砂柱微生物堵塞过程及机理分析
水
利学报SHUILI XUEBAO 2014年6月
文章编号：0559-9350（2014）06-0749-07收稿日期：2013-11-12
基金项目：国家自然科学基金资助项目（41172209）；“十二五”国家科技计划课题（2012BAB12B03）；国家公益性行业科技专项
（201301090）
作者简介：夏璐（1985-），山东淄博人，博士，主要从事水资源利用与水污染控制。E-mail ：xialu5272@https://www.wendangku.net/doc/536033911.html,
通讯作者：郑西来（1959-），河南洛阳人，教授，博士生导师，主要从事地下水污染过程与修复技术和水资源利用与保护。
E-mail ：zhxilai@https://www.wendangku.net/doc/536033911.html,
第45卷第6期
砂柱微生物堵塞过程及机理分析
夏璐1，郑西来1，段玉环1，彭涛2
（1.中国海洋大学海洋环境与生态教育部重点实验室，山东青岛
266100；
2.建设综合勘察研究设计院有限公司，北京100007）摘要：采集青岛市大沽河下游潜水含水层的砂样为代表性含水介质，测定样品的组成和性质。设计渗流试验，考察介质不同渗流段渗透性的动态变化。利用PCR 和DGGE 技术鉴定了造成含水介质堵塞的微生物优势菌群，分析了不同渗流段微生物对营养物和氧的利用情况，探讨了含水介质微生物堵塞过程及机理。研究结果表明，生物堵塞程度随着渗流距离的增加而减缓，含水介质的渗透性呈现明显的非均质性。微生物经过短暂的适应期，快速进入生长、繁殖阶段，含水介质微生物堵塞迅速形成；造成含水介质微生物堵塞的优势菌群为甲基杆菌属（Methylobacterium ）、紫色杆菌属（Janthinobacterium ）、耶尔森菌属（Yersinia ）、葡萄球菌属（Staphylococcus ）、食酸菌属（Acidovorax ）。其中，甲基杆菌属、紫色杆菌属、葡萄球菌属和食酸菌属均为产黏细菌（Myxobacterium ）；含水介质中存在微生物的繁衍、代谢等生命活动。进水营养液为好氧微生物的生长、繁殖提供了充足的氧气，好氧细菌生长旺盛，并大量分泌胞外聚合物，导致进水段微生物堵塞程度最严重。
关键词：微生物堵塞；含水介质；PCR ；DGGE ；渗透系数
中图分类号：X171文献识别码：A doi ：10.13243/https://www.wendangku.net/doc/536033911.html,ki.slxb.2014.06.0151研究背景
随着水资源的日益紧缺，地下水作为重要的供水水源被过度开采，导致地面沉降、塌陷、地裂缝、咸水入侵等重大环境地质问题相继出现。采用地下水人工回灌可提高水资源利用率，防止地下水枯竭，补充地下水源，从而缓解由地下水过度开采所造成的环境地质问题。但在回灌过程中，补给水源中的微生物在含水层介质中附着、生长，并分泌大量的胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances ，EPS ）［1-2］。EPS 在含水介质的孔隙中形成生物膜，导致含水层的渗透性大大降低
［3-4］，从而严重影响着人工回灌的效率、维护成本以及设备的使用寿命［5］
。国内外一些学者致力于含水介质微生物堵塞的过程及成因研究。Seki 等［6］和Thullner 等［7］认为，
介质的生物堵塞是由微生物本身及其代谢产物（EPS ）的积累引起的。Thullner 比较了分散微菌落和生物膜对介质渗透性的影响，发现微菌落对生物堵塞的影响更大［7］。Philippe Vandevivere 等［8］的渗流试验表明，细菌胞外聚合物可以明显降低含水介质的渗透性。黄修东等［9］采用砂柱模拟井灌过程的堵塞过程，认为砂柱内存在微生物的生长、繁殖过程。Engesgaard 等［10］研究发现，生物堵塞过程分为3个阶段：（1）微生物在介质孔喉处生长，形成微菌落，导致水力传导系数下降；（2）溶质的扩散通量增加，突破曲线出现明显的拖尾现象；（3）生物堵塞发生，优势流通过大孔隙迁移。随后，Enges?gaard 等［11］提出，阶段（1）对于溶质的运移行为没有明显的改变；阶段（2）在砂柱的进水端有微生物量的大量积累，导致水动力弥散系数降低；阶段（3）促使微菌落在砂柱内部生长，改变了溶质在固液相—
