞能在其外壁上附着生长。通常一个培养筒内由数千根中空纤维组成，然后封存在特制的圆筒内，组

成培养系统。该系统主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。

（4）微囊培养法

将细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，逐滴滴入氯化钙溶液中，形成小球，再先后用聚-L-赖氨酸和聚乙烯胺溶液处理，表面形成一层半透膜，制成微囊。其代谢过程中的废物可通过半透膜不断排出，但分泌的活性蛋白则积累在半透膜形成的囊内。

器官培养的方法

1.表玻璃器官培养法

2.琼脂凝胶培养法

3.擦镜纸培养法

4.金属格栅器官培养法

5.琼脂小岛器官培养法

6.陈氏滤纸虹吸器官培养法

7.灌流式器官培养法

8.器官灌注培养法

第十三章动物细胞融合

概念：抗体：抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免疫球蛋白，即抗体。

单克隆抗体：每一个B细胞形成的浆细胞群就是一个纯系，即一种克隆，只针对一个抗原决定簇起作用。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体（McAb），简称单抗。

多克隆抗体：在体液免疫反应中，由一个抗原分子上的多个决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，在免疫动物的血清中都混合在一起。这些由同一抗原诱导而产生的针对多个抗原决定簇的抗体就是多克隆抗体，简称多抗。

基因工程抗体：对抗体的基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双特异性抗体等。

动物细胞融合的方法

（一）仙台病毒法

（二）ＰＥＧ法

（三）电融合法

融合细胞的筛选方法

1.非选择性筛选

2.选择性筛选（酶缺陷型、营养缺陷型、温度敏感性、形态和行为等标志，建立了

多种选择系统）

HAT选择系统

HAT系统为次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的缩写。它是根据嘌呤和嘧啶生物合成途径设计的分离杂种细胞的特殊培养基。

细胞内核苷酸的生物合成有两条途径：一条是从头合成途径，另外一条是补救途径。

从头合成途径中叶酸及其衍生物是必不可少的，氨基蝶呤（A）可抑制二氢叶酸还原酶活性，从而阻断细胞中DNA的合成。

补救途径需要两种酶参与：一种是HGPRT酶（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶），另一种是TK酶（胸腺嘧啶核苷激酶）。他们可以分别利用次黄嘌呤催化产生的肌苷酸及胸腺嘧啶核苷催化产生的脱氧胸苷来合成DNA。H、T为应急途径时提供外源核苷酸“前体”。

在氨基蝶呤存在时，阻断了核苷酸的从头合成IMP的途径，细胞只能通过HGPRT 使次黄嘌呤酸化形成次黄苷酸，再依次转化为AMP及GMP，即通过“补救途径”来合

成核苷酸。因此，一个HGTRP-或TK-的细胞株不可能在含有HA T的培养液中生长。但这样的细胞与能提供HGPRT或TK酶的细胞融合后，杂交细胞能在含HAT培养液中存活下来。

动物细胞融合的应用

1.用于树突状细胞抗肿瘤疫苗的研究

2.用于生产单克隆抗体

3.用于体细胞核移植和动物育种

4.用于细胞疗法

5.在基础理论研究方面的应用

（1）用于基因定位和绘制人类基因图谱

（2）用于揭示疾病发生的机制

（3）用于遗传基因的缺陷互补研究

（4）用于分化功能的表达调控研究

（5）用于膜蛋白动力学研究

杂交瘤技术的基本原理

即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术，就是将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞进行融合，得到可在培养基中长期快速生长的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既具有B淋巴细胞分泌特异性抗体的能力，又具有骨髓瘤细胞在体外无限增殖的特点，可持续分泌成分单一的、具有高度特异性的单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。

单克隆抗体的制备过程

1.融合细胞的准备

2.细胞融合

3.杂交瘤细胞的选择性培养

4.抗体筛选及克隆化培养

5.单克隆抗体的生产

6.克隆抗体的鉴定

第十四章胚胎工程

概念：胚胎工程：是在胚胎移植技术上发展起来的现代生物技术，在畜牧业生产和临床上具有广泛的应用。它主要包括体外受精技术、胚胎移植技术、胚胎分割技术、胚胎冷冻保存技术和性别控制技术等。

胚胎移植：是指对优良雌性动物进行超数排卵处理，在其发情配种后一定时间内从其生殖道取出早期胚胎，移植到同期发情的普通雌性动物生殖道的相应部位，让其生产后代的技术，俗称“借腹怀胎”。

体外受精：是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。

试管动物：体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称为试管动物。

胚胎分割：就是采用显微操作系统将早期胚胎分割成二分、四分甚至八分胚，然后移植入受体中，从而得到同卵双生或同卵多生后代的技术。

胚胎融合：又叫胚胎嵌合，是将两枚或两枚以上胚胎的部分或全部细胞融合在一起，使之发育成一个胚胎，然后移植到受体母畜体内让其继续发育形成一种嵌合体后代的技术。

核移植技术：是一种利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵内的精细技术。

胚胎移植的意义、基本程序

胚胎移植的意义

1.发挥优良母畜的繁殖潜力，迅速扩大优良畜种数量，加速优良畜种的推广应用；

2.在育种上可以缩短世代间隔、增加选择强度，促进家畜改良速度；

3.长期保存冷冻胚胎，便于优良品种的种质运输和保存；

4.是胚胎分割、胚胎嵌合、性别鉴定和核移植等其它胚胎生物技术的基础，所有胚胎工程技术成果最终通过胚胎移植实现。

基本程序

1.供体和受体的选择

2.供体的超数排卵

3.受体的同期发情处理

4.人工受精及胚胎回收

5.胚胎检查及质量鉴定

6.胚胎移植

体外受精的意义、技术要点

意义：1.可在短时间内生产大量优质廉价的胚胎，加速良种家畜的繁育进程；

2.为胚胎工程的其他研究如胚胎性别鉴定、胚胎嵌合等提供合适的实验材料；

3.可揭示受精机理和早期胚胎的发育本质，为动物胚胎学、发育生物学提供重要的理论依据。

体外受精技术主要包括以下几个主要方面：

卵母细胞的回收及成熟培养

精子的采集与获能处理

体外受精

受精卵的体外培养

克隆的含义

获得遗传背景相同的DNA、细胞、或个体群体的过程

动物克隆技术的意义

1.培育优良畜种，扩大良种种群；

2.制备转基因克隆动物，进行生物药物生产；

3.开展异种动物克隆，拯救濒危动物；

4.与干细胞技术结合，开展治疗性克隆；

5.利用核移植技术，研究生物学的基本问题，如动物个体发生的核质互作关系、细胞核的去分化和重新编程问题等。

胚胎分割的意义

胚胎分割技术可以使胚胎移植的胚胎数目成倍增加，产生遗传性状相同的后代，因此是一种广义上的克隆技术，这对畜牧业和实验研究有重要意义。此外，应用胚胎分割技术还可以控制性别。

