pBac 3xP3 EGFP和pBac A3 EGFP载体在转基因斜纹夜蛾中的表达研究
华南师范大学
本科学士学位毕业论文
题目：pBac 3xP3 EGFP和pBac A3 EGFP载体在转基因斜纹夜蛾中的表达研究
指导教师：李雪峰研究员
学生姓名：陈凤丛
学号：20072501226
院（系）：生命科学学院
专业：生物科学
毕业时间：2011月6月
目录
摘要.......................................................................................................................... I II ABSTRACT ................................................................................................................. I V 1. 绪论. (1)
1.1 本课题现国内外的研究概况 (1)
1.2 本实验研究目的与意义 (1)
2. 材料与方法 (2)
2.1 材料 (2)
2.1.1 实验材料 (2)
2.1.2 主要试剂 (2)
2.1.3 主要溶液配制 (2)
2.1.4 主要仪器 (2)
2.2 斜纹夜蛾的人工饲养 (2)
2.3 基因的显微注射 (2)
2.3.1 斜纹夜蛾卵的收集 (2)
2.3.2 卵的排列与固定 (3)
2.3.3 显微注射 (3)
2.3.4 显微注射后的处理 (3)
2.3.5 荧光筛选 (3)
2.4 常用分子技术 (4)
2.4.1 质粒DNA和基因组DNA的提取 (4)
2.4.2 目的基因的PCR扩增 (4)
2.4.3 琼脂糖凝胶电泳 (4)
3. 结果与分析 (5)
3.1 pBac3xP3 EGFP在斜纹夜蛾卵中的表达 (5)
3.2 pBac3xP3 EGFP在幼虫期的表达 (6)
3.3 pBac3xP3 EGFP在成虫中的表达 (6)
3.4 pBac3xP3 EGFP和pBacA3 EGFP转座体系的效率比较 (7)
3.5 pA3 EGFP斜纹夜蛾的分子检测 (7)
3.6 pBac3xP3 EGFP阳性幼虫的cDNA检测 (8)
4. 讨论 (11)
4.1 EGFP在斜纹夜蛾中可以正常表达 (11)
4.2 两种不同启动子的比较 (11)
4.3 难于获得阳性个体的原因 (11)
4.4 转座体系的选择 (12)
4.5 转基因斜纹夜蛾和家蚕的比较 (12)
4.6 外源基因的表达 (13)
4.7 转基因斜纹夜蛾的遗传嵌合性 (13)
4.8 总结 (13)
参考文献 (15)
致谢 (17)
摘要
本研究以肌动蛋白A3启动子与眼部和神经特异性3xP3启动子、增强性绿色荧光蛋白（EGFP）基因及SV40 多聚腺苷酸识别序列为元件，插入到piggyBac 中构建成pBacA3 EGFP 和pBac3xP3 EGFP转座载体，将其显微注射入斜纹夜蛾早期受精卵中，检测其是否表达。结果表明两种载体均能在蛾卵中表达，得到阳性个体。统计分析表明pBacA3 EGFP 载体在注射卵的荧光表达率和荧光卵孵化率上显著高于pBac3xP3 EGFP，其孵化幼虫中表达EGFP的比例也较后者高，表明pBacA3 EGFP更适合用于斜纹夜蛾的转座载体。斜纹夜蛾转基因载体的体外瞬时表达不但是成功进行斜纹夜蛾转基因所必需的第一步，而且其自身也可以应用于基因的功能研究，为斜纹夜蛾后基因组研究奠定了基础。
关键字：斜纹夜蛾，显微注射，pBacA3EGFP，pBac3xP3 EGFP，荧光表达.
ABSTRACT
In this study, actin A3 promoter and eye and nerve-specific 3xP3 promoter, enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene and the SV40 polyadenylation recognition sequence for the device, inserted into the piggyBac then construct pBacA3 EGFP and the pBac3xP3 EGFP transposon vector. They have been microinjected into the early fertilized eggs of S. litura to detect whether the expression. The results showed that the two carriers in the moth eggs can be expressed by positive individuals. Statistical analysis showed that the pBacA3 EGFP fluorescence of vector expression in the injected eggs hatching rate and fluorescence is significantly higher than pBac3xP3 EGFP, the hatched larvae in the proportion of EGFP expression than the latter high, that is more suitable for pBacA3 EGFP Spodoptera litura transposition vector. Litura in vitro gene transfer vector is not only a successful transient expression of transfected genes litura necessary first step, and its own can also be applied to study gene function, for the post-genome research litura basis.
