白血病抑制因子对体外培养神经干细胞影响的试验研究_刘建新
·论著·白血病抑制因子对体外培养神经干细胞影响的试验研究
刘建新1,郝晓柯1Δ,王瑞安2Δ,王晓峰3,马岳云1,苏明权1,刘家云1
(1.第四军医大学西京医院检验科全军临床检验医学中心,陕西西安710032;
2.第四军医大学基础部病理与病理生理学教研室,陕西西安710032;
3.解放军第三医院神经外科研究所,陕西宝鸡721000)
【摘要】 目的 探讨白血病抑制因子对体外培养神经干细胞增殖和分化的影响。方法 观察体外培养神经干细胞在添加白血病抑制因子环境下的增殖、分化状况。结果 体外培养神经干细胞呈悬浮生长,具有不断增殖的能力。添加白血病抑制因子能加快神经干细胞的增殖速度,提高其长期增殖能力。加血清诱导分化后细胞可分化为不同形态的细胞。添加白血病抑制因子可以抑制神经干细胞的分化,保留其多能型。结论 白血病抑制因子对促进神经干细的增殖及维持未分化状态具有重要作用。
【关键词】 干细胞; 胚胎; 细胞分化; 体外研究; 白血病抑制因子
DO I:10.3969/j.issn.1673-4130.2010.11.020
中图分类号:R457.7文献标识码:A文章编号:1673-4130(2010)11-1248-03
Effects of the leukemia inhibitory factor on the neural stem cells in vitro
L IU J ian-x in1,H AO X iao-ke1,WA N G Rui-an2,et al.
(1.Clinical Laboratory,Xi jing Hospital,Fourth Mi litary Medical University,X i′an710032,China;
2.Department o f Pathophysiology,Faculty of Preclinical Medicine,Fourth Military Medical University,X i′an710032,China)
【A bstract】 Objective T o o bser ve and analy se the effects of leukemia inhibito ry facto r(LIF)o n pr oliferation a nd diffe rentia-tio n o f neur al stem cells(NSCs)in v it ro.Methods LIF w as used to induce N SC s in vit ro.Results N scs cufhured vitro a re suspen-ded g row th and have the ability to prolifera te co ntinuo usly.L IF can accelera te their protife sprrd a tionand enhance their ability of long term prolifera tion.F etal ca lf ser um can induce.the differ entiation at N scs,but LI F inhibit the diffe rentiatio n of NSCs and re tain their multi-energ y-ty pe.C onclusion L IF can promo te the pr oliferation and maintain no n-diffe rentiated fo rm o f NSCs.
【Key words】 stem cells; embry o; cell differe ntiation; in uitro; leukemia inhibito ry facto r
神经干细胞(neural stem cells,N SCs)是存在于中枢神经系统的具有多向分化潜能和自我更新能力的一类细胞。本研究对体外培养的神经干细胞的原代和传代培养及分化进行鉴定,并初步探讨了白血病抑制因子对体外培养的神经干细胞增殖和分化的影响作用,为进一步的试验研究奠定基础。
材料与方法
1.材料和试剂 孕14d的SD大鼠;DM EM/F12培养基、表皮生长因子(epide rmal g row th facto r,EGF)、人碱性成纤维细胞生长因子(ba sic fibro blast g ro w th factor,bFG F)、兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)抗体、兔抗鼠胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic pro tein, GF A P)抗体、兔抗鼠半乳糖脑昔脂酶(g alacto ce rebroside, Ga lc)抗体购自美国Sig ma公司;B27、胎牛血清(fetal calf ser-um,FCS)购自Gibco公司;重组人白血病抑制因子(reco mbi-na nt human leukemia inhibito ry facto r,rhLIF)购自Chemico n 公司;小鼠抗人巢蛋白(Nestin)单克隆抗体、荧光标记山羊抗小鼠或山羊抗兔(FI TC/T RI T C)IgG购自北京中山公司。
2.神经干细胞培养液 1)培养液A:在DM EM/F12培养基中加入下列成分:20μg/L的EGF,20μg/L的bFG F,20μg/L的B27、青霉素1×105U/L、链霉素1×105U/L、抗支原体抗生素1.25×104U/L、10μg/L的LIF。2)培养液B:培养液A中加入10μg/L的L IF(所示浓度均为终浓度)。
3.神经干细胞的分离及原代培养 取孕14d的SD大鼠1只,0.4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,75%酒精消毒腹部皮肤,打开腹腔暴露子宫,分离胚胎后放入D-H ank′s液中冲洗,迅速取出胎脑放入4℃预冷D-H ank′s液中。显微镜下剥离脑膜和血管,小心分离胎脑皮质,眼科剪剪碎,巴氏吸管反复吹打,200目细胞筛滤制成单细胞悬液,均分加入2个培养瓶中,分别加入培养液A和培养液B,调整细胞浓度至1.0×109个/ m L,5%CO2培养箱中37℃连续培养,2～3d半量换液。
4.神经干细胞的传代培养 细胞培养6～9d后,根据细胞生长状况和密度,吸除半量培养液,机械法吹散神经干细胞球,加入等量神经干细胞培养液悬浮细胞,转人新的培养瓶中继续培养和传代。
5.原代及传代神经干细胞的鉴定 对原代和传代培养的神经干细胞行Nestin免疫荧光染色[1]。