胚胎融合的意义

（1）可以作为研究分析哺乳动物发生机制的重要手段，例如研究卵裂球分化潜力、性分化机制与性比、胚胎细胞基因表达的机制；

（2）可以对生理功能分析的应用，例如对免疫功能、遗传病的研究分析；

（3）可以培育杂种个体，甚至是种间杂种；

（4）可以通过制作各种组合的嵌合体，培育新的毛皮动物；

（5）利用种间移植，分析胎儿与母体的相互关系。

核移植的分类、过程

核移植分类：

细胞工程试题及答案

专题2细胞工程 一、选择题 1.运用下列各种细胞工程技术培育生物新品种,操作过程中能形成愈伤组织的是( )。 ①植物组织培养②植物体细胞杂交③动物细胞培养 ④转基因植物的培育 A.①②③ B.①②④ C.①③④ D.①②③④ 2.生物技术的发展速度很快,已灭绝生物的“复生”将不再是神话。如果世界上最后一只野驴刚死亡,以下较易成功“复生”野驴的方法是( )。 A.将野驴的体细胞取出,利用组织培养技术,经脱分化、再分化,培育成新个体 B.将野驴的体细胞两两融合,再经组织培养培育成新个体 C.取出野驴的体细胞核移植到母家驴的去核卵细胞中,经孕育培育成新个体 D.将野驴的基因导入家驴的受精卵中,培育成新个体 3.下列关于细胞工程的叙述,错误的是( )。 A.电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合 B.去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理 C.小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体 D.某种植物甲、乙两品种的体细胞杂种与甲、乙两品种杂交后代的染色体数目相同 4.用高度分化的植物细胞、组织和器官进行组织培养可以形成愈伤组织,下列叙述错误的是( )。 A.该愈伤组织是细胞经过脱分化和分裂形成的 B.该愈伤组织的细胞没有全能性 C.该愈伤组织是由排列疏松的薄壁细胞组成的 D.该愈伤组织可以形成具有生根发芽能力的胚状结构 5.名为“我的皮肤”的生物活性绷带自从在英国诞生后,给皮肤烧伤病人带来了福音。该活性绷带的原理是先采集一些细胞样本,再让其在特殊的膜片上增殖。5~7天后,将膜片敷在患者的伤口上,膜片会将细胞逐渐“释放”到伤口,并促进新生皮肤层生长,达到加速伤口愈合的目的。下列有关叙述中,不正确的是( )。 A.“我的皮肤”的获得技术属于动物细胞工程 B.人的皮肤烧伤后会因人体第二道防线的破坏而导致免疫力下降 C.种植在膜片上的细胞样本最好选自患者本人 D.膜片能否把细胞顺利“释放”到伤口,加速患者自身皮肤愈合与细胞膜上的糖蛋白有关 6.既可用于DNA重组技术又可用于细胞融合技术的是( )。 A.病毒 B.纤维素酶 C.聚乙二醇 D.质粒 7.培育农作物新品种的过程中,常利用植物组织培养技术。下列叙述正确的是( )。 A.培育转基因的外植体得到的新个体属于基因突变个体 B.在植物组织培养过程中用理化因素诱导可获得大量有益突变体 C.单倍体育种中经减数分裂和组织培养两个过程能获得纯合二倍体 D.植物组织培养技术的理论基础是细胞的全能性 8.下列与细胞工程技术相关的表述中,不正确的是( )。 A.植物体细胞杂交技术可以克服常规的远缘杂交不亲和障碍 B.动物细胞培养与植物组织培养所用的培养基成分基本相同 C.动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同 D.植物组织培养技术的理论基础是细胞的全能性 9.经植物组织培养技术培养出来的植物一般很少有植物病毒危害,其原因在于( )。 A.在组织培养过程中经过了脱分化和再分化,进行的是快速分裂和分化

干细胞与组织工程

干细胞与组织工程 随着生命科学的飞速发展，目前组织工程、干细胞研究已经成为21世纪生命科学研究的焦点和前沿领域。组织工程研究涉及种子细胞、生物支架材料以及组织构建等众多研究方向．干细胞研究则有望解决组织工程研究中的种子细胞来源问题，可能成为组织工程研究中的理想种子细胞。 一“组织工程”的概念 1 “组织工程”的产生和发展 组织、器官的损伤或功能障碍是人类健康所面临的主要危害之一，也是人类疾病和死亡的最主要原因。据美国的一份资料显示，每年有数以百万计的美国人患有各种组织、器官的损伤或功能障碍，每年需进行800万次手术进行修复，年住院日在4000万～9000万之间，年耗资超过400亿美元。 随看现代外科学的发展，人类对组织、器官缺损的治疗有了很大的进步，但仍然存在许多问题。目前临床常用的治疗方法有三种： 1.自体组织移植、 2.异体组织移植、 3.人工合成组织代用品 组织工程是近年来正在兴起的一门新兴学科,1984年， Wolter首先提出“组织工程”（Tissue Engineering）一词。1987年，美国国家科学基金会于正式提出和确定“组织工程”一词，开辟了组织工程学研究的新纪元。它是应用生命科学和工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态生物替代物的科学。 从事组织工程研究的科学家们利用细胞生物学、分予生物学以及材料科学等学科的最新技术，像工厂生产零部件一样，针对患音组织或器官缺失情况，利用构成组织或器官的基本单位——细胞以及为细胞生存提供空间的支架材料，在体内外培育出所需的人体组织或器官．需要多少就培育多少．量体裁衣制备完成后再给患者安装上去。 组织工程研究的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体。这一三维的空间结构为细胞提供了获取营养、气体交换、排泄废物和生长代谢的场所，