Key Words：Litura, microinjection, pBac3xP3 EGFP, pBacA3 EGFP，fluorescence expression
1. 绪论
1.1 本课题现国内外的研究概况
转基因技术是将外源基因导人到生物基因组内使之稳定整合并能遗传给后代的技术，是生命科学领域中的一项重要研究手段，它在遗传和发育、基因表达与调控等研究领域都具有广阔的应用前景。昆虫转基因技术不仅可以通过使基因过量表达或功能缺失来研究基因功能[1-2]，也是开发昆虫生物反应器技术体系的关键所在[3]。
迄今为止，在昆虫中发现的转座子有P、Tc1、Pogo和FP、ermes、mi-nos、hobo、mariner、piggyBac等。其中，piggyBac转座子能在生物体染色体中准确地切出和转座，且具有较广泛的适用范围，故piggyBac转座子载体被广泛用于双翅目、鳞翅目、鞘翅目和膜翅目等众多非果蝇的昆虫转化研究，成为昆虫转基因研究的最常用的载体，故已成功地应用于地中海果蝇、黑腹果蝇和家蚕的转基因研究[4]。日本的研究人员将编码人类型Ⅲ前胶原蛋白基因连接到piggyBac转座子中，成功获得大量重组蛋白[5]。
国内目前利用piggyBac转座子开展昆虫转基因研究的报道较少，只有在家蚕转基因研究方面有一些进展，而其他昆虫的转基因研究相对滞后。有关斜纹夜蛾转基因研究，尚未见报道。
1.2 本实验研究目的与意义
斜纹夜蛾是一种世界性分布的农业害虫，在各大洲均有严重发生和为害的记录，造成蔬菜、棉花、烟草、甘薯、玉米等作物以及牧草、草坪草、绿肥作物等严重损失，给农业生产造成巨大经济损失或社会冲击（秦厚国，2007）[6]。鉴于斜纹夜蛾发生危害日趋严重，该虫的研究和防治引起了国内外农业昆虫学家和植保工作者的高度重视以及政府有关部门的广泛关注。
本实验以斜纹夜蛾为材料，通过显微注射的方法进行基因转移，利用鳞翅目来源的转座子piggyBac，运用两种不同的启动子——肌动蛋白A3启动子和眼部及神经特异性3xP3启动子，比较不同启动子的启动效率，选择最优方式，尝试建立立高效稳定的转基因斜纹夜蛾技术体系，为今后利用转基因技术研究斜纹夜蛾基因功能、探明发育过程基因调控机理等基础研究，并为利用转基因技术控制斜纹夜蛾繁殖与危害提供一定的理论依据和实践方法。
2. 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 实验材料
本实验昆虫为实验室条件下的人工饲养的斜纹夜蛾，种质来源于中山大学昆虫研究所。两种质粒piggybac（pA3EGFP与3xP3EGFP）和helper来源于华南师范大学生命科学学院319昆虫分子生物学实验室。
2.1.2 主要试剂
Tris饱和酚，甲醛，异丙醇，氯仿，质粒提取试剂盒（QIAGEN、上海生工），PCR扩增试剂盒（上海生工），Supercoli Marker（TAKARA）
2.1.3 主要溶液配制
注射显微缓冲液：5mM KOH，0.5mM NaH2PO4用0.1M NaOH调整至pH7.2后过滤除菌。
5×Tris-硼酸缓冲液（TBE）：54g Tris碱，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA （pH8.0）
2.1.4 主要仪器
本实验用主要仪器设备有：荧光倒置显微镜（Nikon）及显微操作仪、等电聚焦电泳槽（美国）、拉针仪（德国）、锻炉仪（MF-79）、磨针仪(EG-400)，酒精喷灯、体视解剖镜、电泳仪、普通光学显微镜，凝胶成像系统ImageQuant 300(GE Healthecare，美国)、高速离心机（飞鸽，中国）、超低温冰箱Thermo（Thermo Electron）等。