6.神经干细胞的诱导分化及鉴定 收集第四代N SCs 亚克隆神经球,离心并重悬后制成单细胞悬液,接种于多聚赖氨酸处理玻片上,加含10%F CS的D M EM/F12培养基1.5 m L,第1组添加终浓度为10μg/L的L IF,第2组不添加L IF。5%CO2培养箱中37℃连续培养,第2d半量换液,14d后行免疫荧光染色鉴定。操作步骤同上,一抗稀释底分别是:N SE (1∶50),GF A P(1∶50),Galc(1∶50)。
结 果
1.神经干细胞的原代培养和传代培养 原代神经干细胞:倒置相差显微镜下观察细胞,可见培养以后的细胞散在分布且胞体较小,呈圆形,折光性较好(图1)。培养3d后死亡细胞增多,细胞碎屑增多,存活细胞的胞体增大,逐渐形成由数个
■ 通讯作者,郝晓柯,E-m ail:haoxk g@https://www.wendangku.net/doc/5c2896872.html,;王瑞安,E-m ail:w angra@fm https://www.wendangku.net/doc/5c2896872.html,。
细胞组成的细胞球,但体积较小(图2)。随着时间的推移,细胞球逐渐增多、增大。培养5～7d 后大部分细胞呈碎渣样死亡,只有少数细胞以单细胞或细胞球形式悬浮于培养基中,可见由数个至数十个细胞组成的细胞球。培养9～10d 后即可见由数十个至数百个细胞组成的较大的细胞球。增殖形成的细胞呈圆形或卵圆形,大小较均一,折光性良好,呈悬浮生长,未见细胞突起
。
图1 原代培养第2d 的神经干细胞(×200
)
图2 原代培养第4d 的神经干细胞(×200
)
图3 传代培养第3d 的神经干细胞(×200)
传代神经干细胞:干细胞经传代后既可见散在的单细胞,也可见呈不规则形状的小细胞球。传代后部分细胞死亡,部分
存活单细胞则出现分裂相,逐渐形成细胞球,生长速度基本同原代培养,但成球速度明显快于原代。不规则形状的细胞球向周围增殖出折光性良好的圆形小细胞,并能迅速形成新的较大的细胞球(见图3)。原代培养细胞球的形成率不超过5%,而传代培养及克隆亚培养细胞球的形成率逐渐升高,神经干细胞球形成的稳定期为5～7d 。在含LIF 培养液中形成的细胞球较在不含LIF 培养液中形成的细胞球小,细胞球的营养状态好,且细胞的折光性更强。
2.神经干细胞的诱导分化及白血病抑制因子的作用 接种于多聚赖氨酸处理玻片上的原代和传代培养的神经干细胞球,在含10μg /L L IF 和5%FCS 的DM EM /F 12培养液中培养24h 未见分化集落;继续培养2d 后,有80%的细胞能维持较好的未分化状态,细胞呈圆形或椭圆形;培养6d 后,仍有78%细胞处于未分化状态,细胞集落形态维持较好。而在不添加LIF 的培养液中培养3h 后,可见细胞集落已贴壁,8h 后即发现有突起从细胞团块边缘生长,24h 后见有少数细胞分化
为有突起的细胞;随着培养时间的延长,分化细胞逐渐增多,并从细胞球边缘向外迁移,呈放射状排列,随着培养时间的进一步延长,突起不断增粗与延长并互相连接成网状(图4)
。
图4 诱导分化24h 的神经干细胞克隆(×200
)
图5 干细胞克隆球表达nes tin 阳性(免疫荧光
染色,×200
)
图6 诱导分化神经元表达NSE 阳性(免疫
荧光染色,×400
)
图7 诱导分化星形胶质细胞表达GFAP 阳性
(免疫荧光染色,×400
)
图8 诱导分化少突胶质细胞表达Galc 阳性
(免疫荧光染色,×400)
3.神经干细胞诱导分化的鉴定 原代培养的细胞经N estin免疫荧光染色后,可见细胞球内的细胞均为Ne stin阳性细胞,增殖形成的细胞球呈绿色荧光(图5)。传代培养的细胞N estin免疫荧光染色结果与原代培养细胞一致。培养液中添加F CS后,神经干细胞球贴壁分化速度加快,部分轴突相互交错连接。免疫荧光染色显示N SE呈阳性,神经细胞胞体及轴突呈绿荧光(图6),细胞核较大,部分轴突相互交织形成网状;G FA P(图7)和G alc(图8)染色呈弱阳性,只有少部分细胞的胞体和轴突着色,大部分细胞只有细胞核染色。证实神经干细胞分别分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞。
讨 论
神经干细胞具有高度增殖和自我更新能力,在一定条件下能不断进行有丝分裂[2]。通过对称性和非对称性分裂,神经干细胞增殖,互相聚集成神经球,神经球中可含有神经干细胞、正在分化的神经前体细胞、凋亡细胞,甚至已分化的神经元和胶质细胞[3]。干细胞的体外培养是对干细胞进行深入研究和应用的重要环节。由于干细胞存在自发分化趋势,通常只能在体外做短期培养,从而限制了干细胞的扩增和应用。因此,建立干细胞的体外培养条件是一个紧迫的问题。
LIF最早于1988年在小鼠腹水瘤细胞条件培养液中被纯化,因其能诱导白血病细胞株M1细胞向正常细胞分化故称为白血病抑制因子。但在胚胎干细胞培养中,LIF不是诱导其分化而是抑制其分化[4]。LIF是典型的多功能生长因子,对于细胞生长、增殖与分化有着广泛的作用,与胚胎发育、神经发育和造血系统的发育有密切的联系,其最显著的生物学功能是抑制胚胎干细胞的分化并维持其多能性[5]。胚胎干细胞最初用滋养层细胞培养,不仅操作复杂,而目有多种交叉污染的风险,目前较少采用。研究表明,滋养层细胞分泌的L IF是具有重要抑制作用的细胞因子,在培养液中添加一定量的L IF完全可以取代滋养层细胞,维持胚胎干细胞增殖,并保持不分化状态[6-8]。但LI F是一种功能复杂多样的IL-6家族的细胞因子,因此,对于其他干细胞究竞是抑制分化还是促分化需要审慎地研究才能确定。本研究证实,体个培养条件下,在含L IF培养液中形成的细胞球较在不含LIF培养液中形成的细胞球小,细胞球的营养状态好,且细胞的折光性更强,说明添加LIF能加快神经干细胞的增殖速度,提高其长期增殖能力。而在F CS 诱导神经干细胞分化的研究中,添加LIF则可使更多的神经干细胞保持未分化状态,说明LIF在体外可以抑制神经干细胞的分化。
综上所述,在体外神经干细胞培养液中添加LIF,可以有效加快神经干细胞的增殖速度,提高其长期增殖能力,并能在有血清环境中抑制神经干细胞的自发分化。本研究的发现对获得长期稳定的移植用干细胞来源有重要意义。
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(本文责任编辑 王 东 收稿日期:2009-06-01)
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步比较了不同糖尿病肾病组U A lb/UCr、GF R。结果显示微量白蛋白尿期糖尿病患者G F R明显增高,高于健康对照者及糖尿病无肾病者。临床肾病患者GF R开始下降,表明糖尿病肾病早期肾小球滤过功能处于高滤过状态,到临床蛋白尿期肾小球滤过功能的下降,预示着终末肾病的发生。
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(本文责任编辑 王 东 收稿日期:2009-06-01)
神经干细胞的研究及其应用新进展
