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酵母菌、乳酸杆菌的分离筛选

姓名:温迪雅学号:10991367 专业:环境科学

乳酸杆菌的分离筛选及鉴定

一、材料与方法:

1、菌种:新鲜乳酸饮料(标记只含有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌)

2、试剂:脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙;0.4gNaOH固体、4.2ml 浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g、香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g;

3、仪器:高压蒸汽灭菌锅、恒压干热灭菌箱、超净工作台、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、牛角匙、电炉、量筒、漏斗、漏斗架、玻璃棒、棉塞、吸管、线绳、标签、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯、酒精灯、石棉网、接种针(环)、擦镜纸

4、方法:(1)无菌操作倒平板、十倍稀释、划线分离,恒温培养

(2)菌落观察与镜检

(3)筛选生产用菌株

二、实验步骤

1、分离

(1)配制BCG牛乳培养基,分装三角瓶,包扎,灭菌备用。

BCG牛乳培养基配制:

A溶液:脱脂乳粉100g,水500ml,加入1.6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液1ml,80℃灭菌20min。(1.6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成)

B溶液:酵母膏10g,水500ml,琼脂20g,PH6.8,121℃湿热灭菌20min。以灭菌操作趁热将A溶液和B溶液混合均匀后倒平板。

(2)样品的处理

按照无菌操作要求,从市售新鲜酸乳中吸取10ml检样,放入装有90ml无菌水的三角瓶内,振摇混匀。

(3)分离方法

①倒培养基

在无菌室,先用紫外线照射半小时把表面菌灭了,在通风10min后,每培养皿倾注约15ml左右已溶化的BCG牛乳培养基,立即放在桌上摇匀,冷却凝固后即成平板。

②十倍稀释法

将检样充分摇匀后,用十倍稀释法稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5各种稀释度的样品液。

③分离

直接用接种环蘸取10-2、10-3 两个稀释度的试管中原液,在BCG牛乳培养基琼脂平板上划线分离,每稀释度做两个平皿。置40℃培养箱中培养48h。如出现圆形稍扁平的黄色菌落及周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。

2、鉴别

(1)配制脱脂乳试管培养基,分装试管,包扎,灭菌备用。

脱脂乳试管培养基成分:20g脱脂奶粉,285ml灭菌水。

配制好的脱脂乳培养基分装到15支试管中。

(2)选取经初步鉴定的乳酸菌典型菌落,用接种环挑取转至脱脂乳试管中,40℃培养箱中培养8~24h。若牛乳出现凝固,无汽泡,呈酸性,涂片镜检细胞为杆状或链球状(两种形状的菌种分别选入),革兰氏染色显阳性,则可将其连续传代4~6次,最终选择出在3~6h能凝固的牛乳管,作菌种待用

【参考资料】:

1、沈萍,等.微生物学实验[J].第四版,高等教育出版社

2、徐松滨,李威娜.酸奶中保加利亚乳杆菌的分离和鉴定[J]. 2003

3、中国微生态学杂志. 2011年2月第23卷第2期117

4、刘屹峰;乳酸菌的生理特性和生物学功能[J];丹东纺专学报;2002年02期

5、何蕾;我国传统奶制品中乳酸菌多样性研究[D];四川农业大学;2010年

6、张红印,崔焕成,杜娟,张安让,尹郑红;乳酸菌发酵在食品加工中的应用[J];郑州牧业工程高等专科学校学报;2000年03期

7、赵丽丽;乳酸菌的分离鉴定及其在酸豆乳加工中的应用[D];北京工商大学;2009

8、金世琳;乳酸菌的科学与技术[J];中国乳品工业;1998年02期

9、吕绍杰;发酵乳酸的特性及发展前景[J];精细与专用化学品;2000年20期

10、王莉;刘秀花;刘燕雅;;乳酸菌的筛选及生物学特性的研究[J];商丘师范学院学报;2008年12期

酿酒酵母菌的分离筛选及鉴定

一、材料与方法

1、材料:苹果皮

2、试剂:马铃薯葡萄糖琼脂培养基:马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂20g,水1000ml,分装三角瓶;乳酸马铃薯葡萄糖培养液:马铃薯200g,葡萄糖20g,乳酸5ml,pH5.5,分装试管