干细胞

干细胞

目前国内涉及干细胞技术研究与应用的上市公司： 1. ST中源（600645.sh），公司控股57%子公司协和干细胞基因工程目前主营脐带血存储业务（用于治疗白血病），协和干细胞拥有目前全球最大规模之一的天津脐带血造血干细胞库，是我国唯一的的干细胞产业化基地；公司大股东德源投资拟整合资源，突出主业，做大做强生物医药产业、干细胞产业。 2. 友好集团（600778.sh），公司与国家人类基因组南方研究中心共同投资组建的上海申友生物技术（持股56.7%）参与“剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立”研究并完成引物合成和基因测序工作。 3. 复星医药（600196.sh），公司投资建立生物治疗研究中心，主要研究干细胞移植技术及干细胞库和生物治疗技术。

4. 九发股份（600180.sh），控股子公司格兰百克生物制药生产的人粒细胞集落刺激因子rhG-CSF是治疗肿瘤、癌症的特效药，并可用于外周血干细胞移植、骨髓移植等医疗领域。 5. 苏常柴A（000570）/苏常柴B （200570.sz），公司持有25%股权的清华星爷创业投资主要在国内生物技术，尤其是在干细胞与组织工程、基因治疗等领域开展风险投资业务。 6. 四环生物（000518.sz），公司控股子公司神舟细胞工程掌握有国际先进的大规模高效动物细胞培养技术（股权已经于2008年12月8日转让）。 7. 金卫医疗（0801.hk），公司旗下子公司从事脐带血干细胞存储业务，其中金卫医疗拥有北京和广州两个地方脐带血存储业务牌照；公司持有18.9%股权的Cordlife是东南亚地区最大的干细胞库运营商，主要在香港、马来西亚、印度尼西亚运营干细胞库；公司持有70%股权的培到医院是著名血液病和造血干细胞移植专家陆道

细胞与细胞工程教学设计

“细胞与细胞工程”教学设计 佛山顺德一中 孔庆敏 【重点与难点】 重点：生物膜在结构和功能上的联系、生物膜系统的概念； 植物组织培养及体细胞杂交、单克隆抗体。 难点：各种生物膜在功能上的联系、植物体细胞杂交及单克隆抗体。 【延伸与拓展】 第四章：细胞与细胞工程 第一节：细胞的生物膜系统 生物膜的概念：细胞膜、核膜以及组成内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的膜统称为生物膜。 细胞中具有双层膜的细胞器有：线粒体、叶绿体。 细胞中具有单层膜的细胞器有：高尔基体、液泡、内质网。 细胞中具有单层膜的结构有：线粒体、叶绿体、细胞核。 一、各种生物膜在结构上的联系 1．内质网与核膜的联系 A ．内质网膜与外层核膜相连 B ．内质网腔与内、两层核膜间的空腔相通 意义：使细胞质与核内物质的联系更加紧密。 2．内质网与线粒体的联系 有些内质网与线粒体外膜相连 意义：由线粒体供给内质网所需要的能量 3．内质网与高尔基体及细胞膜的联系 A ．内质网膜产生的小泡可以移动到高尔基体成为高尔基体的一部分 B ．高尔基体产生的小泡移动到细胞膜成为细胞膜的一部分 C ．细胞膜产生的小泡可以回到细胞质中 上述关系图示如下： 二、生物膜的化学组成 生物膜主要由蛋白质、脂类和少量糖类组成（表现为统一性）； 但在不同的膜中，上述三种物质的含量是有差别的（表现为差异性）。 三、各种生物膜在功能上的联系 科学家用同位素示踪的方法研究了豚鼠胰脏腺细胞分泌物的形成过程，研究出分泌蛋白的合成和运输过程是： 核糖体合成的蛋白质在上述细胞器的运输过程中，主要发生了以下变化：

在以上过程中，都需要由线粒体提供能量，因为在线粒体内膜上含有大量的与有氧呼吸有关的酶。 可见，在细胞内生物膜在结构上相互联系，在功能上既有明确分工，又紧密配合，使细胞能够顺利地完成各项生理功能。 四、生物膜系统 1．概念： 生物膜是指细胞膜、核膜以及内质网、高尔基体、线粒体等由膜构成的细胞器共同构成的结构体系。 2．作用： （1）使细胞具有一个相对稳定的内环境，并使细胞与周围环境进行物质运输、能量交换、信息传递。 （2）为酶提供大量的附着位点，为生化反应有序进行创造条件。 （3）将细胞分成小区室，使生化反应互不干扰。 五、研究生物膜的意义 1．理论上：阐明细胞生命活动规律。如：蛋白质、糖类和脂类的人工合成和运输。 2．工业上：人工模拟生物膜功能。如：海水淡化、污水处理。 3．农业上：改善作物品质。如：抗寒、抗旱、耐盐机理的研究。 4．医学上：人工膜代替病变器官。如：人工肾中的“血液透析膜”。 第二节：细胞工程简介 概念：细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。 一、植物细胞工程 常用的技术是：植物组织培养和植物体细胞杂交。 理论基础是：植物细胞的全能性。 1．细胞的全能性 概念：细胞的全能性是指生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能。原因是生物体的每一个细胞都含有该物种所特有的全套遗传物质及发育为完整个体所必需的全部基因。 在生物的个体发育中，由于基因在特定时间和空间下选择性地表达而形成不同器官，因此，要实现细胞的全能性，首先必须使生物体的细胞处于离体状态。 2．植物组织培养