神经干细胞的研究及其应用新进展 [关键词] 神经干细胞研究 健康讯: 崔桂萍天津市脑系科中心医院 300060 1992 年， Reynolds 首次成功地从成年小鼠纹状体中分离出神经干细胞（ neural stem cell, NSC ），于是“神经干细胞”这一概念被正式引入神经科学研究领域。可以总结为具有分化为神经元、星形细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞。不少文献中还提到神经祖细胞和神经前体细胞，目前认为，神经祖细胞是指比 NSC 更有明确发展方向的细胞，而神经前体细胞是指处于发育早期的增殖细胞，可指代 NSC 和神经祖细胞：与 NSC 相比，二者的分裂增殖能力较弱而分化能力较强，是有限增殖细胞，但三者均属 NSC 范畴。 1. NSC 的起源、存在部位及生物学特征中枢神经系统的发育起源于神经沟、神经嵴、神经管；研究发现， NSC 在神经管壁增殖，新生细胞呈放射状纤维迁移至脑的特定位置；主要存在于室管膜区，在成脑生发区以外的区域也广泛分布，即具有高度可塑性的神经前体细胞。现发现 NSC 的生物学特征为：（ 1 ）具有自我更新能力；（ 2 ）具有多向分化潜能，可分化为神经元、星形细胞和少突胶质细胞；（ 3 ）处于高度未分化状态；（ 4 ）终生具有增殖分化能力，在有损伤的局部环境信号变化的刺激下可以增殖分化。其中（ 1 ）和（ 2 ）是 NSC 的两个基本特征。 2. NSC 的基础研究进展 NSC 的增殖和分化调控是目前 NSC 研究的核心问题，最近的研究资料显示， NSC 的增殖、分化、迁移调控受多种相关因素的影响。神经递质神经递质作为细胞外环境的一员，不仅介导神经元之间和神经元与效应器之间的信号传递，还参与 NSC 的增殖和分化。这些神经递质包括谷氨酸（ G1u ）、 5- 羟色胺（ 5-HT ）、 GABA 、甘氨酸（ G1y ）、乙酰胆碱（ Ach ）一氧化氮（ NO ）、肾上腺素与性激素等。 G1u ：在脑的发育过程中有高含量的 G1u 表达， Haydar 等发现， G1u 可以通过大鼠胚胎皮质 AMPA/KAR 的激活调节室周区前体细胞的增殖，但 GLU 对室管膜区（ SZ ）和室管膜下区（ SVZ ）体内细胞的影响是不同的，它可增加 SZ 细胞的增殖，减少 SVZ 细胞的增殖； GLU 还可促进神经元生长和分化。 5-HT ：许多研究表明， 5-HT 在皮质发育、突触形成中起重要作用，抑制 5-HT 合成或选择性损伤 5-HT 神经元则引起齿状回及脑室下区神经元增殖活性下降， 5-HT 可促进胶质细胞分化和髓鞘形成。 GABA ： GABA 是成体脑发育过程中主要
神经干细胞的培养鉴定及分化
朱琼，女，1990年生，重庆市人，汉族，2009年第三军医大学毕业，在读硕士，主要从事神经干细胞治疗阿尔茨海默病的作用及机制研究。 通讯作者：徐亚丽，博士，副主任医师，副教授，解放军第三军医大学第二附属医院超声科，重庆市 400037 Zhu Qiong, Studying for master’s degree, Department of Ultrasound, Second Affiliate Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400037, China Corresponding author: Xu Ya-li, M.D., Associate chief physician, Department of Ultrasound, Second Affiliate Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400037, China 神经干细胞的培养鉴定及分化 朱 琼1，皋月娟2，高顺记1，陈 重1，刘 政1，徐亚丽1(1解放军第三军医大学第二附属医院超声科，重庆市 400037；2解放军第三○二医院超声科，北京市 100039) 引用本文：朱琼，皋月娟，高顺记，陈重，刘政，徐亚丽. 神经干细胞的培养鉴定及分化[J].中国组织工程研究，2017，21(17):2708-2713. DOI: 7.17.014 ORCID: 0000-0002-1810-5009(朱琼) 文章快速阅读： 不仅能分化为多种类型的神经细胞替代缺失神经组织，同时能产生多种细胞因子，如脑源性神经营养因子、神经生长因子及胶质源性神经营养因子等，并促进突触发生，调节其可塑性，且能重建部分环路和功能，是神经元替代治疗的理想靶细胞。 细胞分化：指同一来源的细胞逐渐由全能到多能，最后到单能，从而产生形态功能不同的细胞群的过程，其本质是基因组在时间和空间上的选择性表达。如神经干细胞能分化为多种类型神经细胞：星形胶质细胞、小胶质细胞及神经元。同时该过程受局部微环境调节，多种理化因素都能诱导全能细胞产生分化，如血清诱导神经干细胞分化。 摘要 背景：神经干细胞在神经损伤修复和退行性疾病中有广泛的应用前景，体外培养鉴定及促神经元诱导分化是后续研究的基础。 目的：采用悬浮神经球培养法分离培养神经干细胞并对其鉴定，了解生物学特性。 方法：采用悬浮神经球培养法从C57BL/6胎鼠大脑半球分离培养神经干细胞，观察形态特征及超微结构，CCK-8法绘制生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期，免疫荧光法检测特异性标志蛋白Nestin 的表达；用体积分数为1%和10%的血清诱导分化后，免疫荧光法检测GFAP 、βⅢ-tubulin 和MBP 的表达。 结果与结论：①体外培养得到悬浮生长的神经球，生长曲线和细胞周期表明细胞增殖力强；②透射电镜观察到神经干细胞核浆比高，呈未分化状态；③Nestin 免疫荧光阳性；④不同体积分数的血清诱导后均可分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞，体积分数为1%血清能诱导分化得到更多的神经元细胞；⑤结果表明，采用悬浮神经球培养法成功分离培养得到了神经干细胞，低体积分数血清有利于神经干细胞向神经元分化。 关键词： 干细胞；分化；神经干细胞；培养；鉴定；血清；诱导分化；国家自然科学基金 主题词： 神经干细胞；细胞, 培养的；血清；细胞分化；组织工程 基金资助： Cultivation, identification and differentiation of neural stem cells Zhu Qiong 1, Hao Yue-juan 2, Gao Shun-ji 1, Chen Zhong 1, Liu Zheng 1, Xu Ya-li 1 (1Department of Ultrasound, Second Affiliate Hospital of Third Military Medical University, Chongqing 400037, China; 2Department of Ultrasound, the 302nd Hospital of PLA, Beijing 100039, China) Abstract BACKGROUND: Neural stem cell