Quick Spot 人IFN-γ ELISPOT 预包被试剂盒96Test 使用说明书

Quick Spot人IFN-γ ELISPOT预包被试剂盒

96Test使用说明书

（070521）

产品描述：

Quick Spot 系列――人IFN-γ ELISPOT预包被试剂盒采用U-CyTech原产高品质抗体对，经预包被PVDF板、低温冷冻干燥、真空密封包装等工艺流程制备。成品PVDF板上预包被的抗体分布均匀、效价稳定，可以在4 oC存放6个月。实验结果与新鲜包被板对比，结果无异。

使用Quick Spot 系列预包被ELISPOT试剂盒，检测时间从3天缩短为2天，并且大幅度减少无菌操作的实验步骤，减轻实验者的劳动强度和减少污染的机会。使得实验者能够轻松、高效地完成复杂的ELISPOT检测实验。

试剂盒提供的试剂、规格以及保存条件：

名称标识规格（96T）存储条件、保质期

Biotinylate antibody 蓝盖0.5ml管 100ul 4oC，6个月

Streptavidin-HRP 红盖0.5ml管 100ul 4oC，6个月 Dilution buffer R（1X）蓝盖15ml瓶 10mlX2 4oC，6个月Washing buffer (50X) 无色15ml瓶 10ml 4oC，6个月

AEC solutionⅠ（20×）粉盖1.5ml管 500ul 4oC，6个月

AEC solutionⅡ（20×）棕盖1.5ml管 500ul 4oC，6个月

AEC solution Ⅲ（200×）无色0.5ml管 50ul 4oC，6个月预包被PVDF板铝箔密封袋11块 4oC，6个月

需要实验者自行准备的试剂与仪器：

1.RPMI-1640基本培养基（需要添加双抗，不需要添加血清）

2.Lympho-Spot?无血清培养基（已经含有了所有成分，不需要做任何添加）

3.超净工作台

4.CO2细胞培养箱

5.微量移液器及配套Tip头

6.8通道微量移液器

7.0.5mL, 1.5mL EP管

8.Biosys Bioreader4000自动读板仪

试剂的配制：

1预包被板采取真空包装，铝箔袋里含有干燥剂。

1．Washing buffer (50X):用无菌去离子水稀释50倍制成1X Washing buffer备用，注意无菌操作。

2．生物素标记的抗体（Biotinylated antibody，Secondary antibody）：用Dilution buffer R（1X）100倍稀释，每孔100μL。

3．酶联亲和素（Streptavidin-HRP ）：用Dilution buffer R（1X）100倍稀释，每孔100μL。

4．AEC显色液：将去离子水、AEC solutionI、AEC solutionⅡ、AEC solutionⅢ按照180:10:10:1的比例混合，可参见下表。配制好的AEC显色液室温下的半衰期约

30min，使用时现用现配。显色时，每孔加100μL。

总体积去离子水AEC Solution I AEC Solution II AEC Solution III

1ml 0.9ml 50ul 50ul 5ul

2ml 1.8ml 100ul 100ul 10ul

3ml 2.7ml 150ul 150ul 15ul

4ml 3.6ml 200ul 200ul 20ul

5ml 4.5ml 250ul 250ul 25ul

8ml 7.2ml 400ul 400ul 40ul

10ml 9ml 500ul 500ul 50ul

5．Lympho-Spot?无血清培养基：我们推荐使用Lympho-Spot?无血清培养基。它是专门为无血清ELISPOT技术优化设计的，能排除血清的干扰，结果更加稳定可靠，

背景也更好。如果没有，可以用含5%胎牛血清的RPMI-1640培养基代替。

实验操作过程：

第一天：接种细胞,加入刺激物，培养（严格注意无菌操作）

整个实验设置一组正对照（PHA或者其他非特异性刺激物），每一个细胞样品（同一

个捐献者或者实验动物）要设一个负对照（不加刺激物），整块板还要加一个背景负对照（不

含细胞，只加培养基和所有的检测试剂）。

1.填好实验卡片，用以指导实验的安排和细胞及试剂的添加。每一个细胞/刺激物的组合

设置2-4个孔的重复（想要有统计学的意义，每个细胞/刺激物设4个孔的重复）。

2.预包被板在使用前需要活化。具体操作：加入200μL的RPMI-1640培养基或者

Lympho-Spot?无血清培养基，室温静置10分钟左右，倾倒。

3.按照实验卡片的安排，加入不同浓度的细胞，100μL/well。细胞在孔中的分布要尽量均

匀（要诀是加入细胞之后，不要再震动或者拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让细胞更分散，实际情况刚好相反）。正对照的细胞浓度为1×105 cells/well，实验组的样品细胞浓度请自行调整。

