传染病操作手册

北京科美东雅生物技术有限公司
化学发光产品操作指南系列
微孔板式化学发光免疫分析 实验操作注意事项
（内部使用）
郑金来
北京科美东雅生物技术有限公司 2007-9-10

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一、 前
言
微孔板式化学发光免疫分析诊断试剂是一类兼顾酶促放大反应和化学发光 的优点的一类试剂，英文简写 CLIA。北京科美东雅生物技术有限公司自 2000 年 初致力于 CLIA 诊断试剂的研究，已经已经成功推出传染病系列、激素系列和肿 瘤系列三大系列几十个品种的产品。 CLIA 与传统的酶联免疫（ELISA）产品相比，具有灵敏度高、线性范围宽、 测试结果准确等优点。 另外， 基于微孔板的发光产品非常适合大规模体检之应用， 符合中国疾病发病图谱。 临床检测结果的准确需要厂家和客户携手解决， 为了规范 CLIA 产品的操作， 特起草本书。 该操作注意事项仅供北京科美东雅生物技术有限公司的内部人员使 用和参考。
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二、微孔板 CLIA 操作指南
优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证 CLIA 检测结果准确可靠的必要条件。这 部分内容与传统的 ELISA 模式一致。 北京科美东雅生物技术有限公司力争为客户提供优质的 试剂和良好的仪器，与此同时需要客户进行正确的操作。三管齐下，方可保证结果的准确可 靠和重复性。 正确的操作源自对说明书的仔细阅读， 即使是同是北京科美东雅生物技术有限 公司的产品， 不同批次产品的说明书也应再次仔细阅读， 确保本批次产品与上批次产品在具 体细节上没有区别，防止按照旧有习惯进行处理而导致不准确的结果。严格遵照规定操作， 必能得出准确的结果。
1、标本的采取和保存 可用作 CLIA 测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿 液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血 清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗 凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自 然凝固、血块收缩后即可取得。目前本公司推出的产品主要以血清标本为主。血清的采集和 保存应该注意： 血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧 化物酶活性的物质，以 HRP 为标记的 CLIA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性 本底。 血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性过氧化物酶， 导致假阳性反应。 如在冰箱中保存过久，其中的 IgG 可发生聚合，在间接法 CLIA 中会使本底加深。 一般说来，在 7 天内测定的血清标本可放置于 4℃，超过 3 天测定的需低温保存。 冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀但动作宜轻缓，避免 产生气泡，可上下颠倒混和，切忌在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标 本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的 血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冻存。 保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。辣根过氧化物酶系
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统可以使用硫柳汞作为防腐剂， 绝对不可以使用叠氮钠和十二烷基硫酸钠 （SDS） 。 碱性磷酸酶可以使用叠氮钠作为防腐剂。本公司的产品大多为辣根过氧化物酶系 统。请仔细核对说明书。 采集全血标本时，建议静置半小时以上后，3000 转/分钟离心 6 分钟以上充分分 离血清（浆），使血清（浆）不含或极少含红、白细胞。否则可能会导致假阳性 结果。
