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(干货)液相色谱基础知识大全

(干货)液相色谱基础知识大全
(干货)液相色谱基础知识大全

一、基本原理

高效液相色谱(HPLC)法是以高压下的液体为流动相,并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广,不受分析对象挥发性和热稳定性的限制,因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中,可用气相色谱分析的约占20%,而80%则需用高效液相色谱来分析。

高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同,它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。

二、高效液相色谱分析原理

(1)、高效液相色谱分析的流程:由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统,然后输出,经流量与压力测量之后,导入进样器。被测物由进样器注入,并随流动相通过色谱柱,在柱上进行分离后进入检测器,检测信号由数据处理设备采集与处理,并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似,不同的是气相色谱改变温度,而HPLC改变的是流动相极性,使样品各组分在最佳条件下得以分离。

(2)、高效液相色谱的分离过程:同其他色谱过程一样,HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分

离。

开始样品加在柱头上,假设样品中含有3个组分,A、B和C,随流动相一起进入色谱柱,开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留,较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长,较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A,C之间,第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统,则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱,达到分离之目的。

不同组分在色谱过程中的分离情况,首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异,这是热力学平衡问题,也是分离的首要条件。其次,当不同组分在色谱柱中运动时,谱带随柱长展宽,分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。

三、工作原理

储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。

四、HPLC的特点和优点

HPLC有以下特点:

高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。

高速——流速为0.1~10.0 ml/min。

高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。

高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。

HPLC与经典液相色谱相比有以下优点:

速度快——通常分析一个样品在15~30 min,有些样品甚至在5 min内即可完成。

分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。

灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng,荧光和电化学检测器可达0.1pg。

柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。

样品量少,容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏,可以收集单一组分或做制备。

五、液相色谱的五大系统

1、进样系统

进样系统分为手动进样阀和自动进样器。

手动进样阀

对于手动进样阀使用过程中需要注意每个样品进样完成后应对进样阀进行清洗,防止残留对下一个样品分析的影响。还需要注意进样方式,以20μL定量环为例,我们可以选择完全充满定量管或部分充满定量管。为了保证进样的重复性,选择完全充满定量管进样方式时,需要注入定量环体积3倍以上的样品;选择部分充满定量管进样方式时,进样体积应在定量管体积一半以下,即1-10μL。

自动进样器

如果采用自动进样器进样,首先需要保证注射器里面没有气泡存在,否则影响进样量准确性;其次是样品瓶里面有足够的样品,保证进样针能够吸到样品。为了避免交叉污染需要定期对样品瓶、盖和垫进行清洗。若自动进样器长时间不使用,应该注意:腐蚀性的流动相或洗液(例如,碱性或酸性缓冲溶液)必须完全从系统中置换出来。同时,为了避免细菌的生长,应将一个样品瓶中充满甲醇,并重复几次进样操作。

2、输液系统

输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。对液相色谱分析来说,输液泵的流量稳定性更为重要,这是因为流速的变化会引起溶质的保留值的变化,而保留值是色谱定性的主要依据之一。因此,恒流泵的应用更广泛。

输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。

HPLC使用的高压泵应满足下列条件:

a 流量恒定,无脉动,并有较大的调节范围(一般为1~10ml/min);

b 能抗溶剂腐蚀;

c 有较高的输液压力;对一般分离,60×105Pa的压力就满足了,对高效分离,要求达到150~300×105Pa。

(1)往复式柱塞泵结构和原理

当柱塞推入缸体时,泵头出口(上部)的单向阀打开,同时,流动相进入的单向阀(下部)关闭,这时就输出少量的流体。反之,当柱塞向外拉时,流动相入口的单向阀打开,出口的单向阀同时关闭,一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。这种泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响,连续供给恒定体积的流动相。

(2)气动放大泵结构和原理

其工作原理是:压力为p1的低压气体推动大面积(SA )活塞A,则在小面积(SB )活塞B输出压力增大至p2的液体。压力增大的倍数取决于A和B两活塞的面积比,如果A与B的面积之比为50:1 ,则压力为5×105Pa的气体就