干细胞概念股

干细胞，是动物体（包括人体）胚胎及部分器官中具有自我修复能力和多向分化潜力的原始细胞。干细胞是重建、修复病损组织、衰老组织及器官功能的理想种子细胞。 干细胞技术，是指与干细胞相关的生物工程技术，其包含有干细胞生成与诱导演化所需的所有技术研究。干细胞技术中胚胎干细胞技术是极具前景的研究与应用领域。通过胚胎干细胞技术理论上有可能找到攻克人类集体多种顽疾的创新性疗法。 由于在人类干细胞研究领域（特别是克隆技术的研究）上长期饱受道德话题争议与诟病，因此美国对于联邦政府是否应该进一步支持胚胎干细胞研究工作的问题上引起国内长期的激烈争论。鉴于干细胞研究对于人类健康可能产生的突破性贡献，美国国内取消干细胞研究领域限制的呼声日益高涨。在此背景下，2009年3月9日，美国总统奥巴马宣布接触对使用联邦政府资金支持胚胎干细胞领域研究的限制。一石激起千层浪，国内干细胞技术上市公司纷纷强势上涨，激起了市场投资者对于干细胞概念股的跟风热情。 干细胞概念股，顾名思义是指与干细胞技术和应用相关的研究、医疗制品生产相关的干细胞上市公司。由于美国政府对干细胞研究的解禁，相关研究和产业化速度将大为提升，全球干细胞医疗市场规模预计将达到千亿级别。 目前国内涉及干细胞技术研究与应用的上市公司： 1. ST中源（600645.sh），公司控股57%子公司协和干细胞基因工程目前主营脐带血存储业务（用于治疗白血病），协和干细胞拥有目前全球最大规模之一的天津脐带血造血干细胞库，是我国唯一的的干细胞产业化基地；公司大股东德源投资拟整合资源，突出主业，做大做强生物医药产业、干细胞产业。 2. 友好集团（600778.sh），公司与国家人类基因组南方研究中心共同投资组建的上海申友生物技术（持股56.7%）参与“剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立”研究并完成引物合成和基因测序工作。 3. 复星医药（600196.sh），公司投资建立生物治疗研究中心，主要研究干细胞移植技术及干细胞库和生物治疗技术。 4. 九发股份（600180.sh），控股子公司格兰百克生物制药生产的人粒细胞集落刺激因子rhG-CSF是治疗肿瘤、癌症的特效药，并可用于外周血干细胞移植、骨髓移植等医疗领域。 5. 苏常柴A（000570）/苏常柴B（200570.sz），公司持有25%股权的清华星爷创业投资主要在国内生物技术，尤其是在干细胞与组织工程、基因治疗等领域开展风险投资业务。 6. 四环生物（000518.sz），公司控股子公司神舟细胞工程掌握有国际先进的大规模高效动物细胞培养技术（股权已经于2008年12月8日转让）。

基因工程和细胞工程

基因工程和细胞工程 一、单选题 1．如图是基因工程主要技术环节的一个基本步骤，这一步骤需要用到的工具是 A. DNA连接酶和解旋酶 B. DNA聚合酶和限制酶 C. 限制酶和DNA连接酶 D. DNA聚合酶和RNA聚合酶 【答案】C 【解析】图示表示基因表达载体的构建过程，该过程首先需要用限制酶切割含有目的基因的外源DNA分子和质粒，其次还需要用DNA连接酶将目的基因和质粒连接形成重组质粒，故选C。 2．下面关于植物细胞工程的叙述,正确的是（） A．叶肉细胞已经高度分化,无法表现出全能性 B．叶肉细胞经再分化过程可形成愈伤组织 C．融合植物叶肉细胞时,应先去掉细胞膜 D．叶肉细胞离体培养时,可以表现出全能性 【答案】D 【解析】 试题分析：叶肉细胞已经高度分化，但在体外培养的条件下也能表现出全能性，A错误；叶肉细胞经脱分化过程可形成愈伤组织，B错误；融合植物叶肉细胞时，应先去掉细胞壁，C错误；叶肉细胞离体培养时，可以表现出全能性，形成完整植株，D正确 考点：本题考查植物组织培养的相关知识，要求考生识记植物组织培养的原理、过程、条件等基础知识，掌握植物细胞具有全能性的原因，能结合所学的知识准确判断各选项。 3．如图为白菜一甘蓝杂种植株的培育过程。下列说法正确的是（） A．图示白菜一甘蓝植株不能结籽 B．愈伤组织的代谢类型是自养需氧型 C．上述过程中包含着有丝分裂、细胞分化和减数分裂

D．白菜一甘蓝杂种植株具有的性状是基因选择性表达的结果 【答案】D 【解析】白菜和甘蓝都是二倍体，它们的体细胞杂交后培育的“白菜-甘蓝”杂种植株中2个染色体组来自白菜，2个染色体组来自甘蓝，因为“白菜-甘蓝”属于异源四倍体，是可育的，能产籽，故A错误；愈伤组织是一种高度液泡化的呈无定型状态的薄壁细胞，不能进行光合作用产生有机物，因此愈伤组织的代谢类型是异养需氧型，故B错误；上述过程包括去壁、原生质体融合、植物组织培养等过程，其结果是形成“白菜-甘蓝”幼苗，并未发育到性成熟个体，因此整个过程中有有丝分裂和细胞分化，没有减数分裂过程，故C错误；任何性状都是基因选择性表达的结果，故D正确． 【考点定位】植物体细胞杂交的应用 【名师点睛】据图分析，植物细胞壁的成分是纤维素和果胶，去壁所用的是纤维素酶和果胶酶；原生质体融合所用的方法有物理法和化学法．物理法包括离心、振动、电激等，化学法一般是用聚乙二醇；再生细胞壁形成杂种细胞；脱分化形成愈伤组织，再分化形成“白菜一甘蓝”幼苗． 4．下列有关细胞工程的叙述中正确的一项是（） A．克隆不是无性繁殖 B．用体细胞克隆动物是通过核移植实现的 C．灭活病毒通过溶解磷脂双分子层诱导动物细胞融合 D．动物细胞培养与植物组织培养所用的培养基成分一样 【答案】B 【解析】 试题分析：克隆属于无性繁殖，故A错误。用体细胞克隆动物必须通过核移植才能实现，故B正确。灭活病毒诱导动物细胞融合不是溶解磷脂双分子层而是通过改变膜脂分子排列实现的，故C错误。动物细胞培养液通常需要加入血清，植物组织培养通常需要加入植物激素，故D错误。 考点：本题考查细胞工程相关知识，意在考察考生对知识点的识记理解掌握程度。5．以下哪种物质不可以用于植物细胞的诱导融合剂（） A．PEG B．灭活的病毒 C．离心 D．振动电激 【答案】B 【解析】 试题分析：灭活的病毒是动物细胞工程的诱导剂，不能用于植物细胞工程，故选B。 考点：本题考查植物细胞工程等相关知识，意在考察考生对知识点的识记理解掌握程度。6．下列有关植物细胞工程的叙述，正确的是（） A．在植物组织培养过程中，细胞的遗传物质一般都发生改变 B．植物细胞只要在离体状态下即可表现出全能性 C．植物组织培养过程中始终要保持适宜的光照 D．植物耐盐突变体可通过添加适量NaCl 的培养基培养筛选而获得 【答案】D 【解析】 试题分析：在植物组织培养过程中，细胞的遗传物质一般不发生改变，A错误；植物细胞的全能性指离体的组织器官的经过培养，发育成完整个体的潜能，B错误；植物组织培养过程中开始是要避光，C错误；植物耐盐突变体可通过添加适量NaCl 的培养基培养筛选而获得，D正确；答案是D。 考点：本题考查植物细胞工程的相关知识，意在考查考生理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力。 7．植物组织培养的过程可以归纳为：①? ?再分化③→④；对此叙述有错误的 ?→ ?→ ?脱分化②? 是( ) A．②→③的再分化过程中，培养基中需要添加细胞分裂素与生长素

