用PCR_PAGE切胶回收_PCR测序法制备DXS9898基因座等位基因分型标准

用ＰＣＲ-ＰＡＧＥ切胶回收-ＰＣＲ测序法制备ＤＸＳ９８９８

基因座等位基因分型标准物

吴淑珍１，夏露２，张洪勤３

（温州医学院，浙江 温州 ３２５０３５，１．基础医学实验中心；２．附属第二医院 妇产科；３．生物学实验教学中心）

［摘要］ 目的：探索一种快速制备Ｘ染色体短串联重复序列（ｓｈｏｒｔ　ｔａｎｄｅｍ　ｒｅｐｅａｔ，ＳＴＲ）基因座等位

基因分型标准物的简便方法。方法：采用ＰＣＲ-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＰＡＧＥ）切胶回收-二次ＰＣＲ-测序的方法制备Ｘ-ＳＴＲ基因座等位基因分型标准物。结果：应用此法制备出大量的ＤＸＳ９８９８基因座等位基因分型标准物。结论：利用ＰＣＲ-ＰＡＧＥ切胶回收-ＰＣＲ测序制备ＳＴＲ基因座等位基因分型标准物是一种简便易行的方法。

［关键词］ 聚丙烯酰胺凝胶电泳；切胶回收；ＤＸＳ９８９８基因座；等位基因分型标准物［中图分类号］

ＤＦ７９５．２［文献标识码］　Ｂ ［文章编号］　１０００－２１３８（２００９）０５－０４６０－０３

Ｘ染色体的ＳＴＲ广泛分布于真核基因组中，高度稳定且有高度多态性，　Ｘ-ＳＴＲ的最大应用价值就在于可以解决一些特殊的亲子鉴定案［１］，如单亲父女的亲权鉴定，缺乏双亲认定姐妹亲权关系。Ｘ-ＳＴＲ不仅在法医学中有其独特的应用价值，而且是进行Ｘ连锁遗传病基因诊断和基因定位的重要方法，对于人类学研究也有重要意义。Ｘ-ＳＴＲ基因座的基因型检测需经扩增、与等位基因分型标准物同步电泳才可获得正确的基因型。我们将ＰＣＲ、聚丙烯酰胺凝胶电泳、切胶回收ＰＣＲ产物、再次扩增及直接测序结合起来，探索了一种简单、快速制备ＤＸＳ９８９８基因座等位基因分型标准物的方法。１ 材料和方法

１．１ ＤＮＡ样品 １７４名汉族无关女性个体的血液样本来自温州地区，系本实验室日常检案积累。血液样本采用ＥＤＴＡＮａ２抗凝，Ｃｈｅｌｅｘ-１００快速法［２］提取ＤＮＡ。１．２ 方法

１．２．１ 首次ＰＣＲ扩增：ＤＸＳ９８９８基因座的引物序列参照基因组数据库（ｗｗｗ．ｇｄｂ．ｏｒｇ），由上海生工

收稿日期：２００８－１２－３１

基金项目：浙江省教育厅科研基金资助项目（Ｙ２００８０４６９９）。作者简介：吴淑珍（１９７２－），女，浙江乐清人，高级实验师，医学硕士。

?技术与方法?

生物工程公司合成。ＰＣＲ扩增条件为９４　℃变性３ｍｉｎ，然后９４　℃变性３５　ｓ，５８　℃退火３５　ｓ，７２℃延伸４０　ｓ，循环３５次后，７２　℃保持５　ｍｉｎ，于４　℃保存。扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分型，银染显色［３］。

１．２．２ 从聚丙烯酰胺凝胶中回收ＤＮＡ片段：在凝胶尚未完全干燥时用手术刀片切取含有目的条带的凝胶，要使切下的凝胶尽可能的细，用小镊子将其移入０．５　ｍＬ的离心管内，加２０μＬ　ＴＥ，用小镊子将凝胶夹碎，放入湿盒内，置于６０　℃　恒温干燥箱中过夜后，将管子放入ＰＣＲ仪中９５　℃　变性１０　ｍｉｎ，短暂离心后取上清液２μＬ作为再次ＰＣＲ扩增的模板。注意切取不同条带时要将刀片和小镊子尽可能地清洗干净，防止ＤＮＡ交叉污染。１．２．３ 再次ＰＣＲ扩增和序列测定：用上述ＤＮＡ模板，使用原引物，建立２０μＬ　ＰＣＲ反应体系，按第１次ＰＣＲ条件完成３５个循环。产物纯化后，委托上海盛兆生物科技有限公司用双脱氧终止法在ＡＢＩ公司的３７３０测序仪上测定序列。２ 结果