4.加入100μL的Lympho-Spot?无血清培养基到背景负对照孔。

5.正对照每孔加入10μL PHA（或者其他刺激物），终浓度2-20ug/mL。

6.加入实验者自己的刺激物（用Lympho-Spot?无血清培养基或者RPMI1640配制成10×

终浓度，10μL/well）到实验孔。加完刺激物之后，不要再拍击ELISPOT板。有人认为拍击板子会让刺激物在孔中混合均匀。实际上，通过扩散，刺激物会很快混合均匀。拍击板子会让细胞成圈的分布在孔的外周。

7.当加完所有的样品之后，盖上板盖，放入37°C，5％CO2培养箱培养16-36小时。注意：

碰撞会引起细胞移位，造成斑点模糊、拖尾。在整个培养过程中应避免移动、碰撞培养板，并尽量减少开关培养箱的次数。

第二天：培养后操作（不再需要无菌操作）

1.倾倒孔内的细胞及培养基。

2.裂解细胞：每孔加入200μL冰冷的去离子水，4℃冰箱冰浴10分钟（低渗法裂解细胞）。

注意：切不可将加了去离子水的板子放入-20°C冰箱。一旦结冰，将会损害膜上的包被抗体与细胞因子，导致最终显色的斑点暗淡偏小甚至实验的彻底失败。

3.洗板：每孔用200μL 1×Washing buffer洗涤5-7次，每次30秒。最后一次，在吸水纸

上扣干。

4.检测抗体孵育：每孔加入100μL稀释好的生物素标记的抗体，37°C 孵育1小时。

5.洗板：每孔用200μL 1×Washing buffer洗涤5次，每次30秒。最后一次，在吸水纸上

扣干。

注意：

有的实验者认为，洗涤生物素标记的抗体和酶标亲和素的时候，膜的背面也需要清洗。经我们验证，不清洗膜的背面也可以得到满意的结果，但是如果清洗，背景会

更干净一些。所以，清洗膜的背面为实验的优化步骤，是否略过，由实验者自行

决定。

如果要洗涤膜的背面。我们的方法是：在洗涤最后一次时，小心揭开塑料保护层，将PVDF膜板底面浸入盛有干净1×PBT的浅托盘中，轻轻漂洗几次即可。

6.亲和素孵育：每孔加入100μL稀释好的酶标亲和素，37°C孵育1小时。

7.洗板：每孔用200μL 1×Washing buffer洗涤5次，每次30秒。最后一次，在吸水纸上

扣干。

8.显色：照试剂配制说明，配好AEC显色液。每孔加入100μL的显色液，室温避光静置

15-45分钟（在20 -25°C，显色25分钟较合适）。

注意：如果室温低于20°C，需要在37°C孵箱做显色，每隔5-10分钟检查一次。

9.待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将板倒扣在吸水

纸上，拍干细小的水珠，之后取下保护层，放在通风的地方，室温静置10-30分钟，让膜自然晾干。注意不要将板放到烤箱内，防止膜发脆、破裂。

10.ELISPOT板斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分析。

注意事项：

洗涤指导

用排枪每孔加入200-300μL洗涤缓冲液，多了易溢出。加入洗涤缓冲液之后浸泡30秒左右。然后扣出洗涤液。注意：所有从孔中移出液体的步骤均需要倾倒、扣干，勿用枪头去吸，否则枪头可能会碰刮、损伤到膜。洗涤步骤的最后一次操作需要在吸水纸上拍干。吸水纸最好采用进口棉纸，强度高，不掉屑，吸水量大，使用前需要高压灭菌。不充分的洗涤会有很重的背景，对斑点计数造成一定干扰。

试剂盒的存放

整个试剂盒4oC保存。切忌放入-２０oＣ冰箱，否则冻融后抗体的效价会下降，影响实验结果。

是达科为公司Quick Spot系列预包被ELISPOT试

剂盒的商标。

是深圳市达科为生物技术有限公司的标志。

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