2.2 斜纹夜蛾的人工饲养
卵块消毒：收集卵块，放入浓度为5%的甲醛溶液中消毒5min，用无菌水漂洗，自然晾干后，放入培养盒中，待孵化。
幼虫饲养：为刚孵化的幼虫加入新鲜培养基，待幼虫长到三龄时，分盒饲养。待幼虫到预蛹期时，转入另一个约装有含水量约10%的沙土的塑料小盒中化蛹。
成虫（羽化-产卵）：当蛹的体色由红褐色渐变为黑褐色时，将蛹自沙内取出，放入内壁附有消毒过的纸的透明塑料盒中羽化；羽化之后，将雌雄蛾按比例放入新的塑料盒，每日更换纸张，用10%的蜂蜜饲养。观察记录雌虫产卵时间，根据实验要求，取出一定时间的卵块以备显微注射之用。
饲养条件：温度25±1℃，相对湿度70%-80%，光周期14 h：10 h(光：暗)。
2.3 基因的显微注射
2.3.1 斜纹夜蛾卵的收集
取羽化后的斜纹夜蛾，按雌雄1∶1 的比例将其放入透明塑料盒内，盒内滴入10%蜂蜜水及放置消毒过的糙纸，以备产卵。交配与产卵均在晚上进行，在
21：00-1：00期间，每个半个小时观察一次，记录产卵的日期和准确的产卵时间。取几个较大的且产卵时间已知的卵块，鉴定卵的健康程度，假定同一卵块的卵粒的发育是同步的，同一卵块作为一个独立处理。
2.3.2 卵的排列与固定
选取雌蛾产后一定时间内的健康卵块，用软毛刷轻轻地刷掉卵块表面的鳞毛，要求尽量刷干净。载玻片用酒精浸泡后，自然晾干，在玻片上固定卵的部位涂抹稀释10倍后的浆糊，在其未干之前，用软毛刷将卵块移动至浆糊处，并轻轻将其打散。在立式解剖镜下，用解剖针将卵粒分开，并排列整齐。
图2-2 排列固定后的卵与卵前后极示意图
A：排列在载玻片上的卵粒；B:卵粒侧面照（上端为前极、下端为后极）；C卵粒俯视
照（图上为前极、图下为后极）
2.3.3 显微注射
质粒在冷冻离心机上4℃10000 r/min离心5分钟，然后用特制的上样管将混合质粒溶液直接上样于拉制好的口径小于3μm的注射针注射管内。卵在载玻片上排列固定后就绪后，将载玻片放置在载物台上，调整焦距，在高倍放大下将聚焦面调节到载玻片上方约2个卵的直径。将注射针尖放到焦点上。施加一定压力，摆动注射针头，查看针尖附近形成的涌流，检查针孔是否堵塞。仔细调节千分尺，控制DNA溶液的流速达到合适的程度。将注射针尖插入到卵细胞质中，缓缓将DNA注射入卵中，直到插入口有少许液体溢出时，迅速拔出针尖完成注射。
2.3.4 显微注射后的处理
一张载玻片的注射尽量在40min内完成，注射后的卵置于外界不宜超过1h。将载玻片放在37%甲醛蒸汽中消毒5min中，取出后放在充分湿润、无菌的环境中12h，待到注射伤口完全愈合后，转移到温度25±1℃，相对湿度65%~75%环境中孵化培养3天。
2.3.5 荧光筛选
注射后的卵每24h在荧光镜下检测观察，在蓝光激发下，观察EGFP的激发
情况，筛选出发荧光的转基因阳性G0个体，每批注射处理为单位进行单独饲养。
2.4 常用分子技术
2.4.1 质粒DNA和基因组DNA的提取
实验用质粒DNA用TIANGEN质粒小提试剂盒提取，阳性个体的基因组DNA用TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取，具体操作步骤参见试剂盒说明。
2.4.2 目的基因的PCR扩增
使用Prmer 5根据EGFP碱基序列设计特异性引物，送上海生工生物技术有限公司合成。