3、仪器:无菌培养皿,无菌水,显微镜,接种环,枪,美兰染液

二、实验步骤

1、分离

(1)接种:取苹果皮,加入到100ml无菌水中,充分搅拌后,用枪吸取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中,在28°C-30°C培养箱中培养24h (2)加富培养:用枪吸取上述溶液1ml,注入另一管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中,在28°C-30°C培养箱中培养24h

(3)镜检:用接种环取少量菌液置于载玻片上,中央滴一滴美兰染液,在高倍镜下观察酵母菌的形态和出芽方式,并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞,因为活细胞使美兰染液还原,故菌体不着色

(4)涂皿:用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板,用枪吸取0.1ml加富培养液到平板中,涂匀后培养24h

(5)分离纯化:用接种环挑取单个酵母菌菌落,在平板上划线,培养后分离得到单个菌落。

(6)镜检:挑取单菌落,制片观察形态

2、鉴定

(1)鉴定材料:

分离的酵母菌

菌种分离培养基:11°P无酒花麦汁琼脂培养基

菌种斜面培养基:11°P无酒花麦汁琼脂培养基

发酵麦汁:11°P普通麦芽汁

硫酸钙缓冲液

(2)实验步骤:

观察单菌落,选取生长快、菌落大小适中、洁净、有代表性的移入液体试管中→培养后划斜面→1级筛选→选出两个候选菌株同保藏菌种一起进行鉴定。

经过形态观察、死亡率、出芽率测定,选出形态整齐,大小适中,凝聚性好,高峰期出芽率达50%,芽细胞生长的菌株1号和2号并与保藏菌株3号和4号进行比较,具体方法如下:

死灭温度

热水浴保温法:在无菌条件下,用枪分别吸取待测样品0.5ml,分别接入四支5ml 的无菌麦汁试管中,再将四个样品分别于51°C、52°C、53°C、54°C水浴中处理10分钟,将处理后的样品分别取0.1ml于酵母培养基中,25°C条件下培养48小时,无发酵现象的最低温度即为酵母死灭温度。

凝聚性

将待测酵母样品洗涤并离心,准确称取1g置于装有硫酸钙缓冲液的离心管中,离心5分钟,

使酵母处于悬浮状态,静止20分钟后,再离心5分钟,使酵母悬浮,静止并计时10分钟时测定酵母沉淀的容量

外观发酵度

将待测样品于25°C条件下培养,每日轻轻摇动三角瓶,当培养4-5天时,用比重瓶测其外观浓度,计算其外观发酵度

外观发酵度=(发酵前麦汁浓度—发酵后外观糖度)/发酵前麦汁浓度×100%

【参考资料】

1、悉惠萍,中国果酒【M】,北京,轻工业出版社,1991

2、张翠英,优良果酒酵母的分离机发酵性能研究【D】,扬州,扬州大学,2006

3、黄利华;刘欣;张业辉;赵力超;;葡萄酒酿酒酵母菌种改良探讨[A];“科技创新与食品产业

可持续发展”学术研讨会暨2008年广东省食品学会年会论文集[C];2008年

4、熊子书,中国酿造酵母菌的研究,不同酒类酵母菌筛选与应用(上)【J】,酿酒科技,

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5、吴思方,孙灿,产脂条件的研究【J】,武汉工业学院学报,1996(1):62-21

6、李剑芳,张颉,发酵猕猴桃汁中香酵母的分离,鉴定及生长特性的研究【J】,食品科

学,2001,22(9):19-22

7、赵裕嗪主编应用微生物学,重庆:科技技术出版社重庆分社1986,13

8、张纪忠主编微生物分类学,上海,复旦大学出版社1990,384-389

9、乐静珠中国类酵母微生物学报1977,(2):89-94

10、巴尼特A佩恩R.W,亚罗D著,酵母菌的特征与鉴定手册,胡瑞卿译青

岛:青岛海洋出版社,1991,100-175