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之间的质量传递方式。总的来讲，现有的研究还没有深入地从分子生物学的角度鉴定造成堵塞的优势微生物菌群，并且对于堵塞过程中不同渗流段非均质性的研究也比较少。
本文采用渗流模拟试验，测定含水介质不同渗流段渗透性的动态变化。采用Polymerase chain re?action （PCR ）和Denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE ）分子生物学技术鉴定了造成堵塞的微生物优势菌群，并分析了不同渗流段微生物对营养物和氧的利用情况，探讨了含水介质微生物堵塞过程
及机理，该研究可为含水层生物堵塞的防治提供科学依据。2
材料与方法2.1试验装置与材料试验装置分为5部分：渗流柱、蠕
动泵、进水槽、出水槽和测压板。渗流柱由有机玻璃制
成，高22cm ，内径5cm 。距渗流柱底部进水口0、2、4、
6、12、18cm 处分别设取样管，在另一侧同等高度处设测压管，与测压板相连接。蠕动泵将进水槽中的营养液以恒
定流速由底部进水口泵入，流经柱内含水介质后，从上部
出水口排出。由测压板可观测不同位置处的水位，某渗流
段发生堵塞后将使该段含水介质渗透性降低，可以清晰地
通过测压板水头变化进行判断（见图1）。取青岛市大沽河下游潜水含水层砂样为代表性含水介质，样品的基本物理性质见表1。砂样粒径分布曲线如图2所示，该砂样平均粒径D 50为0.539mm ，根据土粒径的分类，属于粗砂。本文采用实验室配水的方法，在蒸馏水中分别加入葡萄糖、氯化铵（NH 4Cl ）、磷酸氢二钾（K 2HPO 4）作微生物生长的碳、氮和磷源，营养液基本水质参数见表2。接种物取自大沽河下游贾疃坝河水及底泥的混合物。取样后，将混合物充分曝气2h ，静置30min ，取上清液为渗流试验的接种水。
图1
试验装置示意图
表1砂样基本物理性质主要性质
砂样平均粒径/mm 0.539有机质含量/%
0.31
天然含水率/%
7.87容重/（g/cm 3）
1.63比重
2.65孔隙率/%38.5水质参数数值温度/℃20pH
8.1溶解氧/（mg/L ）10.1COD Cr /（mg/L ）50
总磷/（mg/L ）0.5总氮/（mg/L ）1.5细菌总数/（个/L ）
＜100表2
营养液基本水质参数注：表中总磷、总氮含量分别以P 、N 计。图2
供试砂样粒径分布曲线
2.2
试验方法2.2.1渗流试验将风干、均匀的砂样分层装入砂柱，每次称取一定质量的砂样，等容重将其压
实，逐步完成装柱过程；用蠕动泵以1mL/min 流速从渗流柱底部缓慢通入灭菌自来水饱和砂柱；持续饱水24h ，以保证柱内没有气泡，计算渗流柱的初始渗透系数；待初始渗透系数稳定后，用蠕动泵以5mL/min 流速从底部泵入接种水，渗流6h ，关闭进、出水阀，保证菌种在含水介质上充分附着；打开蠕动泵，以5mL/min 泵入配制的营养液，开始渗流试验。渗透系数由式（1）求得：k =4Q ?L πD 2?Δh
（1）式中：Q 为渗流量，mL/s ；D 为渗流柱的内径，cm ；L 和Δh 分别为任意两测压管之间的距离和水头差，cm 。—
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2.2.2造成堵塞的主要微生物菌种鉴定（1）基因组总DNA 的提取。渗流试验结束后，取0.25g 附着有微生物的砂样，采用苯酚抽提法［12］提取微生物基因组总DNA ，置于-20℃保存。
（2）基因组DNA 的PCR 扩增。以纯化后的基因组DNA 为模板，采用特异性引物BA101F ：5′-TG?GCGGACGGGTGAGTAA-3′和BA534R ：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′［13］，前段引物加GC 发卡结构：5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGC-3′
［14］，进行扩增。PCR 反应采用touchdown 降落PCR 策略［15］。