2、试剂的准备 实验开始前请务必仔细阅读说明书，并按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。 本公司生产的 CLIA 试剂盒中只有校准品（部分产品）、洗液等需要用蒸馏水或去离子水稀 释或溶解。稀释或溶解时应该注意： 这些水应该是新鲜的和高质量的，如果水中含有过多的 Ca 、Mg ，这些离子会占 用表面活性剂，影响洗涤效果。如果水的质量较差，会影响结果的准确性。 有些医院或公司有自己的纯水系统， 一定要注意监控水质理化指标和微生物指标。 事实发现，个别医院的纯水系统由于未按时维护，导致出水水质差或微生物升高， 结果在酶促化学发光系统中导致结果的本底偏高或异常。 如果没有纯化水的制备系统或设备，也可以购买符合质量的蒸馏水或去离子水。 如果发现洗液结冰，建议等到完全融化后使用。如果只部分融化会造成离子强度 的变化和不均一性，影响结果的准确。
2+ 2+
注：试剂盒中的各液体组分不可以反复冻融。
不同批号的试剂和微孔板不可混用。过期的试剂盒也不可使用。 目前国内使用的各种形式的微孔板基本上都是聚苯乙烯材质的， 众所周知， 聚苯乙烯是 热的不良导体， 研究证实： 100μl 4°C 的液体加入到聚苯乙烯的微孔板后， 需要 20min-30min 才可以达到室温平衡。因此除需要 4°C 反应的产品外，从冰箱中取出的试剂与标本应室温平 衡后方可使用。 平衡时间不少于 15min， 30min 为佳。 以 液体体积越大需要平衡的时间越长。 如果时间过短会导致整体发光计数偏低， 其中标本体积多的发光计数的偏低的多， 而体积少 的偏低的少。由于酶促反应是二级反应，温度每改变 10°C，反应速率会有两倍的变化。因
此应该关注试剂、微孔板等的温度的均一性，这是保证结果正确性和重复性的一个重要手
试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 剩余的包被微孔板应该加干燥剂 段。 密封在塑料袋中保存。
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3、加样 与传统的 ELISA 一致， CLIA 试剂盒实验过程中一般有 3 次加样步聚， 在 即加标本/校准 品/质控品、加酶结合物、加底物。 加样时应将所加物加在微孔板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出， 不可产生气泡。
注：一旦溅出，不仅本孔的实验结果会受影响，附近孔的实验结果也可能受到波及， 甚至会影响结果的判断。尤其是一些强阳性的标本，一旦溅出一点到附近的孔中，该 孔的结果就有可能完全改变。下图中只有第四个图中的加样过程是正确的。
（√） 加不同的标本应更换 Tip 头，以免发生交叉污染。 标本需要稀释时，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样；也可在板孔中先加 入稀释液，然后再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡 1min 以保证混 和。据统计学调查，成人血清的 IgG 浓度为 12mg/ml，而有些人（如系统性红斑狼 疮、多发性骨髓瘤等疾病的患者）的 IgG 浓度会远远高于此（IgG 浓度可高达 50mg/ml），这部分人的血清如果稀释不当会引起本底升高或假阳性。
注：如果先加入血清标本，再加入稀释液会导致结果的不准确。另外，建议稀释标本 时尽量采用吸附性能低的塑料管或玻璃管（比如聚丙烯塑料管）。如果稀释倍数过大， 如大于 1：1000，建议采用两步进行稀释，否则误差会很大。如果需要稀释 2μl 或更 少，为减少误差建议准备一个较大的容器以稀释更多的待检标本。
有些强阳性的标本可能会超出线性范围，建议稀释后测量。可以用试剂盒中的 S0 点作为稀释液，也可以用正常人血清作为稀释液。
注：除非说明书中注明，否则绝对不可以用生理盐水、PBS 等进行稀释，否则由于没 有了保护性蛋白的竞争作用，会导致测值偏高。
加酶结合物和底物时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。 加样速度尽可能快，保证各标本反应条件的一致性和可比性。在一整块板上加标 本和加酶结合物的时间最好控制 10min 以内。 在加样前，建议将校准品、质控品、标本、酶结合物等根据微孔板的布局从左至 右依次排开。打开校准品瓶盖时，应该先打开低浓度的盖子，再依次打开高浓度
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的盖子。在盖上校准品的盖子时，应该先盖高浓度校准品的盖子。 加样时尽量让样品管远离微孔板上方，以避免开合瓶盖时瓶口残留的样品干粉坠 落微孔板中，造成交叉污染。 加阳性对照或样品时，有时开瓶盖时瓶口产生气泡盖住瓶口，此时应使瓶口朝外 用加样枪小心捅破气泡，再吸取液体加样，以免气泡崩裂溅到微孔板中或操作员 脸上造成污染。 加每一份液体溶液时，建议用 Tip 头将待加样的试剂吹打 1-2 次，以便保证 Tip 头中的液体与原液体的性质是一致的。 加样时如果产生气泡，加样器吹掉重新吸样。如果还是产生气泡，更换 Tip 头再 次吸样。 如果液体过于粘稠，吸取样品时要慢。否则在 Tip 头的顶端会产生一段气柱。 在所有的加样结束后，为防止蒸发，微孔板上贴上封板贴，然后在微型振荡器上 震荡 1min，或者右手自然放在桌面上，左手平移桌面上的微孔板轻轻敲打右手， 至少 20 次以达到混匀的目的。