植物细胞工程综合大实验

植物细胞工程综合大实验（一） ——培养基配制和无菌操作 一、实验目的与要求 熟练掌握器皿的洗涤 MS培养基的配制分装 培养基和物品的高压灭菌 实验室的消毒灭菌 植物材料的取材及流水冲洗 无菌操作 材料的培养观察 二、实验原理 植物细胞的全能性。 三、仪器设备与器具 电子天平、移液枪、冰箱、高压锅、超净工作台、 三角瓶、烧杯、容量瓶、培养皿、搪瓷缸、镊子、 解剖刀、酒精灯、试剂瓶、玻璃棒、线绳、pH试纸、封口膜、试管刷、洗涤剂、打火机等。 四、实验材料 彩云阁茎段（用于诱导愈伤组织） 茎节（用于诱导芽） 五、实验方法与步骤 （一）器皿的洗涤

一般器皿 有培养物但未污染的器皿 有培养物且污染的器皿 （二）MS培养基的配制分装 1、MS培养基母液的配制 母液A-F，每组配制A-E 100ml、F 50ml 0.1%升汞的配制 75%酒精的配制 6-BA NAA 2、MS培养基的配制 按每人配制100ml，分5小瓶。 过程如下；每组按1L配制，先取容器内加70%的蒸馏水； 加入蔗糖30g/L；量取母液A-F；加入PGR（自己设计）；用容量瓶定容；用0.1-1N NAOH或HCl调整pH5.6-5.8；每人分100ml；加琼脂粉8g/L；分装到5个小三角瓶中、封口。 （三）培养基和物品的高压灭菌 培养基、无菌水（每组至少5瓶）、空瓶（每组至少2个）、烧杯（每组至少1个）、培养皿（每组至少一套）、接种工具（2套），包好或者分好以备高压灭菌。 高压锅的使用。 （四）实验室的消毒灭菌

75%的酒精擦拭超净工作台内表面，新洁尔灭水进行超净工作台外表面、培养架表面、墙壁及其他房间表面的擦拭。 （五）植物材料的取材及流水冲洗 选取适宜的彩云阁茎节及茎段，切割成适宜大小后放在流水下冲洗。 （六）无菌操作 演示。 （七）材料的培养观察 接种完的材料放在培养室的培养架上进行培养。培养初期每天观察一次，持续1周。之后每2-3天观察一次。 统计指标： 污染率（%）= （污染的外植体个数／接种外植体的总数）×100%。 愈伤组织诱导率（%）= （长愈伤外植体个数／接种外植体总数）×100%。 芽诱导率（%）= （长芽外植体个数／接种外植体的总数）×100%。（八）结果与分析

细胞与细胞工程 论文

细胞与细胞工程 摘要：细胞生物学在19世纪以前，许多学者的工作，都着眼于细胞的显微结构方面，主要从事于形态上的描述，1838-1839年，德国植物学家施莱登和动物学家施旺根据自己研究和总结前人的工作，首次提出了细胞学。 细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似于工程学的步骤在细胞整体水平或细胞器水平上，遵循细胞的遗传和生理活动规律，有目的地制造细胞产品的一门生物技术。 关键词：细胞生物学、、研究内容和现状、研究趋势、重要领域、学习方法及态度染色体工程细胞融合工程 1.20世纪后半叶生命科学各领域所取得的巨大进展，特别是分子 生物学的突破性成就，使生命科学在自然科学中的位置起了革命性的变化。 2.2.生命科学将成为21世纪自然科学的带头学科 20世纪50年代DNA双螺旋结构模型的发现，随后遗传信息传递“中心法则”的确立与DNA重组技术的建立使生命科学的面貌起了根本性的变化。分子生物学与遗传学的结合将用10一15年测定出人类基因组30亿个碱基对（遗传密码）的全序列，人体细胞约有10万个基因。人类基因组的“工作草图”迄今20％的测序已达99.99%的

准确率和完成率 3.21世纪初生命科学的重大分支学科和发展趋势 80年代有远见的生物学家把分子生物学（包括分子遗传学）、细胞生物学服务、神经生物学与生态学列为当前生物科学的四大基础学科，无疑是正确地反映了现代生命科学的总趋势。遗传学（主要是分子遗传学）不仅当前是生物科学的带头学科，在今后多年还将保持其在生命科学中的核心作用。 植物克隆 组织培养不仅是一种植物快速繁殖的手段，同时也是植物改良、种植保存和次生物质生产的理性途径。[1]烟草作为植物组织培养的“模式植物”之一[2]，在组织培养中有重要的作用。目前烟草的组织培养和细胞培养已有不少报道。[3]近年来对烟草在抗性方面的研究，基因转化和次生物质生产等方面也取得了一些进展。 克隆（ｃｌｏｎｅ）来源于希腊文，表示用离体的细枝或小树枝增殖，后将其引入园艺学，指由一个单细胞或共同的祖先经有丝分裂产生出的细胞或生物体所构成的一个群体，其繁殖是无性的。以后逐渐将克隆的概念应用于植物学，动物学和医学等方面，并形成了比较一致的克隆动物就是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，使后者不经精子穿透等有性过程即可被激活，分裂并发育成个体，使得核供体的基