可得到压力为250×105Pa的输出液体。这是一种恒压泵。

泵头通常由两部分组成--单向阀和密封圈-柱塞杆.单向阀一般由阀体\塑料\或陶瓷阀座和红宝石球组成.在压力的作用下宝石球离开阀座,流动相流过单向阀;反之,在反向力的作用下,宝石球回到阀座上,此时流动相不再流过单向阀.显然宝石球与阀座之间的配合必须非常适合才能防止流动相的泄漏.为了保证单向阀不发生泄漏,一些单向阀中安装了两套宝石球和阀座,也有一些单向阀是将宝石球用一个合适的弹簧压在阀座上.在不同的应用领域,单向阀阀体的材料有所不同,例如考虑生物兼容性的系统,单向阀的阀体往往采用金属钛,而不用不锈钢.为了降低成本和减少维护费用,一些生产厂商还采用了可置换式的卡套式塑料单元件,当然其功能仍保持不变

输液系统即是指高压恒流泵,其作用是能提供稳定准确的流速。

溶剂过滤头:吸液过滤头,或称沉子,主要作用是过滤流动相中可能存在的颗粒性杂质。长时间使用后,杂质有可能阻塞溶剂过滤头上的过滤板孔隙;或长时间使用缓冲液,过滤头表面容易产生一层膜,阻碍流动相正常通过。严重时,即使是已超声过的溶剂,泵吸液时也会有气泡在四氟输液管里产生,因此应经常对过滤头进行清洗。清洗溶剂可以选择乙醇或者30%稀硝酸溶液,正相系统需注意滤头的烘干处理。

单向阀:单向阀的作用是确保液体向一个方向流动,是高压恒流泵稳定输液的保证。日常使用过程中,可以通过观察压力的情况,初步判断流量是否正常。如果系统已经平衡一段时间,压力应该是稳定的。但如果压力存在波动,则表明流量不稳定;如果无压力,则表明无流量。这两种情况大多是因为单向阀里混入了气泡或杂质。混入气泡的情况,应把放空阀打开,按冲洗键将里面的气泡排出。单向阀混入杂质的情况,须对其进行清洗。清洗溶剂可以选择乙醇,安装时注意标记环的方向。

密封圈:密封圈是固定在柱塞杆上防止泵腔内的液体泄漏,是保证泵头输液正常的关键部件。但柱塞杆和柱塞密封圈长期使用会发生磨损,主要与流量、操作压力和所使用的流动相有关。当使用含盐的流动相时,由于脱水或蒸发,可能形成盐结晶,而泵运动时盐结晶会导致密封圈和柱塞杆的磨损。因此,每天实验前和实验后都需用纯水冲洗一次密封圈(在柱塞密封圈和二级密封圈之间),保持清洗管内有水以防止形成晶体,延长柱塞杆和密封圈的使用寿命。

在线过滤器:为了防止由于流动相杂质微粒进入色谱系统,泵在放空阀内安装了在线过滤器,经泵出口流出的液体通过在线过滤器,经排空管流出的

高效液相色谱(HPLC)基础知识

高效液相色谱(HPLC)基础知识我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表: 方法项目 数量 1985年版1990年版1995年版2000年版 HPLC法 鉴别9 34 150 检查12 40 160 含量测定7 60 117 387 鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多,因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。 I.概论 一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是:溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时,由于与固定相(stationary phase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同,在固定相中滞留时间不同,从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特(Tswett)在1906年研究用

碳酸钙分离植物色素时发现的,色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色 谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用 液位差输送流动相,称为经典液相色谱法,此方法柱效低、时间长(常有几个小时)。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography,HPLC)是在经典液相色谱法的基础上,于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需 用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography,HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography,HSLP)。也称现代液相色谱。二、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点: 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速——流速为0.1~10.0 ml/min。 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点: 速度快——通常分析一个样品在15~30 min,有些样品甚至在 5