２．１ 首次ＰＣＲ的ＰＡＧＥ电泳结果 在１７４名温州

汉族无关女性个体中，ＤＸＳ９８９８基因座共检出５个等位基因，其多态性片段长度范围为１９３～２１４　ｂｐ。挑选含不同等位基因的５个汉族个体的ＰＣＲ扩增产物与ｐＵＣ１９　ＤＮＡ／ＭｓｐⅠ（ＨｐａⅡ）Ｍａｒｋｅｒ同步电泳

（见图１）。

２．２ 切胶回收与再次ＰＣＲ结果 分别切胶回收

图１ 温州汉族群体ＤＸＳ９８９８

基因座的５个汉族个体ＰＣＲ扩增产物（负极在上）图２ 切胶回收ＤＸＳ９８９８基因座各等位基因图３ 回收ＤＮＡ为模板再次ＰＣＲ

ＤＸＳ９８９８基因座各等位基因（见图２），并以回收ＤＮＡ为模板再次ＰＣＲ，结果见图３。

２．３ 再次ＰＣＲ产物直接测序结果 取ＤＸＳ９８９８基因座两个等位基因直接测序，

测序结果按照重复单

位的重复次数命名为等位基因８．３和等位基因１１（见图４）。

ＴＣＴＡＴＣＡＴＣＴＡＴＣＡＴＣＴＡＴＣＴＡＴＣＴＡＴＣＴＡＴＣＴＡＴＣＴＡＡＴＣＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＣＴＡＴ

ＣＴＡＴＣＴＣＴＡＴＴＴＡＴＣＡＡＴＣＴＡＴＴＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＣＴＧＧＡＴＧＣＴＤＸＳ９８９８基因座的等位基因８．３

ＴＣＴＡＴＣＡＴＣＴＡＴＣＴＡＴＣＴＡＴＣＴＡＴＣＴＡＴＣＴＡＴＣＴＡＴＣＴＡＴＣＴＡＴＣＴＡＡＴＣＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＣＴＡＴＣＴＡＴＣＴＣＴＡＴＴＴＡＴＣＡＡＴＣＴＡＴＴＧＡＴＣＴＧＴＣＤＸＳ９８９８基因座的等位基因１１

图４ 等位基因８．３和等位基因１１的测序结果

３ 讨论

目前，ＰＣＲ-ＳＴＲ分型技术已成为国内外物证鉴定的主流技术，按照国际ＤＮＡ委员会的要求，ＳＴＲ基因座的片段长度等位基因命名应有等位基因分型标准物作为参照，按重复单位的重复次数命名等位基因和基因型。因此，找到一种简便易行的方法制备一套精确的、国际标准化命名的标准参照物是非常必要的。

Ｘ染色体ＳＴＲ基因座作为常染色体和线粒体等多态性标记的重要补充，对Ｘ染色体的ＳＴＲ基因座分型结果作出正确地判定和命名，Ｘ-ＳＴＲ数据才能在个各实验室之间进行交流和合作。制备Ｘ染色体ＳＴＲ基因座等位基因分型标准物，目前经常采取的方法有两种：一是混合不同等位基因的扩增产物，

再对各等位基因进行测序［４－５］，该法的缺点是不适合

大量生产，一旦含有罕见等位基因的模板ＤＮＡ用完，很难调配出等位基因分型标准物。二是用克隆技术制备等位基因分型标准物［６］，克隆方法在克隆成功后，可以通过培养细菌来大量制备等位基因，对保留罕见等位基因比较方便，但因其需要克隆和细菌培养，操作较复杂，对技术和环境要求也较高。而本方法所使用的仪器设备简单，结果明确，重复性好，可以获得经典克隆测序一样的确切序列，而避免了克隆的复杂后续过程，且第一次、第二次ＰＣＲ和测序过程中用的都是统一引物，不需要再合成新的引物，所以该方法可供一般实验室广泛使用，但对其的准确性和稳定性的研究目前尚处在摸索阶段。