正向引物P1为：5’-GTTCTCGTTGGGGTCTTTGCT-3’
反向引物P2为：5’-TCACAAGTTCAGCGTGTCCG-3’
实验用20μL PCR反应体系为:
2X PCR mix10 μL
模板DNA 1~5 μL
引物1 0.6 μL
引物20.6 μL
ddH2O 8.8 μL
PCR反应的条件按照具体的情况确定。一般按如下条件进行:
94℃预变性3min，94℃变性45sec，52℃复性45sec，72℃延伸60sec，
35个循环，72℃延伸10min
2.4.3 琼脂糖凝胶电泳
根据预分离的DNA片段大小，用0.5×TBE配制适当浓度的琼脂糖凝胶，在微型电泳槽的制胶板上制备凝胶。
凝固后，将凝胶放入电泳槽中。取适量样品与6×上样缓冲液混合后上样。
电泳缓冲液为0.5×TBE，电压为50~100V，电泳后于300nm紫外透射仪检测。
3. 结果与分析
3.1 EGFP在斜纹夜蛾卵中的表达
用相同的浓度的pBac和helper按1:1的比例混合后，显微注射后，每隔24h 观察一次，注射后48h，卵正常发育，用荧光显微镜观察，在100倍镜下能观察到部分发绿色荧光的卵(图3-1A)。从图中可以看到，斜纹夜蛾的胚胎在蓝色荧光下本身可以发出微弱的黄光；而注入了pBac EGFP之后，在胚胎中可以发很强的绿光，而且在整个卵中的荧光分布并不是均匀的（图3-1B）。甚至在此时可以看到其胚胎已经开始有了虫体的形状了，呈现―U‖型的绿色荧光（如图3-1C-E）。
继续放大荧光胚胎的倍数，绿色荧光的出现开始区域化了，在―U‖型的虫体中，有两处很明显明显亮于其他地方的绿色荧光表达处，初步判断为眼部以及幼虫的中间部分，可能会中肠，具体的表达部位需要以后做进一步的实验验证。
图3-1注射piggyBac后EGFP在部分斜纹夜蛾卵中的表达A：注射24h后的胚胎；B、C：注射48h后的胚胎；
D、E：注射48h后渐渐发育成“U”的胚胎
B
3.2 EGFP在幼虫期的表达
将注射48h后的斜纹夜蛾绿色荧光胚胎记录下来，同时扎破没有荧光出现的胚胎之后，放在恒温培养箱中，96h后待其孵化。在荧光显微镜下观察，发现：并不是所有存留下来的胚胎都可以孵化成幼虫，可以真正孵化出幼虫所占的比例大约为113/377=29.97%（见表1），而且卵中孵化出来的幼虫，只是很少数的个体可以进一步观察到绿色荧光，说明经过显微注射处理会对胚胎产生一定不良的影响。对荧光幼虫进一步观察，发现荧光出现的部位也不是在整个幼虫个体中表达，只是存在某些特定的部位（如图3-2），主要集中在头胸部，在尾部也可以观察到一点。说明EGFP的表达在幼虫期和在胚胎后期观察到的大致相同。
图3-2注射piggyBac后EGFP在部分斜纹夜蛾幼虫中的表达
3.3 EGFP在成虫中的表达
在筛选出来的G0转基因阳性个体羽化成蛾后，在蓝光下观察蛾的复眼。发现转基因蛾表达EGFP，复眼出现绿色荧光，而对照组蛾复眼则未观察到绿色荧光的表达。表明本实验利用piggyBac转座子已经成功获得了转基因斜纹夜蛾成虫。
图3-3 EGFP在G0转基因蛾中表达
A,B：转基因斜纹夜蛾C,D：对照
3.4 pBac3xP3 EGFP和pBacA3 EGFP转座体系的效率比较
为了对比两种特异性启动子注射后的荧光表达率，选取产后4h内的卵块，在同期进行两种显微注射后，注射了pBac3xp3 EGFP的卵有1787颗，荧光卵数为377颗，占注射卵的21.1%；荧光卵孵化出113条幼虫，孵化率为30.0%，其中仅2条幼虫表达EGFP荧光，占孵化幼虫的1.7%；2条两条荧光虫只有一条发育至蛹，羽化成蛾，说明转座效率很低。