transplantation is an emerging therapeutic option in the recovery of neural lesions and neurodegenerative diseases. Neural stem cell culture and differentiation lay a foundation for the further study. OBJECTIVE: To improve the techniques for the isolation, cultivation, differentiation and identification of neural stem cells, and to explore the biological characteristics of cells. METHODS: The neural stem cells from C57BL/6 fetal rats were isolated and cultured in vitro using neurophere culture method followed by morphological and ultrastucture examination. The growth curve and cell cycle of passage 3 cells were drawn and analyzed. Nestin expression was tested by immunofluorescence. Neural stem cells induced in 1% and 10% fetal bovine serum were identified using anti-GFAP, anti-βIII -tubulin and anti-MBP by immunofluorescence. RESULTS AND CONCLUSION: The neurospheres exhibited strong cell proliferation ability. Under transmission electron microscope, there was a high nuclear/cytoplasmic ratio in the neural stem cells, indicating a low differentiation degree. Immunofluorescence analysis revealed that neural stem cells were positive for Nestin. The induced cells were positive for GFAP, βIII -tubulin, and MBP, indicating these cells were induced to differentiate into astrocytes, neurons and oligodendrocytes, and there were more neurons in 1% fetal bovine serum than those
细胞生物学常用研究方法
Southern杂交: 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。 RNAi技术: 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。 Southern杂交一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量]。 扫描电镜技术：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 细胞显微分光光度计：用来描述薄膜、涂层厚度超过1微米的物件的光学性能的显微技术。 免疫荧光技术：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。 电镜超薄切片技术：超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。用当代较好的超薄切片机，大多数生物材料，如果固定、包埋处理得合适，可以切成50-100微米的超薄切片。 Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 放射自显影技术：放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。放射自显影技术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。 核磁共振技术：可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小(20，000 道尔顿以下)的蛋白质、核酸以及其它分子的结构，而不损伤细胞。 DNA序列分析：在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信
M3型白血病
M3型白血病是否需要移植需要看缓解后微小残留病的监测结果与诊治之初的危险度评估来确定。此种类型应该属于白血病中好治疗的一种。其症状主要有：出血：由于血小板减少、血管壁损伤、凝血因子缺乏等原因，可能会出现身上瘀斑、瘀点、鼻腔和牙龈出血等；贫血：由于白血病骨髓分化受阻、造血功能低下，所导致的贫血，表现为头晕、乏力、活动后心悸等；感染：由于粒细胞的严重缺乏和红细胞存在异常加之血液又是细菌最好的培养基，所以最易招致感染，其感染的部位一般情况下依次为：肺、口腔、肛周、皮肤、尿道、鼻窦。白细胞浸润：会出现不同程度的肝脾肿大、牙龈增生、皮肤损害等。 （1）M0（急性髓系白血病微分化型）：骨髓华夏始细胞≥90%（NEC），胞浆大多透亮或中度嗜碱，五嗜天青颗粒及Auer小体，核仁较着，近似ALL-12型，细胞化学过氧化酶及苏丹黑B染色<3%;免疫表型髓系标记CD33及（或）CD13可阳性。淋系抗原阳性，但可有CD7+,Td T+;电镜髓过氧化酶（MPO）阳性。 （2）M1（急性白粒细胞白血病未化型）；事理细胞（I+II型）≥90%（NEC），此中至多有3%的原粒细胞（lixibao）过氧化酶或苏丹黑染色阳性，早幼粒细胞以下的各阶段粒细胞或单核细胞<10%. （3）M2（急性粒细胞性白血病部分分化化型）：原粒细胞（I+II型）占30%-<90%（NEC），早幼粒细胞一下至中性分叶核粒细胞>10%,单核细胞<20%;如有的晚期粒细胞外形特点既不像原粒细胞I型或II型，也不像早幼粒细胞（一般的或多颗粒型），核染色质很细，有1-2个核仁，胞浆丰富，嗜碱性，有不等量的颗粒，有时颗粒堆积，这类细胞>10%时，亦属此型。 （4）M3（急性早幼粒细胞白血病）；骨髓中以很是的多颗粒早幼粒细胞为主。 （5）M4（急性粒单核细胞白血病）：有下列多种情况。