DNA引物纯化

DNA引物纯化见习报告


Time flies!不知不觉来+++已有三个多月之久。在这里我学到了很多东西，也感受到了我们+++的企业文化、人文文化与攀爬历程。我也为即将成为一名+++而为感到骄傲。现我将三个月来对工作的认识作如下报告：

一． 氨解前的准备

1. 检查纯化所需材料及试剂是否充足。、

2. 活化C18板（柱） 向C18板加满0.5M NaCl，抽干，重复平衡3次，再加满分析纯，抽干5次以上，最后以洗脱速度离心。洗脱后再向C18板内加满0.5M NaCl，抽干，重复3次，完毕再向C18板内加满0.5M NaCl以待用。C18柱活化，首先用20ml分析纯活化C18一次，吹干甲醇，然后用10ml NaCl平衡1次以待用。

3.制板灌胶 计算好预用分析板及电泳板数量以灌胶。胶液制作，每块板需50ml左右的16%的胶（短链，16%；长链，12%），每块板平均加入过硫酸铵100ul，TEMED 30ul(依情况而定，可适量增减)，摇晃，混匀，倒入板中，水平放置，使胶凝固。注意板中不能有气泡，并注意补胶。

注意事项：①所用C18板需定期进行维护与检测。

②每一瓶新制胶使用之前需对胶跑Marker以保能正常使用。

二． 氨解

原理：切割—将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。用冰氨水来裂解CPG

连接化合物与初始核苷间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3‘羟基。

脱保护基—用冰氨水处理较长时间以脱掉碱基环上的氰乙基、苯甲酰基、异丙基等保护基团。

1. 单管氨解

① 将合成好的柱子用注射器针头将CPG或树脂粉末全部倒入氨解瓶中，并将对应的标签贴在氨解瓶上。

② 加入冰三乙胺100ul，冰氨水1.5ml，盖紧瓶盖，放入80度烘箱氨解2小时。对用快速氨解单体合成的序列直接加氨水后55度2小时即可。在生产操作表上准确记录开始氨解的时间。

注意事项:①在将引物放入氨解瓶时,要核对清楚标签,要一一对应。

②三乙胺与氨水顺序要防止加反。(加反后会出现分层现象)

③氨解中使用的氨水必须是冰冻状态中的氨水。
2. 96孔板氨解

①55度氨解

对好标签，向合成板内加入适量的乙氰放在垫板上，重量平衡，高速离心。（对于3900，离心完后需用注射器针头将砂芯勾出）离心完后，将垫板换成正面贴有对应轮次标签的氨解板上。放入通风橱。先向合成板每孔加入50ul三乙胺，再向每孔加入250ul氨水，用胶带封好放入氨解盒中，在操作单上登记好时间和氨解人，放入55度烘箱氨解40min。

②80度氨解

40min后取出，放入通风橱赶氨1min，高速离心。拿去合成板用20ul小枪取小样20ul；在向氨解板每

孔内加入冰氨水200ul，封好胶带，用夹板夹好，登记好时间，放入80度烘箱氨解2h。

注意事项:①务必在氨解板正面贴上该轮次标签,然后再位置一一对应垫再合成板下面,一起氨解,离心。

②三乙胺与氨水顺序要防止加反。(加反后会出现分层现象)

③氨解中使用的氨水必须是冰冻状态中的氨水。

④夹板密封时要注意拧紧,防止出现漏氨。

三． 脱盐纯化

原理：C18是一种活性炭，对DNA有特异性的吸附能力，吸附之后的DNA可以被有机溶剂洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。

1. C18柱脱盐

① 脱盐引物转移：在13ml干净离心管中加入NaCl备用，然后把氨解结束并冷却的DNA粗产品一一对应转移至试管中，并贴好对应标签。

② 产品DNA过柱：将活化和平衡好的C18柱上面连接注射器，下面连接枪头，然后放入转移好的13ml离心管的液体中，上下推动注射器5次以上，确保DNA溶液全部经过纯化柱。（注意：注射器和枪头要干净；过柱后，将引物标签贴在手背上。）