注射了pBacA3 EGFP的卵有1605颗，观察到637颗荧光卵，占注射卵的39.7%；荧光卵孵化出392条幼虫，孵化率为61.5%其中有10条幼虫表达EGFP 荧光，占孵化幼虫的2.6%；10条幼虫全部发育到羽化成蛾（见表1）。统计分析显示pBacA3 EGFP在注射卵中的荧光表达率和荧光卵的孵化率显著高于pBac3xP3 EGFP，表明pBacA3 EGFP更适合作为斜纹夜蛾转基因载体。
表1 pBac3xP3 EGFP和pBacA3 EGFP在注射后情况表
注射卵数
荧光卵数
(%)
孵化幼虫数
(%)
荧光幼虫数
(%)
pBac3xp3 EGFP1787
377
(21.1%)a
113
(30.0%)a
2
(1.7%)
pBacA3 EGFP1605
637
(39.7%)b
392
(61.5%)b
10
(2.6%)
注：同一列中上标不同表示差异显著，P<0.05。
3.5 pBacA3 EGFP斜纹夜蛾的分子检测
由于饲养过程中的环境和气候影响，最终只在G0代获得10条荧光虫斜纹
夜蛾。为了检测piggyBac转座子是否已稳定插人到斜纹夜蛾基因组，将孵化出来的A3荧光阳性虫单独饲养至4或5龄，提取其基因组DNA，以EGFP为引物进行PCR检测，但是电泳结果，显示完全没有条带（如图3-4泳道3）。
再以actin为引物条件下进行PCR检测，可得到图谱如下图。因为actin蛋白在真核生物中高度保守，是生物体组织及正常生命活动不可或缺的重要组成成分。可以使用来检测在提取基因组DNA时是否有将阳性虫的基因组提取出来。PCR电泳结果显示了在第二泳道（即A3荧光虫以actin为引物）有特异性条带的出现（大约为510bp），说明本身提取的基因组DNA并没有问题。而在第四泳道同样有特异性条带出现，且在700条带偏上一点，与本实验室所涉及的EGFP （710bp）的大小相似，说明了注射进去的质粒也不存在问题。
图3-4 PCR鉴定转基因斜纹夜蛾
泳道1：marker 泳道2：A3荧光虫actin
泳道3：A3荧光虫基因组DNA 泳道4：A3质粒EGFP
3.6 pBac3xP3 EGFP阳性幼虫的cDNA检测
由于一直无法得到较多pBac3xP3 EGFP阳性的成年个体，无法进行相关的基因组DNA提取并且进行鉴定。而且只能在孵化幼虫得到表达，所以直接将孵化的荧光幼虫进行RNA的提取，反转录得到cDNA，再以EGFP的引物进行PCR，得到结果如下：G0代荧光卵cDNA 1x和G0代荧光卵cDNA 0.1x都可以产生特异性条带，大约在700bp偏上，与本实验室所涉及的EGFP（710bp）的大小相似，说明在G0代卵中确实有了EGFP的表达，产生了绿色荧光蛋白。观察第四和第五泳道，分别为A3的G1代荧光虫基因组DNA 1x和稀释为0.1x的基因组DNA，同样的条件下，并没有产生特异性条带。说明其基因载体并没有遗传到下一代，无法检测出来。而第六泳道以A3质粒为对照的情况下，可以很明显的看到有很亮的特异性条带，且也是接近710bp左右，再一次验证了注入的显微质
粒是没有问题的。
图3-5 pBac3xP3 EGFP阳性个体的cDNA检测
泳道1:1200bp marker，泳道2：G0代的荧光卵cDNA 1x，泳道3：G0代的荧光卵cDNA 0.1x，泳道4：A3的G1代荧光虫基因组DNA 1x，泳道5：A3的G1代荧光虫基因组DNA 0.1x，泳道6：A3质粒.