1）骨髓原始细胞>30%（NEC），原粒细胞加早幼、中性中幼及其他中性粒细胞占30%--<80%,分歧幼稚阶段的单核细胞（常为纯熟及幼稚单核细胞）>20%.2）骨髓象如上所述，外周血中单核细胞系（包含原始、纯熟及幼稚单核细胞）≥5X109 /L.3）骨髓象如上所述，外周血单核细胞系5×109/L,而血清溶菌酶以及细胞化学撑持单核细胞数量较着者。4）骨髓象近似M2,而单核细胞系20%,或血清溶菌酶逾越一般（11.5±4）mg/L,的3倍，或尿溶菌酶逾越一般（2.5mg/L）的3倍。5）骨髓象近似M2,而外周血单核细胞系≥5×109/L时亦可区分为M4.M4EO（急性粒单核细胞白血病伴嗜酸粒细胞增加）：除存在上述M4特性特点外，骨髓嗜酸粒细胞5%（NEC），其外形除有典范的嗜酸颗粒外，还有大而不幼稚的嗜碱颗粒，核常不分叶，细胞化学氯乙酸脂酶及PAS染色较着阳性。 （6）M5（急性单核细胞白血病）：又分为两种亚型。M5n:骨髓原单核细胞I+II型≥80%（NEC）。M5b:骨髓原单核细胞I+II型80%（NEC），其他为纯熟及幼稚单核细胞等。 （7）M6（红白血病）：骨髓原始细胞（原粒细胞或原单核细胞，NEC）I+II型≥30%,红细胞系≥50%. （8）M7（急性巨核细胞白血病）：骨髓原巨核细胞≥30%,如原始细胞呈未分化型，外形不克不及断按时，应做电镜血小板过氧化物酶活性查抄，或用血小板膜糖蛋白IIb/Ⅲa或ⅧR;Ag以证明其为巨核细胞系。如骨髓干抽，有骨髓纤维化，则需骨髓活体组织查抄。用免疫酶标识表记标帜手艺证明有巨核细胞增加。 M3型白血病的治疗需要患者提高认识，积极加强治疗。专家指出：现在白血病的治疗通过中西医相结合的手法是最有效的，结合西医化疗和中医治疗的长处，取长补短，弥补西医化疗不分敌我一味杀的不足，又能解决对化疗制剂耐性的问题。避免了骨髓移植的巨大是费用负担和复发的可能。“植物清髓疗法”就是这样一种科学的方法，从本质上改变白血病细胞的基因组成，通过中医祛瘀、清血、扶正、解毒等一系列方剂组合，有效抑制白血病细胞
神经干细胞的应用前景及研究进展
神经干细胞的应用前景及研究进展 生科1301班李桐 1330170031 神经干细胞( neuralstem cells, NSCs)是重要的干细胞类型之一，是神经系统发育过程中保留下来的具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞,可分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等多种类型的神经细胞。具有很多的特性，如自我更新、多潜能分化、迁移和播散、低免疫原性、良好的组织相容性、可长期存活等。目前神经干细胞的分离与体外培养已取得可喜的进展，有关神经干细胞的研究已经成为国内外神经科学领域的热点。 一、神经干细胞的生物学特性 19世纪80年代提出了神经干细胞的概念，它是指一类多潜能的干细胞，能够长期自我更新与复制，并具有分化形成神经元、星形胶质细胞的能力。神经干细胞的主要特征：未分化、缺乏分化标记、能自我更新并具有多种分化潜能。它并不是指特定的单一类型的细胞，而是具有相类似性质的细胞群。Gage将神经干细胞的特性进一步描绘为以下三点，可生成神经组织或来源于神经系统，具有自我更新能力，可通过不对称法、分裂产生新细胞。神经干细胞经过不对称分裂产生一个祖细胞和另一个干细胞，祖细胞只有有限的自我更新能力，并自主分化产生神经元细胞和成胶质细胞。神经干细胞是具有自我更新和具有多种潜能的母系神经细胞，它能分化成各种神经组织细胞表型，如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞.并能自我更新产生新的神经干细胞，在神经发育和神经损伤中发挥作用。神经干细胞移植、迁移及分化与局部环境密切相关，这种特性为移植及移植后的结构重建和功能恢复提供了依据，为移植治疗不同疾病提供了局可能。 二、神经干细胞的应用前景 1.细胞移植以往脑内移植或神经组织移植研究进展缓慢，主要受到胚胎脑组织的来源、数量以及社会法律和伦理等方面的限制。神经干细胞的存在、分离和培养成功，尤其是神经干细胞系的建立可以无限地提供神经元和胶质细胞，解决了胎脑移植数量不足的问题，同时避免了伦理学方面的争论，为损伤后进行替代治疗提供了充足的材料。研究表明，干细胞不仅有很强的增殖能力，而且尚有潜在的迁移能力，这一点为治疗脑内因代谢障碍而引起的广泛细胞受损提供了理论依据，借助于它们的迁移能力，可以避免多点移植带来的附加损伤。另外，神经干细胞移植也为研究神经系统发育及可塑性的实验研究提供了观察手段，前文提及细胞因子参与调控神经元增殖和分化，通过移植的手段对这些因素的具体作用形式和机制进行探索，为进一步临床应用提供了理论基础。 2.基因治疗目前诱导干细胞向具有合成某些特异性递质能力的神经元分化尚未找到成熟的方法，利用基因工程修饰体外培养的干细胞是这一领域的又一重大进展；另外已经发现许多细胞因子可以调节发育期甚至成熟神经系统的可塑性和结构的完整性，将编码这些递质或因子的基因导入干细胞，移植后可以在局部表达，同时达到细胞替代和基因治疗的作用。 3.自体干细胞分化诱导移植免疫至今为止仍是器官或组织移植的首要问题。前文提到已经证明成年动物或人脑内、脊髓内存在着具有多向分化潜能的干细胞，那么使人们很容易想到通过自体干细胞诱导来完成损伤的修复。中枢神经系统损伤后，首先反应的是胶质细胞，在某些因子的作用下快速分裂增殖，形成胶质瘢。其实在这个过程中也有干细胞的参与，可不幸的是大多数干细胞增殖后分化为胶
干细胞临床试验研究项目管理办法试行实施细则
干细胞临床研究管理办法（试行） 第一章总则 第一条为规范和促进干细胞临床研究，依照《中华人民共和国药品管理法》、《医疗机构管理条例》等法律法规，制定本办法。 第二条本办法适用于在医疗机构开展的干细胞临床研究。 干细胞临床研究指应用人自体或异体来源的干细胞经体外操作后输入（或植入）人体，用于疾病预防或治疗的临床研究。体外操作包括干细胞在体外的分离、纯化、培养、扩增、诱导分化、冻存及复苏等，不包括基因水平的操作。 第三条干细胞临床研究必须遵循科学、规范、公开、符合伦理、充分保护受试者权益的原则。 第四条开展干细胞临床研究的医疗机构（以下简称机构）是干细胞制剂和临床研究质量管理的责任主体。机构应当对干细胞临床研究项目进行立项审查、登记备案和过程监管，并对干细胞制剂制备和临床研究全过程进行质量管理和风险管控。 第五条国家卫生计生委与国家食品药品监管总局负责干细胞临床研究政策制定和宏观管理，组织制定和发布干