③ 清洗盐分及杂质：先用10ml的注射器清洗3次，再用20ml注射器吸满蒸馏水，然后连接含有产品DNA的C18柱，清洗2次以上后吹干。

④ 洗脱产品DNA：用5ml注射器吸80%色谱甲醇1ml，缓慢通过纯化柱，洗脱DNA产品，收集在1.5ml的离心管中，然后贴好对应引物标签。

2. 96孔板纯化

① 将80度赶氨完的氨解板中加入100-120ul的2M NaCl，用排枪来回抽吸2次以混匀。

② 在准备好的C18板下放置一块96孔垫板，位置一一对应；将氨解板中的引物一一对应转移到C18板内，转移时，排枪的量不能超过200ul，枪头也要一一对应。

③ 转移好后，将C18板按顺序一一对应放在氨解板上，平衡后一起放入离心机中离心，600—1600转速，离心5分钟，重复3次以上。

④ 清洗盐分及杂质：首先在C18板中加入蒸馏水，真空抽干，再加满蒸馏水浸泡5分钟，在泵上抽干，反复加水至少10以上，然后放入离心机内高速离心，目的是把板内的水甩干。

⑤ 洗脱产品DNA：取一块干净的洗脱板，在正面写上对应的编号，位置一一对应放在洗过盐分的C18板下面，用移液抢往C18板中加入80%色谱甲醇300ul左右，平衡后放入离心机，转速500-2800左右，离心10分钟，将引物洗脱到洗脱板内。

⑥ 将用完的C18板加分析甲醇抽干2-3次后放入甲醇中浸泡。

注意事项：①在离心过程中需小心，并一一对应将引物转入C18板中。

②在过柱时，每块C18板的离心速度都是有差异的，在过柱过程中应不时打开离心机看引物是否离下，并找到这块C18板的最佳离心速度。

③过

柱时应注意避免将引物吸入排枪中而被污染。

④水洗时，应需充分多次，并注意96孔板C18的不要有气泡，保证每个孔都要洗到。

⑤C18板，氨解板，洗脱板，位置一一对应，并在正面贴上对应标签。

⑥用完的C18板一定要在活化1次后才能放入甲醇中浸泡。


四． PAGE纯化

原理：依据DNA片段在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时的迁移率不同来分离大小片段。由于各分子所带电荷和大小不同，综合影响其在凝胶中的迁移速度。

① 对于单管氨解的，在转移时必须转移1条后立即将氨解瓶上标签撕下，贴在2.0ml的离心管外壁上，严禁一次转移多条引物。

② 对于96孔板氨解的，必须先在2.0ml的离心管壁贴上对应操作号的标签，同时在管盖上注明合成道数（以防止抽干过程中标签脱落后无法识别），然后依次对应转移。

③ 注意：没转移完一个样品，要换一个枪头，同时注意不要将CPG或树脂吸入枪头中。

④ 抽干基变性：将转移好的样品放在离心机中抽干。抽干后加入150ul的饱和尿素溶液，震荡使样品充分溶解；或者将样品干燥至剩余体积200ul左右，然后适量尿素干粉使之饱和；加尿素后将离心管放在开水中浸泡，使DNA变性，2min后取出在震荡一次即可。

⑤ 预电泳和样品编号：上样前先预跑电泳半小时左右，电压：150V×4=600V，电流：30A左右（以1块板为例）。在预跑电泳期间，将需要上扬的样品进行编号后记录在电泳操作表上，并按顺序将电泳玻璃板编号。

⑥ 上样：暂停电泳仪电源（先将电流调到最小，然后断开电源），将Maker标记首先上入电泳泳道中，在将样品按顺序加入其它样品槽内，上样时枪头不能有气泡，要先上靠近Maker的样品槽，上完一个后必须立即撕下样品管上的标签，对应贴在上样孔的下方，然后轻轻盖上滤纸，注意电泳槽板内不能有气泡。

⑦ 电泳：上好样后，再次打开电泳仪电源，调整电源至30A左右，电泳过程中要多次观察电泳仪上的电压和电流变化，Maker标记中的两个对照品，第一个约10-20bp左右，第二个约30bp左右，控制主带尽量走的低一些，保证第一个Maker跑下缓冲液。

⑧ 割胶：割胶前先撕下靠近Maker的标签贴在左手上，撕下远离Maker的标签贴在右手上，撬开玻璃，取出PAGE胶片，在TLC板上观察条带，注意分析Maker与样品间，样品与样品间的碱基长度差异，确定主带；首先将靠近Maker的主带切下，用镊子已经准备好的试管中，并将左手上的标签撕下贴在试管壁上，然后切下远离Maker的主带，在试管上贴上右手上的标签；严禁同时撕下多块玻璃板上的标签贴在别处。割