另外一方面，由于在昆虫的分子生物学研究中，常常用到一些标志基因来检测组织cDNA模板的质量。其中目前最常用的一个标志基因是肌动蛋白基因3（actin3），属于ARP家族actin亚家族[8]。actin蛋白在真核生物中高度保守，是生物体组织及正常生命活动不可或缺的重要组成成分[9]。所以在以EGFP为目的条带的同时，我们也进行了以actin3为目的条带的PCR检测，结果电泳结果如图3-6。由图中可以看到G0代的荧光卵和荧光幼虫反转录得到的cDNA在以上述的PCR体系中，均可以扩增出很明显的特异性条带（泳道2～5），且条带大小介于500-700bp之间，偏靠近500bp，与Actin3大小相符，说明在阳性虫的不同时期都可以表达，并且变化不大。
图3-6 pBac3xP3 EGFP阳性个体的cDNA检测
泳道1:1200bp marker 泳道2: G0代胚胎cDNA 泳道3: 0.1xG0代胚胎cDNA 泳道4: G0代幼虫cDNA 泳道5：0.1xG0代幼虫cDNA
注：以Actin为引物
4. 讨论与总结
4.1 EGFP在斜纹夜蛾中可以正常表达
本实验以眼部和神经特异性3xP3启动子以及肌动蛋白A3 启动子、增强性绿色荧光蛋白基因及SV40的多聚腺苷酸识别序列为元件，将其插入到piggyBac 转座载体中，构建了斜纹夜蛾的pBacA3 EGFP和pBac3xP3 EGFP转基因载体。由于家蚕肌动蛋白A3 的启动子是一个强启动子，可以高效地对下游的外源基因进行转录表达，而3xP3启动子是一个有特异性启动表达的启动子，将这两种启动子通过注射到胚盘形成前期的蛾卵中，在胚胎发育的第2天检测到了强烈的绿色荧光，表明所构建的载体均能够正确表达EGFP 基因[10]。
4.2 两种不同启动子的比较
本研究采用显微注射法将转基因载体pBac3xp3 EGFP及辅助质粒p3xP3H导入斜纹夜蛾的早期胚胎，在G0代获得转基因斜纹夜蛾的阳性幼虫个体。同时也进行了pBacA3 EGFP的的显微注射对照操作。
本实验分别以斜纹夜蛾A3为启动子以及3xp3启动子，EGFP为外源基因，通过对转基因斜纹夜蛾不同发育时期的荧光观察，观察到了两种不同启动子启动下游基因的表达情况。结果表明，pBacA3 EGFP基因在斜纹夜蛾的所有发育时期都有表达，这与目前报道的A3作为一个广谱的启动子表达的A3肌动蛋白在所有组织和发育阶段均有表达相一致；但在表达荧光的后代中未能扩增出EGFP 特异性片段。外源基因与宿主DNA的整合是一个极为复杂的过程，尤其是真核生物转基因，至今这一过程的具体机制尚未阐明。一般说来，外源基因导入真核细胞受体后有多种去向：随即降解丢失，滞留于细胞质中或有效地进人核内。进人核内也面临降解丢失的可能，也有游离存在于核内和整合于宿主染色体内（又包括随机整合及有效整合于特定位置）的可能。若存在外源DNA被吸收并纳人自身系统的某种规律，则无论何种方法，转入阳性结果中有效整合频率均应是特定的。否则整合可能是一种完全随机的生物学过程，整合与否可通过PCR扩增，Southem杂交来检测[11]。造成本实验未能扩增出EGFP特异性片段的原因，可能是由于G0代作为一个嵌合体，转入的pBacA3 EGFP对于整个斜纹夜蛾的基因组来说太小，且在提取的过程中浓度可能太低，造成无法很好的扩增出来的结果。或者是损失性表达，具体的研究有待进一步的验证。同样的，pBac3xP3 EGFP 的阳性个体实在太少了，不能起到更好的说明效果。
4.3 难于获得阳性个体的原因
成功获得转基因斜纹夜蛾个体的第一个关键，是将外源DNA 正确导入到斜纹夜蛾早期胚胎中，并尽量接近处于胚胎中部的受精核。这是因为显微注射会对