注：加样后应该核对一下是否有漏加或误加样。如果漏加可能会导致假阴性。
加样器需要定期校正：校正一般采用称重法，量取加样器量程的最小和最大体积， 各 10 次，称重，计算 CV。CV 一般在 2%-3%为佳，超过 2%-3%的加样器需要校正。
注：需要注意的是，加样器使用前应注意其使用量程，大于或小于量程使用时量取体 积均不准确，且容易损坏加样器。
4、温育 在 CLIA 中抗原抗体反应的完成也需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育 (incubation)。CLIA 属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包 被的夹心法为例， 加入板孔中的标本， 其中的抗原并不是都有均等的和固相抗体结合的机会， 只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。 这是一个逐步平衡的过程， 因此需经 扩散才能达到反应的终点。 在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。 这就是 为什么 ELISA 及 CLIA 反应总是需要一定的时间温育。
注：国外研究发现：低粘稠的液体达到平衡需要数小时的时间，血清和血浆应该需要更多 的时间。事实上，诊断试剂厂商为兼顾操作的简便性和结果的准确性，温育时间一般为 30min-2hr。在这样的一个短的时间内，反应还未达到或未完全达到平衡。为保证结果的重
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复性和准确性，每次实验时务必保证时间的一致性。
抗原抗体反应平衡示意图 温育常采用的温度有 37°C、室温和 4°C（冰箱温度）等。37°C 是实验室中常用的 保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。抗原抗体反应 4℃更为彻底，在 放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长， 在微孔板的检测中一般不予采用。 37°C 保温的方式一般均采用水浴，可将微孔板置于水浴箱中，微孔板板底应贴着 水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用封板贴或保鲜膜覆盖 板孔，此时也可让反应板漂浮在水面上。
注：封板贴为一次性用品，不可重复使用，避免交叉污染。
室温反应通常是 20°C-27°C。ELISA 和 CLIA 都是酶促动力学反应，温度的降低会 直接降低反应速度下降。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范 围内，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育温度。室温温育时，微孔板只 要贴上封板贴平置于操作台上即可。 无论是如何保温，反应板均不宜叠放，以保证各微孔板温度都能迅速平衡。 另外，温育中还有边缘效应，边上的值会偏高，建议为了客观的判断结果，将质 控放在非边缘位置。 应注意温育的温度和时间应按规定力求准确，并保证分析间的一致性。为保证这 一点，一个人操作时，一次不宜多于两块微孔板同时测定。 某些医院使用一些全自动的仪器进行加样、保温，此时务必注意检查温育温度是 否正确或控制开关是否打开。本公司的传染病 CLIA 产品一般是 37°C 温育，其余 CLIA 产品大都是室温反应，请仔细核对说明书。
注：建议客户在保温期间把标本的信息输入本公司提供的发光仪软件中，设置好各项 参数。不要等加入发光底物后再输信息以免因操作不熟练导致时间过长。
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5 洗涤 洗涤在 ELISA 和 CLIA 过程中虽不是一个反应步骤， 但决定着实验的成败。 ELSIA 和 CLIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。 通过洗涤以清除残留在板孔中没能 与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。 聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的， 而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干 扰物质洗涤下来。可以说在微孔板免疫检测操作中，洗涤是最主要的关键技术，应引起操作 者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。 