（参考文献下转第４６３页）

比较，Ｂ组大鼠平均逃避潜伏期延长且游泳总距离增加（均Ｐ＜０．０５），见表１。

３ 讨论

脑细胞对氨极敏感。血氨过高一方面抑制丙酮酸脱氢酶活性，从而影响乙酰辅酶Ａ的生成，干扰脑中三羧酸循环；另一方面氨在大脑的去毒过程中需消耗大量的α-酮戊二酸和谷氨酸，而α-酮戊二酸是三羧酸循环中的重要中间产物，缺少则使大脑细胞的能量供应不足，以致不能维持正常功能；谷氨酸是大脑的重要兴奋性神经递质，缺少则大脑抑制增加。新近研究认为氨的毒性还体现在它直接作用于神经膜，可引起突触后抑制［５］。但目前有关氨对空间学习记忆功能影响方面的研究鲜见报道。

本实验通过多次经腹腔注射小剂量氯化铵建立慢性氨中毒模型。游离血氨测定结果显示，氨中毒模型组大鼠血氨水平明显升高。同时发现，大鼠基本活动能力未受到明显影响，在Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫内，绝大多数大鼠游泳姿势正常，可以进行行为学检测。

目前学习记忆的动物模型基本包括两个方面：一是防御性回避学习，包括梭箱、爬杆、电击等；二是辨别性学习，包括各类迷宫。本实验采用的Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫有其明显的优越性，它将防御性回避作为驱动力，　同时又充分发挥其辨别性学习的能动性［６］，并结合特定的迷宫及摄像系统、正确的训练程序和专用的统计软件，使学习记忆实验研究的观测较全面，同时测量精度较好，在此基础上对氨中毒影响学习记忆行为的研究有一定的意义。在本实验中，　氨中毒模型组大鼠逃避潜伏期及搜索距离均较正常对照组明显延长，表明大鼠出现空间学习记忆能力的下降。

综上所述，血氨升高可导致大鼠学习记忆功能下降，但其具体机制尚待进一步研究。

参考文献：

[1]王宇明. 肝性脑病的定义、命名和诊断[J]. 中华肝脏病杂

志,2004 ,12 (5) :305-306.

[2]Hindfelt B, Plum F, Duffy TE. Effect of acute ammonia

intoxi cation on ce rebral metab olism in rat s with

portacavalshunts[J]. J Clin Invest,1977,55(3):386-396. [3]Essa MM, Subramanian P, Suthakar G, et al. Protective in-

fluence of Pongamia pinnata (Karanja) on blood ammonia

a nd ur ea le v el s i n a mmon i um ch lo r id e-i nd u ce d

hyperammonemia[J]. J Appl Biomed, 2005, 3(3):133-138.

[4]王小同,陈松芳,邵胜敏,等.慢性低O

2

高CO

2

对大鼠认知功能与CREB 表达的影响[J].温州医学院学报,2007,37(5): 418-421.

[5]Watabe AM, Carlisle HJ, O'Dell TJ . Postsynaptic induction

and presynaptic expression of group 1 mGluR-dependent

LTD in the hippocampal CA1 region[J]. J Neurophysiol,

2002,87(3):1395-1403.

[6]Gozal D, Daniel JM, Dohanich GP . Behavioral and Ana-

tomical Correlates of Chronic Episodic Hypoxia during Sleep

in the Rat[J]. J Neuroscience, 2001, 21(7):2442-2450.

（本文编辑：丁敏娇）

参考文献：

[1]吕德坚, 刘秋玲.X染色体STR的法医学应用进展[J].中国法

医学杂志,2002,17(4):252-255.

[2]Gehrig C, Hochmeister M, Borer UV, et al. Swiss Caucasian

population data for 13 STR loci using AmpFISTR profiler plus and cofiler PCR amplification kits[J].J Forensic Sci, 1999,44(5):1035-1038.

[3]吴淑珍,吕建新,张洪勤. 3个STR基因座在温州汉族群体中

的遗传多态性[J].中国法医学杂志,2004,19(2):102-103.

[4]石美森,应斌武,邓建强,等.成都地区汉族人群X染色体3个

STR基因座的遗传多态性及其法医学应用[J].四川大学学

报:医学版,2004,35(4):473-476.

[5]杨昕,廖灿,黄以宁,等.广东汉族人群21号染色体4个短串联

重复序列多态性[J].中华医学遗传学杂志,2006,12(6):689-690.

[6]余兵,秦群霞,闫金成,等.西安汉族X染色体上6个STR位点

的遗传多态性[J].法医学杂志,2005,21(3):188-191.

（本文编辑：胡苗苗）

（上接第４６１页）