（3）PCR 反应产物的DGGE 分析及克隆测序。利用Bio-Rad 公司Dcode TM 的基因突变检测系统对PCR 反应产物进行分析。电泳完毕后，用溴化乙锭对凝胶进行染色。染色后，用凝胶成像分析系统分析，观察每个样品的电泳条带并拍照。
在紫外照射下，切胶回收目标条带，以回收DNA 为模板按原扩增条件再次扩增，所得PCR 产物克隆后送上海生工生物技术有限公司测序。将所得序列提交到GeneBank 登记，并在GeneBank 数据库中用BLAST 进行检索和同源性比较。
2.2.3溶解氧和COD Cr 测定定期从渗流柱取样管取样，测定水中溶解氧和COD Cr 浓度，考察不同
渗流段微生物对营养物和氧的利用情况。溶解氧采用便携式溶解氧仪法，COD Cr 采用快速密闭催化消解法测定［16］。3
结果与讨论3.1含水介质非均质性研究在渗流柱内模拟生物堵塞的
形成过程，连续测定进水段（0~6cm ）、中部（6~12cm ）、
出水段（12~18cm ）的渗透系数，如图3所示。
由图3可知，在连续渗流216h 内，柱内不同渗流段的
渗透系数均呈下降趋势。其中，砂柱进水段（0~6cm ）渗透
系数从0.16cm/s 降至0.03cm/s ，下降幅度为81.25%；中
部（6~12cm ）渗透系数从0.17cm/s 降至0.06cm/s ，降幅为
64.71%；出水段（12~18cm ）渗透系数从0.17cm/s 降至
0.09cm/s ，降幅为47.06%。由此可见，在渗流过程中，含水介质的生物堵塞程度随着渗透距离增加而减缓，含水介
质的渗透性呈现明显的非均质性。另外，从时间上看，在渗流试验初始阶段（0~24h ），含水介质的渗透系数下降缓慢；渗流从24h 到144h ，渗透系数的降低速率最大（降幅74.18%）；渗流从144h 到216h ，介质的渗透系数下降趋缓。这主要因为通入营养液初期，微生物处于生长适应期，细胞体生长缓慢。随着渗流时间的继续，微生物已适应环境的变化，且水中营养物质及含水介质孔隙中的氧气为微生物生长和繁殖提供了有利条件，使其进入对数生长期，微生物会大量分泌EPS ，促使微生物之间形成团聚体，并黏附于砂粒表面，从而堵塞孔隙通道，导致介质的渗透性快速降低。渗流144h 后，生物集聚已使孔隙严重堵塞，渗流量明显降低，渗透系数下降趋缓。由此表明，微生物经过短暂的适应期，快速进入生长、繁殖阶段，含水介质微生物堵塞迅速形成。
3.2生物堵塞机理分析
3.2.1造成堵塞的微生物优势菌群渗流216h 后，砂柱进水段（0~6cm ）渗透系数降低为初始值的10%，认为已完全发生生物堵塞［17］。拆除砂柱，提取砂样上的附着微生物DNA ，进行PCR 扩增，并对扩增产物进行DGGE 分析，结果如图4所示。X 1、X 2为平行样。
根据DGGE 能分离长度相同而序列不同DNA 的原理，每一个条带大致与群落中的一个优势菌群或操作分类单位（Operational taxonomic unit ，OTU ）相对应，条带数越多说明生物多样性越丰富，条带
图3
砂柱渗透系数随时间变化规律
—
—751
染色后的荧光强度则反映该细菌的丰富度，条带信号越亮，表示该种属
的数量越多。由图4可见，从微生物样品中共分离得到11个主要条带。
其中，条带3、5、7、9亮度较强，为群落中的优势菌群。
在DGGE 分离后的条带中，选取其中11个荧光强度较亮的主条带进
行切胶回收、测序。从DGGE 图谱中主条带的测序结果可以确定条带所
代表的菌群分类地位，11条优势条带的基因片段序列与GeneBank 中细菌
序列相似性如表3所示，从这些DGGE 带谱所代表的微生物种类可以确定
导致含水介质生物堵塞的优势菌种。
根据表3序列比对结果，除Band 2、5、10所代表的菌株外，其余8
株细菌与数据库中的已知细菌同源性超过98%，可以认为是同一种，分
别属于甲基杆菌属（Methylobacterium ）、紫色杆菌属（Janthinobacterium ）、
耶尔森菌属（Yersinia ）、葡萄球菌属（Staphylococcus ）、食酸菌属（Acidovo ?
rax ）。此外，Band 9所代表微生物与数据库中目前未获得纯培养的未知名
的菌株之间也具有99%的相似性。其中，甲基杆菌属（Methylobacteri ?