本公司提供的产品一般会提供配套的洗板机， 我们的技术支持人员安装调试之后， 请不 要调整随意调整洗头的高低， 以免影响洗涤的效果。 在用洗板机洗涤的时候， 应该注意观察， 而不是放手不管： 在洗涤前必须观察洗液是否足够，如果不足请及时更换或补充。如果洗液配制时 间过长，长于 2 个月，建议更换新鲜的洗液。 洗板机管路系统和洗液储存瓶子是否有微生物生长，污染的微生物会导致错误的 结果。 洗涤时应观察洗针是否堵塞、不出洗液或不能有效吸洗液，如果堵塞请及时维护。 在出现下述情况是应该格外注意： 洗涤快完成时，某些孔依然呈现粉红色说明有洗针堵塞，或由于某些管路扭曲、 打折造成洗板时只吸液而不注液。 在结果测定后发现某一行的数据比较接近，与其他行的数据差异很大，也有可能 是堵塞造成的，应该检查洗板机。 反应板后几列整体 RLU 值偏高，可能是由于洗液不够导致后几列未洗干净。 据不完全统计，在临床检测结果错误的案例中，不少于 30%是由于洗板机堵塞或微生物 污染造成的。 如果采用手工洗涤，一定不要让相邻孔的液体交叉，以免影响结果的判断。不论是手工 洗涤还是机器洗涤，建议洗涤 5 次，每孔洗液体积不少于 350μl。每次浸泡的时间不少于 30s。洗板的次数不够，孔内多余的抗原（抗体）或酶结合物不能彻底去除，会因此导致本 底升高。洗涤次数过多可能导致整体发光信号减弱。 洗完板子后， 应在吸水纸或干净的毛巾上拍板以进一步去除残余的水分， 一般至少需要 拍打 3-5 次。拍板最好的效果是：目视微孔板孔底，只能看到一个非常细小的位于板孔中央 的水珠。如果看不到水珠，证明拍板不够彻底。通常情况下，只要吸水纸或毛巾不再变湿即
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认为可以。拍板时尽量采用质量好的毛巾和吸水纸，使用易掉渣的纸，纸屑会留在板孔中， 由于纸屑中含有氧化剂而造成高值阴性。
6 底物和发光 加入底物温育是 CLIA 中的最后一步温育反应，此时酶催化无色的底物发光。反应的温 度和时间仍是影响发光技术的因素。为保证产品的质量，本公司所用底物主要为进口 Luminol 系统，个别产品是 AMPPD 系统。 由于 Luminol 受光照的影响较大，应该避光保存。加底物时可以将 A 液和 B 液混 合后每孔加入 100μl，也可每孔先加入 A 液 50μl，再加入 B 液 50μl，轻轻振荡数 秒混匀。在用前应现用现配(在配制前，将装有发光底物的瓶子放在室温平衡)。
注：发光底物为 1：1 进行配制，建议客户不要直接将整瓶的 A 液和 B 液完全混合，应 该采用量具（如加样器等）准确量取配制工作液。
加发光底物液的加样器应专用， Tip 头应确保干净无污染， 在加发光底物液的过程 中应避免 Tip 头与板孔或手指接触，以防底物受到污染而造成本底升高。 Luminol 发光底物在室温情况下（20°C-27°C）,约在 5min 时达到最大发光强度。 然后随着时间的延长逐渐降低。在 5min-30min 内测量有效。如果反应温度较高， 将在较短的时间内达到峰值。 如果测量时间长于 30min， 测量的结果变化会比较大， 甚至影响结果的准确性，导致假阳性和假阴性结果的出现。
注：建议用户在反应 14-15min 时测量读数，为保证测量结果重复性和准确性，分析间 尽可能在同一时间检测。
控制底物反应和检测的室温， 应该保持在 20°C-27°C。 温度过高会加速底物的反应， 另外发光仪在读数时也会受到影响。不仅导致本底的升高，甚至会产生不必要的 错误结果。 Luminol 发光底物会受到实验室消毒用的消毒剂及其他氧化剂的影响。 一些强氧化 剂比如 84 消毒剂、次氯酸等都会导致发光底物自发光升高，甚至会导致底物反应 加速，5min 时已经不是峰值。如果这些氧化剂不慎滴入某一个孔中，对这个孔的 标本影响会非常大，有可能出现错误的结果。
注：临床实验室应该关注本实验室的消毒剂种类、消毒方式（有的医院通过送风系统 进行全面消毒或具备进行消毒）、消毒周期和频率，消毒期间临床检测结果的突然变 化应首先考虑消毒的影响。二氧化氯消毒片对本公司产品无影响。
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水质对发光计数的影响也非常大。判断水质是否有问题，可以采用如下方法进行： 如果实验室用自己配制或稀释的洗液洗板后，与未洗的板相比，测量底物自发光 偏高，RLU 值高出 2 倍，表明实验室所用的纯化水有问题。建议对制水系统进行检 查和维修。
注：水质对发光的影响可能是由于水质中的重金属离子含量超标、微生物污染等。如 果经常发现发光底物的自发光或者阴性对照总是偏高，建议考虑水质的影响。
反应温育期间，根据本公司技术人员的培训，设置好软件的各项参数。测量时将 微孔板按照正确的方向放入发光仪的托盘上，务必注意微孔板是否放反，如果放 反了将直接影响结果的判断。在一些客户使用时的确发生过因微孔板放反导致结 果错误的现象的发生。