细胞临床研究相关规定、技术指南和规范，协调督导、检查机构干细胞制剂和临床研究管理体制机制建设和风险管控措施，促进干细胞临床研究健康、有序发展;共同组建干细胞临床研究专家委员会和伦理专家委员会，为干细胞临床研究规范管理提供技术支撑和伦理指导。 省级卫生计生行政部门与省级食品药品监管部门负责行政区域内干细胞临床研究的日常监督管理，对机构干细胞制剂和临床研究质量以及风险管控情况进行检查，发现问题和存在风险时及时督促机构采取有效处理措施;根据工作需要共同组建干细胞临床研究专家委员会和伦理专家委员会。 第六条机构不得向受试者收取干细胞临床研究相关费用，不得发布或变相发布干细胞临床研究广告。 第二章机构的条件与职责 第七条干细胞临床研究机构应当具备以下条件： （一）三级甲等医院，具有与所开展干细胞临床研究相应的诊疗科目。 （二）依法获得相关专业的药物临床试验机构资格。 （三）具有较强的医疗、教学和科研综合能力，承担干细胞研究领域重大研究项目，且具有相对稳定、充分的项目研究经费支持。 （四）具备完整的干细胞质量控制条件、全面的干细胞临床研究质量管理体系和独立的干细胞临床研究质量保证
肠神经干细胞研究进展
肠神经干细胞研究进展 神经干细胞主要有两类：中枢神经干细胞和外周神经嵴干细胞。中枢起源的神经干细胞研究颇多，而外周起源的神经干细胞研究还刚刚起步。两者具有很多相似性。目前研究表明，在肠道内有神经嵴来源的神经干细胞池[1]。本文就肠起源的神经干细胞—肠神经干细胞（(Enteric neural stem cells，ENSCs)），对其生物学特性，迁移分化调控因素，应用前景等做一概述。 一．肠神经干细胞与肠神经系统 具有多向分化潜能的干细胞可以从出生以后的人类及啮齿类动物的大脑、胰腺、肝脏、骨髓等获取，进行体外培养并研究其相关性状。有报道，从肠管也可以获取干细胞[2] 。这种细胞在个体中一生都存在，且可以分化为神经元、神经胶质细胞以及其他细胞，具备自我更新和多向分化潜能等干细胞特性，这种细胞即为“肠神经干细胞”(Enteric neural stem cells，ENSCs)。 肠神经干细胞起源于神经嵴。在个体发育过程中，其通过迷走神经嵴在胚胎早期迁移进入肠道，从头端至尾端向成熟分化，发育形成肠神经系统[3]。国内外研究者对其不同的命名，但通过分离培养以及生物学性状的研究证实为同一种细胞。Morrison[4]等将其称为肠神经嵴细胞（Enteric neural crest cells ，ENCC）或肠神经嵴干细胞（Enteric neural crest stem cells，ENCSC），在胚胎发育时期或成年组织中，从消化道中分离出神经嵴干细胞,进行体外培养，并进行了一系列鉴定，证明其具备干细胞特性，且主要分化为神经元和神经胶质细胞。Natarajan[5]等在研究中则将其称为“肠神经系统源性的多能祖细胞”(Enteric nervous system derived multipotential progenitor cells,ENSPCs)，从小鼠胚胎或出生后的肠管中制取单细胞，行体外培养后可以获取。国外学者Y oung[6]和Suarez-Rodriguez [2]等在研究中则称其为“肠神经干细胞”（Enteric neural stem cells，ENSCs）。 肠神经干细胞和肠神经系统的发育密切相关。脊椎动物的肠神经系统是外周神经系统中最复杂的部分。它是由大量的、不同种类的神经元和神经胶质细胞构成的。相互连接的神经节，围绕肠壁、外肌层、以及内部的粘膜下层的辐射轴，排列成两个同心圆状。如同外周神经系统的绝大多数细胞一样，肠神经系统完全起源于神经嵴。大多数肠神经系统的祖细胞产生于1-7 体节听泡后方的后脑迷走神经嵴。从神经管脱离不久，迷走神经嵴亚群向腹外侧移动，聚集在中间后肢区，移向主动脉背侧颈丛腹外侧，在局部信号的影响下，迷走神经嵴细胞会诱导表达RET酪氨酸激酶受体。在孕9.5 天至10 天这些RET+迷走神经嵴侵入前肠肌层，称为“肠神经嵴细胞”,即肠神经干细胞，接下来的 4 天，则会向尾侧迁移以定位于整个肠段。发育过程中，如果肠神经干细胞迁移、定位失败，就会导致肠神经节的缺失，形成神经节细胞缺失症。这种情况发生在结肠部位，会形成先天性巨结肠症，即神经节细胞缺失，导致分泌调节障碍和严重的肠道阻塞[6]。 肠神经干细胞与肠神经系统的发育密切相关。肠神经干细胞的出现为研究肠神经系统的发育提供了一个较为理想的模型，可以来研究肠神经形成过程中的分化、调节的影响因素，为阐明神经发育提供有力的证据由此可解释肠神经系统发育和修复的一些机制，此外，肠管作为器官，易于进行活检，且肠神经分布丰富，其与中枢神经系统具有许多共性。据此，可以就有可能采用肠神经干细胞对一些中枢或外周神经缺失性疾病行细胞移植替代治疗了。二．肠神经干细胞的生物学特性 作为干细胞，其特性简要概况即：①可自我复制更新，产生与自己相同的子代细胞，维持稳定的细胞储备②处于较原始的未分状态，无相应的成熟细胞的特异性标志③具有多向分化的潜能，即演变成不同类型成熟细胞的能力。要识别肠神经干细胞，可以从三个方面
神经干细胞体外培养技术
神经干细胞体外培养与鉴定 一前言 神经干细胞(Neural stem cells, NSC S)是神经系统内能产生神经元和胶质细胞的未分化原始细胞【1-2】。文献报道，NSC具有无限增殖、自我更新和多向分化能力，在适宜的环境条件下，能分化形成各种靶组织细胞【3-5】。此外，NSC 还可用作为是细胞移植治疗的有效载体，被广泛用于神经疾病细胞或载体治疗。根据目前的研究结果，其主要作用包括下列三方面：①NSC分化成宿主细胞来替代丢失细胞的作用；②分泌多种细胞因子发挥生物学功能；③桥接作用【6-8】。基于NSC的上述特性，从而奠定了NSC在细胞替代治疗中有广泛应用前景，而如何获取NSC则是科学研究和临床实践中首先面临的关键问题。本实验拟建立绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠NSCs原代和传代培养技术，为后面的实验提供方法支持。 二实验所需仪器、试剂及其配制 （一）实验仪器 光学显微镜（Olympus,Japan） 倒置荧光显微镜（LEICA DMIRB） 冰冻切片机（Leica CM1900，Germany） 光明DZKW型电热恒温水浴锅（北京市光明医疗仪器厂） XK96-A快速混匀器（姜堰市新康医疗器械有限公司）HT-200 电子天平（成都普瑞逊电子有限公司川制）FA1004型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司) MP 8001单臂脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司) 10μl微量进样器（Pressure-Lok，PRECISION SAMPLING CORP，BATON ROUGE， LOUISIANA，Made in USA） 0.5ml、1ml Eppendorff管（Ependorff） 手术器械：眼科剪、解剖剪、显微剪、显微有齿镊及无齿镊、蚊式钳、刀柄刀片等。
中国关于干细胞的管理条例