蛾卵造成较大的机械损伤，加上外来液体的导入会影响胚胎的正常发育，使得经注射后的蛾卵成活率低。作者在转基因注射实验中发现，注射后的蛾卵容易在胚胎发育后期，孵化时也多因不能咬破卵壳而窒息死亡。其次，经注射后孵化的幼虫体质也明显的比正常的弱，抵抗力低，易感病，不容易发育到产卵交配阶段。尽管首例利用piggyBac 载体获得转基因昆虫的报道已经过去快4 年了，但目前世界上仍然只有少数几个实验室能够成功进行转基因昆虫操作。究其主要原因，就在于转基因蛾注射成活率和正常生长发育率低。因而通过显微注射进行转基因斜纹夜蛾的研究需要比较娴熟的显微注射操作技术，尽可能地减少注射时蛾卵内容物的损失，是提高注射蛾卵孵化率及成活率的关键。本实验中，部分实验时注射的蛾卵约60%以上的都观察到了荧光的表达，表明外源DNA 的导入和胚胎的早期发育均正常进行。由于EGFP有一个488 nm 的激发峰值，因此可以被较多的无害的蓝光激发，而且其荧光的强度比野生型GFP高35倍左右，适合于快速无损伤检测。实验还发现，经短暂紫外线照射，并没有对后续胚胎发育造成影响。而选择这些能够检测到荧光的个体作为候选的转基因阳性个体，也将大大提高最终的转基因成功率，缩短转基因周期。本文报道的外源EGFP基因快速表达体系，不但是成功进行斜纹夜蛾转基因所必需的第一步，而且其自身也可以应用于基因的功能研究，例如将A3 启动子替换为待研究的基因调控序列，即可非常方便地在时间和空间上定位该基因的表达，而用待研究的基因编码序列替换EGFP编码区或者插入到其上游或下游，又可研究该基因对胚胎发育进程的影响[12]。
4.4 转座体系的选择
作为目前在昆虫转基因中应该最广泛的piggyBac转座子，已经被证明可在5个目(鳞翅目、双翅目、膜翅目、鞘翅目和直翅目)的20多种昆虫中转座，其中研究比较充分的家蚕的转基因技术。比较基因组分析表明，在多种生物的基因组序列中具有piggyBac-like元件，暗示piggyBac转座子元件在多种生物体内具有转座子活性。近年来，研究发现在鳞翅目的多种昆虫中，如斜纹夜蛾、小地老虎、银纹夜蛾等成功检测到了内源性的piggyBac转座子。序列比对结果显示，斜纹夜蛾中的类似因子piggyBac与IFP2相似性高达91%，属于IFP2高度相似类序列[13]。这些都暗示着piggyBac在斜纹夜蛾体内可能具有转座活性。本实验结果很好地证明了这一点，但是对于不同的启动子的效率是不同的。针对实验中的两种的启动子的质粒，在本实验室中pBacA3 EGFP的技术是相对成熟的。
4.5 转基因斜纹夜蛾和家蚕的比较
最早获得转基因家蚕，使用的是pBacA3 EGFP，也验证了pBacA3 EGFP这个转作载体在G1代幼虫时期的筛选中很有用，但是必须饲养大量家蚕，这个启动子的最大缺陷就是消耗时间。在Bm—Actin3 EGFP标注下，G0代嵌合体幼虫
可观察到EGFP表达，并且在后代的转基因幼虫和G0的消黄细胞中也可观察到，但在G0胚胎组织或者后代的卵中却看不到。因此，在A3启动子下，在G1代幼虫之前是不可能筛选到转基因个体。但是在斜纹夜蛾中的G0代的卵中可以观察到EGFP，是可以作为筛选凭证的[14]。
另外由于3xP3-EGFP的标记已被证明是一个合适的转基因昆虫的普遍标记，其对家蚕生殖细胞转化为胚胎阶段筛选的使用是非常有效的，利用piggyBac转衍生载体pBac 3xP3 EGFP，从胚胎发育第五天中枢和外周神经系统中产生EGFP 绿色荧光蛋白，它在整个幼虫阶段的得到高水平的表达，也是在复眼和蛹的神经组织以及飞蛾复眼存在[15]。本实验中使用了pBac3xP3 EGFP，确实在筛选过程中可以大致判断在某些组织表达，基因组DNA提取也可以分组织来进行，可以提高提取效率，但是获得阳性个体的过程却是难于A3的。所以，初步判定在斜纹夜蛾的转基因技术中，使用pBacA3 EGFP的转座体系是比较好的选择。
4.6 外源基因的表达