um ）、紫色杆菌属（Janthinobacterium ）、葡萄球菌属（Staphylococcus ）、食酸
菌属（Acidovorax ）均为产黏性胞外聚合物的菌群
［18］。多孔介质微生物堵塞机理主要包括4个方面：（1）微生物引起的矿物沉淀可以导致介质水力传导系数的降低
［19］；（2）微生物细胞本身在多孔介质中的积累，导致孔隙堵塞
［20-21］；（3）微生物在繁殖、代谢过程中产生的
甲烷等气体［22-24］；（4）微生物在代谢过程中向细胞外分泌的黏性大分子胞外聚合物，使得多孔介质有效孔隙度降低，进而导致堵塞的发生
［25］。其中，机理（4）是影响多孔介质
堵塞程度的最主要因素［8］。由此证实，导致研究区含水层微生物堵塞的主要原因为微生物分泌的胞外聚合物附着在砂粒表面，导致含水介质的渗透性降低。
图4砂样上堵塞微生物的变性
梯度凝胶电泳分离图谱表3
DGGE 优势条带的基因片段序列的比对结果3.2.2微生物对营养物和氧的利用溶解氧（DO ）浓度的高低可间接反映微生物的活性［25］，同时COD Cr 浓度的变化可反映微生物对营养物质的利用情况。通过对不同渗流段溶解氧与COD Cr 浓度的测定，可以探讨不同渗流段微生物降解的动态变化过程。DO 、COD Cr 随时间变化规律如图5与图6所示。
由图5可知，随渗流试验的进行，不同渗流段DO 含量均呈现降低趋势。其中，靠近进水端（6cm ）DO 含量从10.05mg/L 降低至8.40mg/L ；中部（12cm ）溶解氧浓度从9.60mg/L 降至6.01mg/L ；近出水端（18cm ）DO 含量从9.40mg/L 降至5.16mg/L 。由此表明，含水介质中存在微生物的繁衍、代谢等生命活动。此外，砂柱进水段（0~6cm ）溶解氧含量最高，维持在8.40mg/L 以上，为好氧细菌的生长、繁殖提供了充足的氧气，好氧细菌生长旺盛，并大量分泌胞外聚合物，导致进水段微生物堵塞—
—752
程度最严重。
另外，从渗流时间看，在初始阶段（0~24h ）砂柱内DO 含量降低缓慢；渗流从24h 到144h ，DO 降低速率最大；144h 到216h ，砂柱内DO 含量下降趋缓，与渗透系数的下降趋势一致。分析原因，通入营养液初期，微生物处于生长适应期，对氧的利用率较低。随着渗流试验的进行，含水介质上的微生物逐渐适应环境，进入对数生长期，对氧的利用率大大增加。渗流进行到后期，由于微生物的大量生长致使营养物成为限制因素，微生物大量死亡，对氧的利用率逐渐趋缓甚至降低。由图6可知，在连续渗流216h 内，不同渗流段COD Cr 浓度均呈现下降趋势。其中，靠近进水端（6cm ）COD Cr 浓度从42.47mg/L 降低至25.89mg/L ；中部（12cm ）COD Cr 浓度从36.98mg/L 降至19.69mg/L ；近出水端（18cm ）COD Cr 浓度从33.72mg/L 降至17.10mg/L ，这与砂柱渗透系数的变化规律一致。说明随着入渗距离的增大，砂柱对水中营养物的吸附、过滤作用和微生物的降解作用逐渐增强，水中COD Cr 浓度逐渐减小。而营养物浓度的降低抑制了微生物的生长和繁殖速度，导致生物堵
塞的程度随入渗距离的增大逐渐减弱。此外，随渗流时间的延长，出水COD Cr 浓度的降低幅度呈现先快速下降后趋缓的趋势。表明随
渗流试验的进行，微生物对进水COD Cr 的降解作用逐渐减弱。渗流试验初始阶段（144h 内），进水充足的营养物质有利于微生物的生长、繁殖，并大量分泌胞外聚合物，导致含水介质渗透性降低，堵
塞程度严重。而当回灌持续一定时间后（144h 后），微生物进入生长稳定期，生物堵塞程度逐渐减缓并趋于稳定。4结论
（1）生物堵塞的程度随着渗流距离的增加而减缓，含水介质的渗透性呈现明显的非均质性。微生物经过短暂的适应期，快速进入生长、繁殖阶段，含水介质微生物堵塞迅速形成。（2）造成含水介质微生物堵塞的优势菌群为甲基杆菌属（Methylobacterium ）、紫色杆菌属（Janthinobacterium ）、耶尔森菌属（Yersinia ）、葡萄球菌属（Staphylococcus ）、食酸菌属（Acidovorax ）。优势菌群中甲基杆菌属、紫色杆菌属、葡萄球菌属和食酸菌属均为产黏细菌（Myxobacterium ）。（3）含水介质中存在微生物的繁衍、代谢等生命活动。进水营养液为好氧微生物的生长、繁殖提供了充足的氧气，好氧细菌生长旺盛，并大量分泌胞外聚合物，导致进水段微生物堵塞程度最严重。
参考文献：
［1］Uli Metzger ，Pierre Le-Clech ，Richard M Stuetz ，et al .Characterisation of polymeric fouling in membrane biore?