植物细胞工程

HUAZHONG AGRICULTURAL UNIVERSITY 烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的研究Research on Callus Induction and Plant Regeneration of Tobacco Leaves 姓名: 黄金波 CANDIDATE：Huang-Jin Bo 学号: 2012304200510 STUDENT ID：2012304200510 课程: 植物细胞工程实验CURRICULUM：Plant Cell Engineering Experiment 班级: MAJOR: 生技1201班Biotechnology 1201 指导老师：SUPERVISOR：柳俊齐迎春陈浩 Liu-Jun Qi-Ying Chun Chen-Hao 中国武汉 WUHAN， CHINA

二○一四年十二月DEC, 2014

烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的研究 黄金波 华中农业大学生命科学技术学院生技1201班 [摘要] [目的]以烟草叶片为材料，通过这次实验，基本掌握植物愈伤组织诱导与植株再 生的原理和方法，熟练掌握相关实验操作技术；另外，通过本次实验，完成烟草植株再生，并对比光照和黑暗等不同方法，对诱导愈伤组织状态和诱导率的影响，进行结果分析。 [方法]在无菌条件下，把烟草叶片剪成1cm2大小的小方块，先通过含0.25mg/L NAA和0.25mg/L BA的MS诱导培养基在光照和黑暗条件下诱导培养；三周后，转接到含0.25mg/L NAA和1.0mg/L BA的MS分化培养基中光照培养；两个月后，观察结果，统计分析。 [结果]诱导培养后，在光照条件下和在黑暗条件下培养的均有67.7%的被污染了；用剩下的33.3%全部接种到分化培养基上培养。结果表明分化率在光照条件下和在黑暗条件下无差别；每个愈伤组织分化芽数在光照条件下明显多于在黑暗条件下诱导；分化芽状态在黑暗和光照条件有一定的区别，分化植株苗在光照和黑暗条件下诱导没有明显区别。 [结论]光照条件和在黑暗条件下诱导可以影响愈伤分化芽数和分化芽状态。 [关键词] 烟草叶片；愈伤组织；细胞工程；分化；诱导；植株再生 Research on Callus Induction and Plant Regeneration of Tobacco Leaves Huang-Jin Bo Huazhong Agriculture University , College of Life Science and Technology , Biotechnology 1201 [Abstract] [Objective]Using tobacco leaves as materials, through the experiment, we should handle the basic principle and method of plant callus induction and plant regeneration，master related experiments’technology; In addition, through this experiment, to complete the tobacco plant regeneration, and compared different methods of callus induction, such as light and dark state, and the effects to the state and induction rate, then analyzing the results. [Method]The tobacco leaf was cut into 1 cm2 size small squares under aseptic conditions. Firstly induced in the MS induction medium with 0.25 mg/L NAA and 0.25 mg/L BA, under the condition of light and dark, respectively; Three weeks later, transferred to MS differentiation medium with 0.25 mg/L NAA and 1.0 mg/L BA culturing under light; Two months later , observing the results, and analyzing the statistics. [Results]After the induction culturing, 67.7% materials were polluted both under the condition of light and dark; rest 33.3% materials were inoculated to the differentiation medium, continuing to cultivate. As a result, it was successfully. The results show that there are no obvious differences between with the light condition and dark condition. Each number of callus bud differentiation under the condition of the light induced significantly more than in the