胶时，割胶条的宽度应以刚好全部切下目的条带为准，且下侧边缘应尽量偏上，防止割到下面的杂带导致引物不纯。

⑨ 泡胶：割下胶应尽快切碎，往试管中加入0.5MNaCl溶液，加入的NaCl的量以能够浸没切下的胶带为准。盖上盖子，确保不漏情况下放入55度烘箱泡胶，泡胶时间除特别加急引物外，短链4小时，长链6小时。

⑩ 泡胶时间到后取下盖子，放入少许棉花。过柱方法同单管脱盐过柱。

注意事项：①灌胶时板内不能出现气泡。

②转移过程中每条引物都要换枪头。

③氨解，转移，上样，割胶应注意避免样品的损失和交叉污染。

④96孔板氨解后转移要注意一一对应，不要转错。

⑤电泳过程中不要出现气泡。

⑥电泳过程中，注意电泳槽中TBE的量，并及时抽掉下面的废液。定期清理电泳槽。

⑦割胶时注意不要将标签贴反，必须割一条贴一割标签。

五.分析板检测

原理:将少量样品进行PAGE电泳,根据电泳的条带大小和形状来粗略判断引物的合成质量。
1. 五度氨解时先在操作表上随机选小样(要做到一块96孔板的每排每行都至少取一个),引物长度有差异时尽量选长度较大的引物,便于判断.然后用MARK笔在离心管上标明引物的合成编号。

2. 用水冲洗凝好的胶并清理每个泳道,然后放置在电泳槽中打开电泳仪,电压600V,电流25A左右(以一块板为例),进行预电泳20min。

3. 五度氨解结束并冷却后,把引物离心到氨解板里,根据自己选的小样在相应的孔里取15-20ul的样品溶液至写好编号的离心管中,抽干,加保和尿素溶液20ul,然后将离心管放入开水中浸泡,使DNA充分变性。

4. 上样:暂停电泳仪电源(先将电流调到最小,然后断开电源),左边第一个泳道上Maker标记,然后从左边第2个泳道开始从左到右依次上样.上样时可以在分析板上表明位置,保证每个孔的位置一一对应,不能上重.

5. 电泳:上好样后,再次代开电泳仪电源,调整电流至30A左右,电泳1.5-2个小时后在紫外凝胶成像议中进行拍照存档,客观的作出标准判断。

6. 电泳条带正常的判定标准:与Maker相比电泳条带相应位置大小正确,主带亮而明显。

7. 电泳条带异常处理:对于无条带的,个别主带弱或很不明显的,先在操作表上表明,停止分装,然后必须要将留样加尿素,热变性后重新上样电泳,重新电泳后结果一致后立刻报重合;对于同一个BANK或同一列或同一行的引物条带都异常的,必须将该BANK或该列或该列的引物全部重新电泳检测一遍,结果一致后立即报重合;对于超过1/4的抽检引物条带均异常的,必须将同一轮次的所有引

物进行电泳检测,然后将条带异常的引物立即安排重新合成,并将异常情况报告当班组长或部门经理,以进一步分析原因。

注意事项:①电用检测一般使用16%的胶。

②选分析板时碱基长度要有差异有利于判断。

③如发现分析板异常,应及时取样再一次进行检测,并把对应的引物拿出。

④留样引物进行检测时的上样量应该按0.2-0.4OD进行取样。

⑤在电泳过程中应随时注意电泳情况,及时补好TBE,禁止出现气泡。

整个实验要想尽量避免人为错误,就必须仔细,做每一个环节都必须用心去做,如果哪个环节出现问题都将影响实验结果,这就是企业的“99+1=0原则”,100个环节中有一个环节出现错误将会影响产品质量。现在我说说几个将会严重影响实验结果的问题:一.C18板活化,这是整个纯化过程中最重要的一个环节,如果C18板活化不到位,C18粉会将上次实验吸附的引物带到下一次实验中来,这就是我们发现双带或多带的一个主要原因,所以应对C18板进行充分活化。二.80度氨解漏氨或赶氨进水,氨水漏光不言而喻将导致部分或全部重合,赶氨进水,引物污染,因而我们在夹夹板时必须夹紧。三.过柱错误。四.氨解,过柱,洗脱未将垫板及时更换.五.试剂的量和顺序加错。

以上时我在这三个多月来对纯化工作的理解与认识,肯定还存在不足之处,我将在接下来的工作中努力弥补。在这段时间里,我非常感谢......等几位师兄对我工作上的指导,我将会用我的实际行动来报答你们。

20 年 月 日星期日

报告人:+++