解读干细胞临床应用标准与规则 研究者应遵守哪些规则 干细胞有关的标准和规则大部分仍在讨论和制定过程中，基本上可以归为几大类。一类是干细胞科学研究的标准。其目的是为了使不同实验室研究胚胎干细胞采用的方法和标准能够一致。另一类是关于干细胞产品临床试验的标准以及临床技术应用的标准。实验室研究出的干细胞产品在正式应用于临床之前，需要经过严格的临床前及临床试验，以保证安全性、疗效以及一些技术指标。这一类称做“临床应用转化”，指从实验室向临床应用的必要转化过程。第三类是临床准入标准，包括实施干细胞治疗的医院的资质、医生的资质、医院干细胞设施的标准等。另外，干细胞产品的生产工艺与过程，也需要相应的标准与规则。而干细胞产品还有可能作为商品跨国交易，因此也需要相应的国际规则来管理。更主要的是由什么机构来制定标准，由哪些机构来制定与监督执行管理规则。 从应用的角度而言，上述各种标准与规则中，关于临床应用转化的标准处于核心的地位。这也是国际干细胞研究协会出台“干细胞临床转化指导规则”的现实意义。该指导规则首先表明了国际干细胞研究协会坚决反对任何以牟利为目的的、未经证实的干细胞治疗。强调干细胞研究者、研究机构以及管理机构有责任阻止这类损害患者经济与健康利益，并有可能对干细胞研究带来极大负面影响的行为。该指导规则随后提出了干细胞研究者应当遵守的相应的职业道德和操守，着重强调严格的、独立的同行科学评审与监管机制的执行。而与临床应用直接相关的内容包括三部分，即用于移植的细胞的制备与生产所应该遵守的标准与规则、动物的前临床实验规则、人体的临床试验的规则。这些规则对于研究人员、临床医生和制定规则的政府部门具有指导性的意义（感兴趣的读者请参阅将正式发表的完整文件）。 必须承认的是，某些特殊情况下，新技术的临床应用可能先于上述严格的程序，这叫做“医疗创新”或“创新式医疗应用”，医学史上有不少这样的例子。但同样必须强调的是，这种医疗创新绝不等于毫无准备与规则的滥用，而是建立在必要的科学预测与基本数据之上的谨慎尝试，而且这种尝试同样要受到严格的规则限制。比如，并非任何人都有资格进行这样的尝试，也不可以根据随意想象来尝试。再者，“创新医疗方法”应有助于严格的临床研究，而不是单纯出于某种侥幸心理。在尚不存在严格成形的科学标准和管理规则之前，这一点是非常重要的。 患者如何辨析治疗是否规范 那么，对于公众而言，对于潜在的消费者而言，在干细胞科学研究尚在进行、临床应用条件尚未成熟以及管理规则还有待制定的情况下，如何采取必要的措施保护自身的健康与经济利益，如何配合科学界与管理机构监督干细胞治疗的规范性，避免被不正当的商业手段所蒙骗，是一个值得认真考虑的问题。这方面，干细胞科学家与临床工作者有责任提供必要的信息，教育公众。因此，国际干细胞研究协会的“干细胞临床转化指导规则”出台的同时，专门发表了一部“告患者书”，配合指导标准，就公众和潜在消费者如何寻求干细胞治疗的专门信息提供了一套完整的方案。下面概括为几个方面。 第一，消费者必须明确的是，目前比较成熟的干细胞治疗主要还是骨髓干细胞治疗血液系统疾病，例如白血病和一些免疫疾病。某些皮肤疾病也可以由特定的干细胞治疗获得疗效。其他所有的干细胞治疗，都仍处在实验阶段，还没有达到成熟临床技术的程度。例如，如何生产足够的干细胞用于治疗仍是一个重大技术问题；哪些细胞用于哪种疾病，如何把这些细胞送达疾病部位等仍在探索中；而且，干细胞移植体内后会长期存在，是否会由此引发各种副作用，仍有待观察研究。这是消费者对目前的干细胞治疗必须有的基本认识。
人白血病抑制因子(LIF)说明书
人白血病抑制因子（LIF）酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关液体样本中白血病抑制因子（LIF）的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人白血病抑制因子（LIF）水平。用纯化的白血病抑制因子（LIF）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入白血病抑制因子（LIF），再与HRP标记的白血病抑制因子（LIF）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的白血病抑制因子（LIF）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人白血病抑制因子（LIF）浓度。 试剂盒组成： 试剂盒组成孔配置孔配置 说明书份份 封板膜（48）（96） 密封袋个个 酶标包被板×48×96-8保存：2700ng/L×1瓶×1瓶-8保存标准品稀释液×1瓶×1瓶-8保存酶标试剂×1瓶×1瓶-8保存样品稀释液×1瓶×1瓶-8保存显色剂A液×1瓶×1瓶-8保存显色剂B液×1瓶×1瓶-8保存终止液×1瓶×1瓶-8保存浓缩洗涤液20ml×20）×1瓶20ml×30）×1瓶-8保存 样本处理及要求： 1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/ 分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分
神经干细胞研究介绍
神经干细胞研究介绍 陈晓萍 程君奇 (浙江大学生命科学学院浙江省细胞与基因工程重点实验室浙江杭州310029) 摘要 神经干细胞研究是近年脑科学研究的热点,本文综述了神经干细胞的分离培养方法、脑内迁移路线、发育分化的影响因素以及可能的应用前景。 关键词 神经干细胞 分离 迁移 发育 分化 脑的结构与机能一直是生命科学的研究难题,它以极其错综复杂而又高度易变为特征,至今仍保持着极大的神秘性。近年来科学家对神经干细胞的研究是脑科学领域的重要成果之一,它突破了以往一直认为的成年动物神经细胞不能分裂再生的观念,为神经细胞的发育分化过程,也为神经系统疾病的治疗开辟了一条全新的途径。 1 神经干细胞的分离培养 神经干细胞(N eural stem cells,N SCS)是指具有如下特征的细胞:1)能形成神经组织;2)具有自我繁殖和自我更新能力;3)细胞分裂后能发生分化[1]。 胚胎时期是神经系统快速增长发育的阶段,在这时期脑内的许多部位都存在神经干细胞,这包括大脑皮质、纹状体、小脑等区域。成年后,脑细胞一般不再分裂增殖。以往曾一度认为成年动物神经细胞完全失去了这种能力,但近年科学家在高等哺乳动物(包括人)的脑室管膜下层等区域发现了仍具有增殖分化能力的神经干细胞。另外,在啮齿类动物主管学习记忆的海马区,也发现了神经干细胞的存在[2]。 成年动物脑内的神经干细胞仅仅是保存了能进行分裂增殖的潜能,通常情况下得不到足够的正面刺激信号,因而并不分裂增殖,而是处于静止状态。 从脑组织分离培养神经干细胞需要特殊的条件,目前多采用生长因子刺激和细胞克隆技术。具体有3种方法[3]:1)用无血清培养液将脑细胞分离,再加入具有丝裂原作用的生长因子如表皮生长因子或碱性成纤维生长因子,待原代克隆形成后挑选单个克隆机械分离继续进行亚克隆培养,也可采用单细胞克隆分离;2)用反转录病毒向脑细胞内导入原癌基因,如V2m yc和SV40大T抗原等,部分细胞可因此获得持续分裂的能力;3)从脑组织以外的部位,如胚胎干细胞,经过适当化学因子的诱导,使其定向分化为神经干细胞。 外加化学因子对于维持神经干细胞的分裂增殖能力是必须的。培养液中如撤去外加的化学因子,改用普通培养,神经细胞会很快发生分化,失去分裂增殖能力。 