注：有的客户在加入发光底物后才设置软件和输入标本信息，如果输入的信息和参数 过多，可能导致操作时间过长，如果检测的时间超过 30 分钟有可能导致错误的结果， 甚至产生假阳性和假阴性。
关于定性实验 Cutoff 值的判断：定性测定结果确定的依据在于判定值（Cutoff） 的建立， Cutoff 值的确立应尽可能地避免错误结果的出现。统计学上认为，大 量临床标本 RLU 值或 OD 值呈正/偏态分布；这些标本 RLU 值是由低到高的连续曲 线；Cutoff 值是这个连续曲线上的截断值。如图所示，不论采取什么样的置信区 间，总是有部分有反应性标本落在无反应性区域；或无反应性标本落在有反应性 区域。从统计上说，是无法避免的。根据这个原理，人们习惯将 Cutoff 上下一定 比例（如 20%或 2SD）的范围作为灰区，对于这部分灰区样本可采用多次数检 验的方法作为结果判断的依据。如进行 3 次重复性试验，有 2 次为阳性，1 次为阴 性，判断样本为阳性。
关于定量产品少数标本小于零的原因：在检测标本时，某些夹心法、间接法定量 产品可能会出现标本的 RLU 低于 S0 的现象，竞争法可能会出现 RLU 高于 S0 的现 象。主要原因是：a)在低值区域，CV 较大。如果多次测量均值可能会接近 S0 的均 值；b)可能存在一些基质效应的影响。目前该问题在各品牌的诊断试剂中都普遍
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存在，但是不影响临床的判断。部分厂家为了减少这种现象的发生，对 S0 点进行 了特殊的处理，笔者认为这不是一种科学的态度。
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三、常见假阳性问题分析
与 ELISA 方法一致，CLIA 在检测标本时也会受到较多因素的影响，而且其操作有一定 的技术要求，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性 结果）。引起测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。北京科 美东雅生物技术有限公司所提供的各类 CLIA 试剂在开发时，已经考虑到了这些可能导致错 误结果的因素， 力争给客户提供最完善的服务和高品质的试剂。 虽然目前对导致假阳性和假 阴性结果的各种标本因素比较清楚，我们综合整理在此再简单的总结一下。 血清是最常用的标本，血浆一般可视为与血清同等的标本，标本引起的假阳性和假阴 性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性物质和外源性物质两种： 1、内源性物质 有人认为大约 40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结 果。常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导 的抗鼠 IgG 抗体、不明原因的交叉反应物质和其它物质等。 （1）类风湿因子：人血清中 IgM、IgG 型类风湿因子（RF）可以与酶联免疫系统中的 捕获抗体及酶标记二抗的 FC 段直接结合，从而导致假阳性。解决该情况的办法是：①用 F(ab)2 替代完整的 IgG；②标本用联有热变性（63℃，10 min）IgG 的固相吸附剂处理（将 热变性 IgG 加入到标本稀释液中同样有效）；③检测抗原时，可以用 2-巯基乙醇等加入到 标本稀释液中，使 RF 降解。 （2）补体：酶联免疫系统中固相一抗和标记二抗过程中，抗体分子发生变构，其 FC 段的补体 C1q 分子结合位点被暴露出来，使 C1q 可以将二者连接起来，从而造成假阳性。解 决的办法是：①用含有 EDTA 的稀释液稀释标本；②用 53℃，10min 或 56℃，30min 加热 血清使 C1q 灭活。 （3）嗜异性抗体：人类血清中含有能与啮齿类动物（如鼠等）IgG 结合的天然嗜异性 抗体，可将酶联免疫系统中一抗和二抗连接起来，也能造成假阳性。临床开展的用鼠源性 CD3 等单克隆抗体治疗，如用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技 术，均有可能使这些病人体内产生抗鼠抗体；另外，被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可 以产生抗鼠 IgG 抗体。这些病人样本在酶联免疫测定时均可产生假阳性。解决的办法是： 可在标本稀释液中加入过量的动物 IgG，但加入量不足或亚类不同时无效。