图5溶解氧含量随时间变化规律图图6COD Cr
浓度随时间变化规律
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Analysis of process and mechanism of bioclogging in aqueous media
XIA Lu1，ZHENG Xi-lai1，DUAN Yu-huan1，PENG Tao2
（1.Ministry of Education Key Laboratory of Marine Environment and Ecology，Ocean University of China，Qingdao266100，China；
2.Construction survey and design institute co.，LTD.，Beijing100007，China）
Abstract：Sand samples collecting from the Dagu River in Qingdao city were used as representative aquifer medium，and measured the composition and properties.Percolating experiments were conducted to investi?gate the dynamic changes of different flow systems.The molecular biological technology PCR-DGGE was used to identify the advantage microorganisms inducing bioclogging.In addition，the use of nutrients and ox?ygen by microbial were analysis in order to discuss the bioclogging process and its mechanism.The results indicate that the degree of bioclogging in aquifer media decreases as the percolating distances increase and the permeability of aquifer medium presents obvious heterogeneity.After a short adjusting period，microbial quickly enters a growth stage.Meanwhile，microbial clogging in aquifer media develops fast.The main mi?croorganism which causing bioclogging are Methylobacterium、Janthinobacterium、Yersinia、Staphylococcus as well as Acidovorax.In particular，Methylobacterium、Janthinobacterium、Staphylococcus and Acidovorax are Myxobacterium.It is proved that there are microbial reproduction，metabolism as well as other activities in aquifer media.High nutrient loading provides ample oxygen for microbial growth and promotes production of large amounts of extracellular polymeric substances which caused the most bioclogging in media.
Key words：bioclogging；aqueous media；PCR；DGGE；permeability coefficient
（责任编辑：韩昆）（上接第748页）
Experimental investigation on the size effect of soil mechanic
characteristics by tri-axial shear test
FANG Ying-guang1，2
（1.School of Civil Engineering and Transportation，South China University of Technology，Guangzhou510641，China；
2.State Key Laboratory of Subtropical Building Science，South China University of Technology，Guangzhou510641，China）
Abstract：The physical and mechanical characteristics of soil are obviously affected by scale and grade of grains，exhibiting remarkable grain size effect.By using the natural clay and commercial quartz sand，a se?ries of test samples with sand grains of different size and volume fraction are prepared，and curves of stress-strain and shear yield strength are obtained by unconsolidated-undrained and consolidated-undrained tri-axial shear tests.The analysis on the grain size effect of the soil mechanical characteristics is based on the test results，and the cell element model of soil is proposed to explain the physical mechanisms.The test results show that deformation properties and shear yield strength are improved remarkably with volume fraction increasing and particle size decreasing of sand in soil，and the volume fraction has a more obvious influence on grain size effect of deformation and strength characteristics than that of grain’s size.The cell element model of soil explains the physical mechanism of grain size effect of the tests results.
Key words：size effect of soil；tri-axial shear test；volume fraction；cell element model of soil；physical mechanism
（责任编辑：李琳）
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砂柱微生物堵塞过程及机理分析
作者：夏璐， 郑西来， 段玉环， 彭涛， XIA Lu， ZHENG Xi-lai， DUAN Yu-huan， PENG Tao
作者单位：夏璐,郑西来,段玉环,XIA Lu,ZHENG Xi-lai,DUAN Yu-huan(中国海洋大学 海洋环境与生态教育部重点实验室,山东 青岛,266100)， 彭涛,PENG Tao(建设综合勘察研究设计院有限公司,北京,100007)
刊名：
水利学报
英文刊名：Journal of Hydraulic Engineering
年，卷(期)：2014(6)
参考文献(25条)
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引用本文格式：夏璐.郑西来.段玉环.彭涛.XIA Lu.ZHENG Xi-lai.DUAN Yu-huan.PENG Tao砂柱微生物堵塞过程及机理分析[期刊论文]-水利学报 2014(6)