最全的液相色谱知识 整理

最全的液相色谱知识(包括原理,维护,基础操作,处理方法) HPLC日常维护- 进样阀问题可能原因解决方法 手动进样阀,转动不灵转子密封损坏更换或调整转子密封转子太紧调整转子的松紧度 手动进样阀,载样困难进样阀安装不当重新安装定量环阻塞清洗或更换定量环进样器污染清洗或更换进样器管路阻塞清洗或更换管路 自动进样阀,不能转动无压力(或电源)提供恰当的压力(电源)转子太紧调整转子的松紧度 进样阀安装不当重新安装 自动进样阀,其它问题 阻塞清洗或更换阻塞部件机械故障见随机维修手册控制器故障维修或更换控制器 出现问题可能原因解决方法 保留时间变 化柱温变化柱恒温,必要时需配置恒温箱 等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱缓冲液容量不够用>25mmol/L的缓冲液 柱污染每天冲洗柱 柱内条件变化稳定进样条件,调节流动相 柱快达到寿命采用保护柱 保留时间缩 短流速增加检查泵,重新设定流速 样品超载降低样品量 键合相流失流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀 温度增加柱恒温 保留时间延 长流速下降管路泄漏,换泵密封圈,排除泵内气泡 硅胶柱上活性点变化用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化柱键合相流失流动相PH值保持在3~7.5检查柱的方向 流动相组成变化防止流动相蒸发或沉淀 温度降低柱恒温 出现肩峰或 分叉样品体积过大用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15% 样品溶剂过强采用较弱的样品溶剂 柱塌陷或形成短路通道更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件 柱内烧结不锈钢失效更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品 进样器损坏更换进样器转子 鬼峰进样阀残余峰每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗 样品中未知物处理样品 柱未平衡 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂(尤其是离子对 色谱)

高效液相试题及答案

高效液相色谱基础知识测试 一、填空题 1、我们公司所用的高效液相色谱仪的品牌是:安捷伦1260 。高效气相色谱仪的型号是安捷伦7890 。 2、高效液相色谱系统由恒温器、四元泵、进样器、色谱柱、检测器和分析系统组成。 3、本公司所用的高效液相,为防止压力过大导致柱内填料空间发生变化,影响分离效果。一般采用C18(十八烷基硅烷键合硅胶)填料的色谱柱,最高工作压力为400 bar。 4、高效液相根据流动相与固定相极性分为:正相高效液相色谱和反相高效液相色谱。 5、开机步骤:接通电源,依次开启不间断电源、真空脱气机、四元泵、检测器,待泵和检测器自检结束后,打开电脑显示器、主机,最后打开色谱工作站。 6、高效液相的维护:最后一次进样完成后,应用流动相冲洗20分钟,以保证洗脱完全,若流动相中含有无机盐类,应用高纯水冲洗30分钟,。 7、进样器的保养:每次分析结束后,要反复冲洗进样口,防止样品的交叉污染。 8、气相色谱仪常用的检测器有热导检测器,氢火焰检测器,电子捕获检测器和火焰光度检测器。 二、选择题 1.在液相色谱法中,提高柱效最有效的途径是(D ) A.提高柱温 B.降低板高 C.降低流动相流速 D.减小填料粒度 2. 在高固定液含量色谱柱的情况下,为了使柱效能提高,可选用( A )

A.适当提高柱温 B.增加固定液含量 C.增大载体颗粒直径 D.增加柱长 3. 在液相色谱中, 为了提高分离效率, 缩短分析时间, 应采用的装置是( B ) A. 高压泵 B. 梯度淋洗 C. 贮液器 D. 加温 4. 在液相色谱中, 最通用型检测器是( A ) A.示差折光检测器 B.极谱检测器 C.荧光检测器 D.电化学检测器 5. 在液相色谱中, 为了获得较高柱效能, 常用的色谱柱是( A ) A.直形填充柱 B.毛细管柱 C.U形柱 D.螺旋形柱 6. 实验室常用气相色谱仪的基本组成是(B )。(1)光源;(2)气路系统;(3)单色器系统;(4)进样系统;(5)分离系统;(6)吸收系统;(7)电导池;(8)检测系统;(9)记录系统。 A 1-3-6-8-9 B 2-4-5-8-9 C 2-4-5-7-9 D 2-4-6-7-9 7.在气相色谱定性分析中,实验室之间可以通用的定性参数是( D )。 A 调整保留时间 B 校正保留时间C保留时间D相对保留值 三、判断题:(正确-----√;错误----×) 1. 确基线噪音和漂移是检测器稳定性的主要技术指标(√) 2. 灵敏度是检测器的主要性能指标(√) 3. 检出限与噪音无关(×) 4. 要提高柱的分离效能,可以考虑增加柱长,增加色谱柱选择性,调节流动相的组成等措施(√) 5. 溶解于流动相中的气体在色谱分离的过程中不会影响流动相的流速和检测器的稳定性(×) 6. 分析一个复杂混合物,恒溶剂洗脱是不能令人满意的。可在分离的过程中连续改变流动相的组成,即所谓梯度洗脱( √)