外源基因的表达水平对其在转基因斜纹夜蛾体内发挥作用至关重要。有许多因素可能会影响表达水平，譬如启动子、编码序列、拷贝数和插入位置。外源基因在宿主体内能否表达取决于：（l）空间上是否处于可表达体系中即位于启动子下游；（2）时间上是否处于表达活性状态，同时要保证外源基因完整有表达的潜能[16]。
在目前的昆虫转基因研究中，大都以增强型绿色荧光蛋白EGFP作为阳性个体的筛选标记。由于荧光蛋白的表达受其启动子的启动能力、插入片段在宿主基因组中的位置和拷贝数、宿主的密码子偏性等因素的影响，从而影响着转基因蚕的筛选效率。从本研究结果来看，选择肌动蛋白A3启动子启动具有更长激发波长的EGFP标记的筛选效果较为理想。但是，也有绝大部分的研究证明，以DsRed 有筛选标记，也可以得到较好的结果[17-18]。因此，下一步的研究可以探讨一下EGFP和DsRed两种标记基因在斜纹夜蛾中的筛选效果。但由于很难避免筛选过程中紫外线对胚胎的伤害，因此，如能选择在胚胎早期便可肉眼观察的表型突变基因来替代荧光标记基因，有望获得更好的筛选效果和效率。
4.7 转基因斜纹夜蛾的遗传嵌合性
斜纹夜蛾的受精卵卵裂开始于产卵后约3 h，显微注射如果是在受精卵卵裂之前完成，注射的外源基因整合到核中基因组未复制的部位，可与宿主基因一同复制，随宿主核分裂进入子核[19-20]。由于整合时核尚未分裂，那么受精卵分裂的每一个子核都能获得相同拷贝的外源基因。由此得到的转基因斜纹夜蛾应该都为纯合体。一般来说，对哺乳动物进行原核注射时，产生首代纯合体的概率会大一些；对于转基因昆虫理论上也是可行的，只要卵裂之前将质粒DNA注入卵内，
并且转座子携带的外源基因在受精卵卵裂前整合进其基因组中，就可以产生纯合体。但实践操作中，要在转基因昆虫中获得首代纯合体，却非常困难。一、由于昆虫卵壳的存在和细胞质的不透明，无法看见内部的原核，很难精确的把外源DNA注射到核中，转基因昆虫采用的基本上是细胞质注射。注射时，只能根据大致判断，把转座子质粒注射在核的附近，利用转座子的转座和插入功能，携带外源基因整合进入基因组中，当雌雄原核融合形成合子后，受精卵进入有丝分裂，此时难保证在每个细胞的固定位点整合。二、昆虫卵卵裂速度快，而昆虫产卵时间较长，很难准确判断卵真正何时受精。昆虫卵早期分裂为核分裂质不分裂，注射时难保证刚好处于原核期，也许已经发生几次分裂，此时无法得到纯合体后代。
本研究中，阳性转基因个体均为产卵后3 h以及3 h之后的注射操作后所获得。因此，阳性转基因个体更可能为嵌合性。纯合体转基因个体的获得在转基因体系中并非关键。基因能否整合到生殖细胞才是获得稳定遗传的转基因斜纹夜蛾的关键。除了体细胞的嵌合现象外，生殖细胞同样也有嵌合现象，这就使得首代能检测到表达EGFP的转基因斜纹夜蛾，其转基因也有可能不遗传或者仅以很低的频率遗传。这就需要建立和维持良好的转基因谱系程序。
其他影响建立转基因谱系的问题也不容忽视，转基因昆虫可能存在与转基因的整合或功能有关，生殖力差，表型不理想等问题，因此，为弥补昆虫中高比例的嵌合性等问题，要注射大量的卵，以此来获得大量首代转基因昆虫及其对子代进行筛选。
4.8 总结
（1）不同的启动子连接pigBac转座子构建的显微注射载体在斜纹夜蛾的胚胎到幼虫到蛾期都能够表达，说明pBacA3 EGFP 和pBac3xP3 EGFP这两种质粒的构建是成功的，可以表达EGFP基因。
（2）pBacA3 EGFP 载体在注射卵的荧光表达率和荧光卵孵化率上显著高于pBac3xP3 EGFP，其孵化幼虫中表达EGFP的比例也较后者高，表明pBacA3 EGFP 更适合用于斜纹夜蛾的转座载体。
（3）在本实验中，获得的都是嵌合体，并不是稳定遗传的转基因个体，所以在检测方面还是存在很大的问题。
（4）相对家蚕的转基因技术来说，斜纹夜蛾的转基因技术还不是很成熟，必须进一步的加强研究。
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