干细胞在治疗运动神经元病中的应用研究进展

干细胞在治疗运动神经元病中的应用研究进展 陈　博※(综述),王丹丹(审校) (协和干细胞基因工程有限公司,天津巿脐带血干细胞库,天津300384) 中图分类号:R338 文献标识码:A 文章编号:100622084(2010)0821147202 摘要:运动神经元病病因至今不明,目前尚无有效药物。成体干细胞因为具有自我复制和多项分化潜能等特点,其移植治疗运动神经元病也成为研究热点。成体干细胞包括脐血源性神经干细胞、自体神经干细胞、自体骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞。各种细胞在取材、临床应用、治疗效果方面都有优缺点。国内外对运动神经元病的治疗研究较少,细胞的选择尚需探索。 关键词:运动神经元病;骨髓间充质干细胞;脐带间充质干细胞 A Rev i ew on Research Progress of Appli ca ti on of Ste m Cells to Trea ti n g D isea ses i n M otor Neu2 ron D isea se　CHEN B o,WAN G D an2dan.(U nion S te m Cell&Gene Engineering L i m ited Co m pany, Tianjin Cord B lood B ank,Tianjin300384,China) Abstract:The cause ofMot orNeur on D isease(MND,mot or neur on disease)re mains unknown,and s o far,there are not effective drugs.Due t o its capability t o differentiate int o multi p le cell types as well as self2renew continuously,ste m cell,es pecially Somatic ste m cell′s researching on treat m ent of the MND with trans p lanting has als o become int o a hot s pot in medical arena.Somatic ste m cells include neural ste m cells,mesechy mal stem cell and human umbilical cord mesenchy mal ste m cells.Vari ous cells has its res pective advantage in s ource,clinical app licati on and treat m ent.There is less research on MND treat m ent,s o it′s i m portant t o choose the most suitable measure ments. Key words:Mot or neur on disease;Bone mesenchy mal ste m cell;Human umbilical cord mesen2 chy mal ste m cells 运动神经元病(mot or neur on disease,MND)是以 选择性侵犯脊髓前角细胞、脑干运动神经元、大脑皮 质锥体细胞和锥体束为主的一组慢性进行性变性疾 病,病因及发病机制复杂,目前尚无有效药物。临床 表现分为肌萎缩侧索硬化、进行性脊肌萎缩症、进行 性延髓麻痹、原发性侧索硬化。干细胞移植为神经 系统疾病的治疗提供了一种新的手段。干细胞按其 起源分为胚胎干细胞和成体干细胞。由于伦理性、 取材困难及致瘤性等原因,胚胎干细胞的研究与使 用受到了限制[1]。目前多数研究中的干细胞为神经 干细胞(neural ste m cells,NSC)和间充质干细胞 (mesenchy mal ste m cells,MSCs),现就这两种干细胞 在治疗MND的应用予以介绍。 1　脐血源性神经干细胞移植 国内有研究报道,脐带血体外培养分化为神经 干细胞,对33例因创伤性脊髓损伤和硬膜外血肿造 成的急性压迫性损害患者进行神经干细胞移植,植 术后7～10d,33例患者损伤的脊髓功能均有改善, 神经干细胞移植后2周至16个月随访资料显示,33 例患者的脊髓功能呈继续改善的趋势[2]。也有研究 者将脐带血间充质干细胞进行分离、培养以及诱导 其向NSC分化,并应用于MND患者的治疗。通过对 11例MND患者治疗前后场致离子显微镜检查评分 及总T细胞进行流式细胞检测发现:脐带血间充质 干细胞来源的神经干细胞移植治疗短期内通过一定 的免疫调节作用,可以改善MND患者的临床症状和 日常生活能力[3]。2　自体神经干细胞移植 国外有研究者将鼠嗅鞘细胞和鼠间充质干细胞移植入肌萎缩侧索硬化动物模型,进行疗效比较。结果显示,两种细胞移植都具有良好的安全性,其中嗅鞘细胞组与对照组临床差异不明显,而MSCs组(雌性)比对照组存活时间明显延长[4]。多发性硬化症(multi p lescler osis,MS)是一种中枢神经系统多部位脱髓鞘改变的自身免疫性疾病,急性期免疫反应导致的轴突损伤 以及慢性期的脱髓鞘导致患者的神经功能缺失。免疫调节治疗和免疫抑制治疗是目前治疗MS的主要方法,但仅对部分患者有效。因此,NSC移植有可能成为治疗MS的另一种方法。研究显示,将NSC或者少突胶质细胞前体细胞移植到MS模型大鼠脑内后,在脱髓鞘部位可见到髓鞘再生[5,6]。恰当的移植途径以及病变部位的免疫微环境,对髓鞘再生的抑制作用是NSC移植治疗MS的关键。 3　自体骨髓M SC s移植治疗M N D 骨髓间充质干细胞是一类存在于骨髓网状间质内的非造血干细胞,具有分化成各种间叶组织细胞的潜能,在一定条件下可自我复制并能分化成多种细胞,其中包括神经细胞和神经胶质细胞,同时骨髓干细胞还能分泌多种神经营养因子,对神经细胞的修复产生促进作用。神经干细胞在临床上较难获得且在伦理学上存在一定的问题,而骨髓基质干细胞可以作为同种同体来源细胞,较易获得且不存在伦理问题;作为移植供体细胞骨髓基质干细胞和神经干细胞同样具有以下特性:①可以在体外迅速扩增。 ②无或低免疫原性。③能够在宿主脑内长期存活并与宿主神经元整合形成突触联系。④可以稳定的分化并长期表达外生性基因,例如酪氨酸羟化酶。此外,骨髓基质干细胞对神经于细胞还有着明确的促存活和分化的能力[7]。骨髓基质干细胞较神经干细胞更具临床优势,有可能作为自体细胞应用于组织工程和作为良好的移植细胞应用于替代治疗[8]。 在治疗MND的基础研究方面。主要使用人

2.1.1植物细胞工程的基本技术导学案

2.1.1植物细胞工程的基本技术 【学习目标】1、简述植物组织培养和植物体细胞杂交技术。 2、尝试进行植物组织培养。 【学习重点】1、植物组织培养的原理和过程 2、植物体细胞杂交的原则 【学习难点】植物组织培养的实验 课 前 案 读课本，独立完成下列问题 （要求：能准确写出关键词与句，以课本为准） 一、细胞工程 1．概念：应用 和 的原理和方法，通过 或 上的操作，按照人的意愿来改变细胞内的 或获得 的一门综合科学技术。 2．分类：根据操作对象不同，可分为 、 。 二、植物细胞的全能性 1、植物细胞的基本结构包括 、 、 、 。 2、植物细胞主要的增殖方式是 ，细胞分化是指 ，_____________________________________________________________________________原因是 。 3、全能性是指 ，表现为全能性的原因是 。 4．在理论上，生物的任何一个细胞都具有 ，但在生物的生长发育过程中，细胞并不表现 ，而是分化成各种 。 5．特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会有 地表达出各种 ，分化形成 不同的细胞，从而构成生物体的不同 。 三、植物组织培养技术 1．原理：植物细胞具有 ，具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成 的潜能。 2．过程: 离体植物的 ??→ ?脱分化 _ 组织??→ ?再分化幼根和芽或 胚状体 ??→ ?发育 完整植株。 3．细胞脱分化：已 的细胞经过诱导后，失去其特有的 而转变成未分化 细胞的过程。 4．植物组织培养：在 和 的条件下，将 的植物器官、组织、细 胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生 、丛芽，最终形 成完整植株。 四、胡萝卜的组织培养实验 1、实验原理 生物体细胞一般都是由受精卵经过有丝分裂形成的，因而都含有该生物的全套的遗传信息，都 具有发育成完整个体的潜能。因此，植物体的根、茎、叶细胞都具有 ，在一定的营养和激素条件下，可以脱分化形成 。将愈伤组织转接到含有不同激素成分的培养基上，就可以诱导其再分化生成胚状体或丛芽，进而发育成 。 2、实验步骤 ①．将 用自来水充分洗净，削去外皮，并切成段。用酒精棉球擦手 。 ②．在超净工作台(或接种箱)上将胡萝卜段用酒精溶液消毒30s 后，立即用 清洗2～3次，再用 处理30min 后，立即用无菌水清洗2～3次。 ③．用 的滤纸吸去胡萝卜段表面的水分。然后，在 瓷砖上，用无菌的解剖刀将胡萝卜段切成1 cm 厚的横切片，再选取有 的部位，切取1 cm 。左右的小块。 ④．将 接种到培养基上，用锡箔纸封盖瓶口，并用橡皮筋扎紧。然后，在培养瓶上贴上标签，写明材料名称、接种日期和小组号。 ⑤．将接种后的胡萝卜组织块，放在 恒温避光条件下培养。4d 后，检查培养材料的污染情况；14d 后，观察愈伤组织的生长状况。然后，在恒温箱中继续避光培养。在培养过程中，注意定期观察和记录愈伤组织的生长情况。 ⑥．培养一段时间后，将生长良好的 转接到分化培养基上，培养一段时间后，胡萝卜的愈伤组织就可以诱导出 。然后将试管苗移栽到大田，培养成 。 五、植物体细胞杂交技术 1．概念：不同种植物的 ，在一定条件下融合成 ，并把杂种细胞培育成新的 的技术。 2．过程 离体的细胞果胶酶纤维素酶???→ ?不同细胞原生质体--------→原生质体融合 →杂种细胞→杂种植株。 【预习自测】 1、下列细胞的全能性最高的是 ( ) A 、植物的卵细胞 B 、植物的花粉 C 、被子植物的受精卵 D 、被子植物的叶肉细胞 2．下列属于组织培养的是 ( ) A ．花粉培育成单倍体植株 B ．芽发育成枝条 C ．根尖分生区发育成成熟区 D ．未受精的卵细胞发育成个体 3．组织培养的理论根据是 ( ) A ．培养基中营养物质全面 B ．细胞的全能性 C ．细胞的分裂 D ．细胞的分化 4．愈伤组织细胞在一种包含所有必需物质的培养基中培养了几个小时，其中一种化合物具有放射性(氚标记)。当这些细胞被固定后镜检．利用放射自显影技术发现放射性物质集中于细胞核、线粒体和叶绿体。可以肯定标记的化合物是 （ ） A 一种氨基酸 B ．尿嘧啶核苷酸 C ．胸腺嘧啶脱氧核苷酸 D ．葡萄糖