2 神经细胞的发育及脑内迁移路径 神经系统的发育源于胚胎早期的神经管和神经嵴[4],其中的中央管经发育形成脑室系统和脊髓中央管,管腔内表面覆盖的上皮细胞具有活跃的增殖和分化能力,是神经细胞发生的来源。成年后这个区域称为室管膜 室管膜下区。 内径1～2mm的完全闭合的呼吸管。据B landfo rd报道,这种呼吸管中衬有外套膜组织。上述蜗牛的夏眠能从1月持续至6月。同时具有裂口、裂沟和缝合线管的结构有利于气体的循环。在足部和外套膜肌肉运动下,可促使气体交流和循环,贝类学家F ischer曾对冬眠期间的盖罩大蜗牛进行了研究,业已证明其足部和外套膜从未停止过运动。 8)喇叭状口和壳壁上的穿孔 A lycaeinae的种类,其成体的壳口呈喇叭状,其后逐渐缩小成一口颈。在口颈近缝合线的壳壁上有穿孔。A ly caeus属的种类,如A2 ly caeus m ajor壳壁上的孔由内向外通入一覆盖在缝合线上的管。管的截面略呈三角形。此管在缝合线上,略弯曲,呈带状,长约6～7mm,管的末端是盲端,但常破碎,即使不破碎,该管仍可进行气体交换。据分析这个带状结构比通常的贝壳更具通透性。因种类不同,喇叭口的长度有差异,缝合线管内开口到口缘距离也有所不同。喇叭状的壳口可能是为了蜗牛在夏眠期间有一个较大的气室,这与无厣贝类具有的盖膜腔情况相似。由此可以推断A ly caeus和Pup ininae的一些种类缝合线管在内部的开口可能与肺呼吸孔靠得很近。 其他的一些陆生螺类,如R um ina d ecollata和C lausilia的一些种类,在夏眠期间往往胚螺层失去,然而可能也有利于呼吸。破损的一端由内脏分泌的膜封住,这比休眠时螺壳倒下,靠外套膜边缘呼吸更利于气体交换。 (BF) — 8 1 —生 物 学 通 报 2003年第38卷第2期
神经干细胞原代取材与培养
神经原代干细胞的取材及培养 长期以来，人们认为中枢神经系统成熟的神经元很难或不能在进行分裂和增殖，属于终末分化细胞。因而中枢神经系统的损伤、变性导致的神经元丢失及缺损难以修复，神经功能的重建被视为几乎不可能。神经干细胞在体外分离培养和增殖的成功，为中枢神经系统再生和功能重建提供了新的可能途径。 一、神经干细胞 神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群，具有自我更新能力和多向分化潜能，对损伤和疾病具有反应能力。原代培养的单细胞在24h内自动聚集成团，这是神经干细胞在体外培养过程中的一个重要特征。 神经干细胞具有的特点有：①有增殖能力。②有自我维持和自我更新能力，对称分裂后形成的两个子细胞为干细胞，不对称分裂后形成的两个子细胞中的一个为干细胞，另一个为祖细胞，祖细胞在特定条件下可分化为多种神经细胞。③具有多向分化潜能，在不同因子下，可以分化成不同类型的神经细胞，损伤或疾病可以刺激神经干细胞分化。总之，自我更新能力和多向分化潜能是神经干细胞的两个基本特征。 二、实验步骤：神经干细胞原代取材及培养 1.原代取材 （1）脱颈处死2周龄孕鼠，孕鼠腹部以75%酒精消毒后，手术剪打开腹腔，取出子宫，剪开子宫，取出胎鼠，置于含冰冷PBS液的10cm培养皿中。 （2）将胎鼠断头，用眼科剪分离颅骨及硬脑膜，取出脑组织，在显微镜下充分取出脑膜和血管组织。 （3）将脑组织用PBS清洗三次，剪成1mm3大小的组织块，至于含DMEM/F12的离心管中，吸管轻吹打10次，静置离心管1~2min，取细胞悬液。重复2-3次。 （4）细胞悬液以700r/min离心6min,吸除上清，获得细胞沉淀。用(DMEM/F12+1%N2+2%B27+bFGF20mg/ml+EFG20mg/ml)重悬后，过200目筛网，并计数。（5）按5×105/ml密度接种，置于37℃，5%CO2培养。2天后隔天换液。通常一周左右，神经球长出。 2.传代培养 （1）在光镜下观察细胞球中心已出现灰黑色区域时进行传代，将培养基转移至15ml离心中，800r/min离心5min，弃上清。 （2）加入0.125%胰酶+0.02%EDTA消化2-3min，加入胰酶抑制剂终止消化，轻轻吹打神经球至至细胞悬液，800r/min离心5min，弃上清。 （3）加入适量干细胞培养液Neurobasal +1%N2+2%B27+20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF（添加谷氨酰胺），调整细胞浓度为5×105/ml，置于37℃，5%CO2继续传代培养。
干细胞管理办法JD
《干细胞临床研究管理办法（试行）》解读 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会2015-03-27 一、为什么要制定干细胞临床研究管理办法？ 干细胞是一种有多向分化潜能的细胞，具有再生各种组织器官的潜在功能。干细胞研究是近年来医学前沿重点发展领域，给某些疑难疾病的治疗提供了希望，受到广泛关注。目前在心肌梗塞、脊髓损伤、肝硬化、糖尿病等多领域的干细胞研究方兴未艾，展现出了良好的发展前景。我国在“十二五”科技规划中对干细胞研究给予了重点支持,并取得可喜进展。但在干细胞研究和转化的快速发展同时出现了一些不规范的现象，且作为一种正在研究探索中的新治疗方法，干细胞治疗对于人体的安全性、有效性尚待进一步验证，因此，制定《干细胞临床研究管理办法（试行）》（以下简称《办法（试行）》）及相关技术指南，规范干细胞临床研究，充分保护受试者权益势在必行。 《办法（试行）》在对国内外相关制度、规范进行深入调研分析的基础上，组织专家委员会起草，经过反复讨论，修改完善，已形成征求意见稿，现广泛征求意见。 二、《办法（试行）》的适用范围是什么？ 《办法（试行）》适用于在医疗机构开展的干细胞临床研究。 《办法（试行）》不适用于已有成熟技术规范的造血干细胞移植，以及按药品申报的干细胞临床试验。《办法（试
行）》提出：医疗机构按照《办法（试行）》要求完成干细胞临床研究后，不得直接进入临床应用；如申请药品注册临床试验，可将已获得的临床研究结果作为技术性申报资料提交并用于药品评价。 《办法（试行）》提出自文件发布之日起，干细胞治疗相关技术不再按照第三类医疗技术管理。 三、干细胞临床研究应当遵循的原则是什么？ 开展干细胞临床研究须遵循科学、规范、公开，医疗机构必须认真履行干细胞临床研究机构和项目备案、信息公开程序接受国家相关部门监管。 干细胞临床研究必须要符合伦理准则，符合《涉及人的生物医学研究伦理审查办法（试行）》和《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》的要求，保证受试者的权益得到充分尊重和保护。 四、干细胞临床研究是否允许收费？ 开展干细胞临床研究的机构不得向受试者收取干细胞临床研究相关费用，不得发布或变相发布干细胞临床研究广告。 五、干细胞临床研究项目的总体要求是什么？ 干细胞临床研究是指应用人自体或异体来源的干细胞经体外操作后输入（或植入）人体，用于疾病预防或治疗的临床研究。《办法（试行）》提出，研究必须具备充分的科