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人抗动物抗体产生的原因为医源性与非医源性因素。医源性因素包括动物源性蛋白、 胸腺肽、靶抗体造影剂、靶抗体药物、被动免疫动物血制品（如破伤风抗毒素、胰岛素、凝 血因子 VIII）等，非医源性因素包括母婴传递、偶然或职业性原因与动物蛋白接触史（如兽 医、牧区、食品加工人员、宠物饲养等）、选择性 IgA 缺乏症患者食入牛奶及动物蛋白食品 等。对个体而言，受到外源性异种蛋白（如鼠、牛、羊、马等）抗原刺激，激发机体免疫反 应，即可导致人体产生抗动物蛋白抗体。在实验检测中，标本内的人抗动物抗体与试剂中的 动物蛋白反应，可导致检测结果的异常。其中影响最大的是人抗鼠抗体（HAMAs）。据调 查， 人体中存在抗动物抗体约 1%-80%， 其中 HAMAs 占 76%， 血中浓度可以高达 mg/L-g/L 水平， 持续时间 2 个月至数月。 从现在的报道揭示， 国内普通人群 HAMAs 阳性率 0.8%-2.8%， 其中系统性红斑狼疮 SLE 患者阳性率 7.9%；类风湿 RA 患者阳性率 5%；肾病患者阳性率 8.3%；肿瘤疾病患者 7.4%。美国 FDA 规定，试剂生产厂家若采用鼠抗体，试剂盒上必须 警示“任何使用过鼠单克隆抗体作为诊断或治疗的患者，其样本均可能含有 HAMAs，该抗 体的存在可导致试验结果出现假阳性或假阴性”。因此医生应该主动询问患者是否有动物 源性的接触史、鼠源性生物制品的接触史等，并将相关情况告知检验科。
异嗜性抗体假阳性示意图
（4）嗜靶抗原的自身抗体：抗甲状腺球蛋白、抗甲状腺激素等抗体、抗胰岛素等嗜靶 抗原的自身抗体， 有时能与靶抗原结合形成复合物， 在免疫方法中均可干扰抗原抗体测定结 果。为避免以上情况出现，解决的办法是：测定前需用理化方法将其解离后再测定。另外， 自身免疫性疾病有时会产生抗酪蛋白自身抗体， 如果使用酪蛋白封闭， 也会导致假阳性结果 的出现。在许多自身免疫性疾病中碱性磷酸酶的活性（水平）升高等都有可能导致错误结果 的出现。 （6）交叉反应物质：类地高辛、类 AFP 样物质等，是与靶抗原有交叉反应的物质。在
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用多抗测定抗原时对测定结果影响不大， 但在用单克隆抗体测定抗原时， 如果交叉抗原决定 簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。 （7）标本中其它成分的影响：血清脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液粘度过大等， 均对酶促免疫检测结果有一定的干扰作用。 （8）基因重组或人工合成抗原的影响：体现在融合蛋白、错误排序和纯度三个方面。 这些影响主要体现在受过大肠杆菌感染的人血清中的抗体会导致假阳性结果。 融合蛋白对基因工程抗原特异性的影响：如果包被的基因工程抗原为融合蛋白， 包含了来自表达载体的一些序列，因此可以与血清中相应的受体或抗体发生反应 而产生假阳性结果。 错误排序的影响：合成肽在制备过程中，如果某些肽序列错误，会导致合成肽特 异性改变而产生假阳性。另外，在构建基因工程表达载体时引入的核苷酸发生相 位改变或点突变也会对抗原的特异性产生不利的影响，但由于基因工程技术的不 断进步，由工艺原因造成的抗原特异性降低会逐渐被克服。 抗原纯度对特异性的影响：目前较多的重组抗原的宿主是大肠杆菌，利用大肠杆 菌大规模表达后需经破碎细胞、盐析、离子交换柱等分离纯化步骤才能最后的到 一定纯度的重组抗原。 目前的工艺还不能做到抗原纯度为 100％， 因此抗原中还混 有大肠杆菌的其它杂蛋白，受过大肠杆菌感染的人，血清中的抗大肠杆菌抗体可 和这些杂蛋白产生反应而引起假阳性。
2、外源性物质 外源性物质常常是由于用于酶促免疫测定的血标本的采集、贮存等不当所致。如标本 溶血、标本被细菌污染、标本贮存过久、血标本凝固不全和采血管中添加物等影响。 （1）标本溶血：由于各种人为原因引起的标本溶血，均可因红细胞破坏溶解时释放出 大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白， 在以辣根过氧化物酶为标记的酶促免疫测定中， 会导 致非特异性反应，干扰测定结果。为克服上述干扰作用，标本采集时必须注意避免溶血。 （2）标本受细菌污染：因菌体中可能含有内源性过氧化物酶，因此，被细菌污染的标 本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。 （3）标本保存不当：在冰箱中保存过久的标本，血清中 IgG 可聚合成多聚体、AFP 可 形成二聚体，在间接法测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性；标本放置时间过长（如一 天以上），有时抗原或抗体免疫活性减弱，亦可出现假阴性。在某些检测项目比如 C 肽、