干细胞

目前国内涉及干细胞技术研究与应用的上市公司： 1. ST中源（600645.sh），公司控股57%子公司协和干细胞基因工程目前主营脐带血存储业务（用于治疗白血病），协和干细胞拥有目前全球最大规模之一的天津脐带血造血干细胞库，是我国唯一的的干细胞产业化基地；公司大股东德源投资拟整合资源，突出主业，做大做强生物医药产业、干细胞产业。 2. 友好集团（600778.sh），公司与国家人类基因组南方研究中心共同投资组建的上海申友生物技术（持股56.7%）参与“剔除护骨素基因的小鼠胚胎干细胞杂合子模型的建立”研究并完成引物合成和基因测序工作。 3. 复星医药（600196.sh），公司投资建立生物治疗研究中心，主要研究干细胞移植技术及干细胞库和生物治疗技术。 4. 九发股份（600180.sh），控股子公司格兰百克生物制药生产的人粒细胞集落刺激因子rhG-CSF是治疗肿瘤、癌症的特效药，并可用于外周血干细胞移植、骨髓移植等医疗领域。 5. 苏常柴A（000570）/苏常柴B（200570.sz），公司持有25%股权的清华星爷创业投资主要在国内生物技术，尤其是在干细胞与组织工程、基因治疗等领域开展风险投资业务。 6. 四环生物（000518.sz），公司控股子公司神舟细胞工程掌握有国际先进的大规模高效动物细胞培养技术（股权已经于2008年12月8日转让）。 7. 金卫医疗（0801.hk），公司旗下子公司从事脐带血干细胞存储业务，其中金卫医疗拥有北京和广州两个地方脐带血存储业务牌照；公司持有18.9%股权的Cordlife是东南亚地区最大的干细胞库运营商，主要在香港、马来西亚、印度尼西亚运营干细胞库；公司持有70%股权的培到医院是著名血液病和造血干细胞移植专家陆道培设立的私立非营利性医院；金卫医疗旗下脐带血造血干细胞部门——中国脐带血库企业集团成功分拆至纽约证券交易所上市，公司持有其44%股权。 8. 津滨发展（000897.sz），公司参股天津泰达科技风险投资重点投资方向为生物医药园，包括天津细胞产品国家工程研究中心、天津泰达协和再生医学有限公司等，目前全球首个脐带间充质干细胞库成功规模化运营，已初步具备批量生产脐带间充质干细胞注射液的能力。 注1. 国内干细胞应用领域最广泛的是造血干细胞移植，其中脐带血含有大量未成熟的造血干细胞，可代替骨髓和外周血干细胞移植，成功应用于治疗白血病、淋巴瘤、骨髓异常增生综合症、再生障碍性贫血、血红蛋白病、代谢贮积病和免疫缺陷等疾病 国内干细胞历史大事件 2009-12-24 17:35:37| 分类：默认分类阅读168 评论0 字号：大中小订阅

植物细胞工程实验 (1)

植物细胞工程 实验一 培养基母液的制备 一、实验目的与意义 学习和掌握培养基母液的配制方法。 在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。 二、实验器材 电子天平（称量为0.0001g ）、电子天平（称量为0.01g ）、烧杯（500ml 、100ml 、50ml ）、容量瓶（1000ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、细口瓶（1000 ml 、100 ml 、50 ml 、25 ml ）、药勺、玻璃棒、电炉。 三、实验药品 NH 4NO 3、KNO 3、CaCl 2·2H 2O 、MgSO 4·7H 2O 、KH 2PO 4、KI 、 H 3BO 3、 MnSO 4·4H 2O 、 ZnSO 4·7H 2O 、 Na 2MoO 4·2H 2O 、CuSO 4·5H 2O 、CoCl 2·6H 2O 、FeSO 4·7H 2O 、Na 2-EDTA·2H 2O 、肌醇 、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B 6)、盐酸硫胺素(维生素B 1)、甘氨酸。 四、实验步骤 每种母液均配制500ml ，各成分的质量如下： 1、大量元素母液的配制 表1 MS 培养基大量元素母液制备 序号 药品名称 培养基浓度（mg/L ） 扩大20称量(mg) 备注 1 NH 4NO 3 1650 16500 蒸馏水定容至500ml 2 KNO 3 1900 19000 3 CaCl 2·2H 2O 440 4400 4 MgSO 4·7H 2O 370 3700 5 KH 2PO 4 170 1700 各成分按照表1培养基浓度含量扩大20倍，用称量为0.01g 的电子天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到500ml 的容量瓶中，即为20倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配1L 培养基取此液50ml 。 注意： ①配制大量元素母液时，某些无机成分如Ca 2+、SO 42一 、Mg 2十 和H 2PO 4一 等在一起可能 发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的双蒸水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量双蒸水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将Ca 2+、SO 42一 、Mg 2十 和H 2PO 4一 等离子错开混合，速度宜慢， 边搅拌边混合。