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胰岛素、甲状旁腺激素等由于存放时间过长导致测量结果错误。为克服上述干扰，免疫分析 测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，3 天内测定的血清标本可存放于 4℃，超 过 3 天后测定的血清标本应低温冻存；冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应 充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。蛋白类待检物质会因为剧烈的震荡而 发生变性，从而测量结果错误。 （4）标本凝固不全：在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下，正常血液采集后 1/2~2h 开始凝固，18~24h 完全凝固。临床检验工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还 未开始凝固时即强行离心分离血清， 此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原， 在酶促免疫测定 过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块， 易造成假阳性结果； 这类情况于次日复查时因血凝 已完全，血清中不再有纤维蛋白原存在，故复查结果变为阴性。为避免上述干扰作用，解决 的办法最好是血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清， 或标本采集时用带分离胶的 采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。 （5）标本管中添加物质的影响：抗凝剂（如肝素，EDTA）、酶抑制剂（如 NaN3 可抑 制酶联免疫系统中辣根过氧化物酶活性） 及快速分离血清的分离胶等均对酶联免疫测定有一 定干扰作用。
综上所述，对临床检验酶促免疫测定中出现的假阳性或假阴性结果，在考虑试剂因素 和操作因素之外，更多的应从标本因素方面进行分析，并应采取相应措施排除干扰作用，从 而为临床提供正确可靠的检测结果。这需要医院和生产厂商共同努力。
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四、酶促化学发光免疫分析操作问题汇总
操作步骤 可能原因 解决办法 试剂准备 严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡 30-60min。 1.血清或血浆标本分离不好即 1.标本为血清：最好将血液先自然存放 1-2 小时 进行加样； 2.手工操作中， 加样板过多造成 后，再用 3000rmp 离心 15min；标本为血浆：必须 采血后必须立即 加样后放入温箱前等待时间过 使用含抗凝剂的血液标本收集管， 长(特别是室内温度较高时)； 颠倒采血管混合 5-10 次，放置一段时间后， 3.加完标本再加酶试剂时酶溅 3000rpm 离心 15min；若在几天内检测，可放在 2-8℃冰箱中， 若要长期贮存， 则置于-20℃的低温 出孔外。 4.加完样品过于剧烈震荡， 容易 冰箱内。 导致标本溅出到附近的孔中。 2.加样时，要慢吸快打，不要产生气泡。加样后及 5.加样过程应该采用正确的加 时放入温箱。 3.加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。 样姿势和方式。 6.加样完后，应该核查是否漏 4.标本较多时，请分批操作。 加、误加 1.温育时未贴封板贴或加盖， 使 标本或稀释液蒸发，吸附于孔 壁，难于清洗彻底； 2.温育时间人为延长， 导致非特 1.贴封板贴或加盖； 异性结合紧附于反应孔周围， 2.按说明步骤严格控制操作时间。 难 以清洗彻底。 3.黏贴封板贴和撕下封板贴时 要小心，防止液体溅出。 1.采用手工洗板,孔与孔之间液 体交叉污染。 洗板针畅通， 洗完板后最好 2.采用半自动洗板机洗板时， 1.保证洗液注满各孔， 洗 液量不足，导致洗板不彻底；洗 在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻 板针堵塞，抽吸不完全；洗板不 轻拍干； 2.合理安排，或多用几台洗板机。 畅，导致洗板效果差。 3.反应板过多造成洗板等待时 间长。 1.发光底物尽量在临用前配制，坚持不用过期底 物； 2.加样时保持底物不外流； 3.A、B 底物液应避免接触金属器械。 做好标记，保证微孔板的前后顺序
加样
温育
洗板
1.底物配制后放置时间过长或 使用过期底物； 发光底物 2.加底物时溅出孔外造成液体 回流。 读板 微孔板前后顺序放反
全过程
1. 整个操作过程中保证微孔板不接触次氯酸等氧化剂。 2. 严格控制不同分析间的时间、温度等条件。
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