高效液相色谱习题及答案53326

高效液相色谱法习题 一、思考题 1.从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。2.液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处? 3.在液相色谱中, 提高柱效的途径有哪些?其中最有效的途径是什么? 4.液相色谱有几种类型? 5.液-液分配色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么?6.液-固分配色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么? 7.化学键合色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么? 8.离子交换色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么? 9.离子对色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么? 10.空间排阻色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么?11.在液-液分配色谱中,为什么可分为正相色谱及反相色谱? 12.何谓化学键合固定相?它有什么突出的优点? 13.何谓化学抑制型离子色谱及非抑制型离子色谱?试述它们的基本原理 14.何谓梯度洗提?它与气相色谱中的程序升温有何异同之处?15.高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有和不同之处? 16.以液相色谱进行制备有什么优点? 二、选择题 1.液相色谱适宜的分析对象是()。 A 低沸点小分子有机化合物 B 高沸点大分子有机化合物 C 所有有机化合物 D 所有化合物 2.HPLC与GC的比较,可忽略纵向扩散项,这主要是因为()。 A 柱前压力高 B 流速比GC的快 C 流动相粘度较大 D 柱温低 3.组分在固定相中的质量为MA(g),在流动相中的质量为MB(g),而该组分在固定相中的浓度为CA(g·mL-1),在流动相中浓度为CB(g·mL-1),则此组分的分配系数是( )。 A mA/m B B mB/mA C CB/CA D CA/CB。 4.液相色谱定量分析时,不要求混合物中每一个组分都出峰的是_。 A 外标标准曲线法 B 内标法 C 面积归一化法 D 外标法 5.在液相色谱中,为了改善分离的选择性,下列措施()是有效的? A 改变流动相种类 B 改变固定相类型 C 增加流速 D 改变填料的粒度 6.在分配色谱法与化学键合相色谱法中,选择不同类别的溶剂(分子间作用力不同),以改善分离度,主要是()。 A 提高分配系数比 B 容量因子增大 C 保留时间增长 D 色谱柱柱效提高 7.分离结构异构体,在下述四种方法中最适当的选择是()。 A 吸附色谱 B 反离子对色谱 C 亲和色谱 D 空间排阻色谱 8.分离糖类化合物,选以下的柱子()最合适。 A ODS柱 B 硅胶柱 C 氨基键合相柱 D 氰基键合相柱 9.在液相色谱中,梯度洗脱适用于分离()。 A 异构体 B 沸点相近,官能团相同的化合物 C 沸点相差大的试样 D 极性变化范围宽的试样

HPLC基础知识

第一章 高效液相色谱仪的特点 混合物最有效的分离、分析方法。 俄国植物学家茨维特在1906年分离叶绿素, 色谱法是一种分离技术。 混合物分离过程:试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配。 一相固定不动,称为固定相。 另一相是携带试样混合物流过固定相的流体(气体或液体),称为流动相。 特点:高压、高效、高速、高灵敏 适合高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。 与GC 互补性 三、液相色谱组成: (一)、输液系统 泵、进样阀、色谱柱、检测器、工作站(记录仪) (二)、附件 过滤装置、脱气装置、柱温箱、收集装置等等。 (三)、工作程序: 液体进入泵-压力传感器-脉动缓冲器-进样阀-色谱柱检测器 (四)、泵体组成部分: 电机、马达、双柱塞串联泵腔、缓冲器、压力传感器、面贴 (五)、检测器组成部分: 1、电器部分(变压器、氘灯板、系统电源伴、控制板、显示板、前置板、面贴) 2、光学部分(氘灯、灯箱、光学盒、凹面镜、分光镜、小参比、单色器、流通池、前置板) (六)、HPLC的分类 1、吸附色谱Adsorption Chromatography 用固体吸附剂作固定相,以不同极性溶剂做流动相依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。 2、分配色谱Partition Chromatography 用载带在固相基体上的固定液做固定相,以不同极溶剂作流动相。依据样品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。 3、离子色谱Ion Chromatography 用高效微粒离子交换剂作固定相,以具有一定PH值的缓冲液做流动相,依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆离子交换能力的差别来实现分离。4、体积排阻色谱Size Exclusion Chromatography 用化学惰性的多孔性凝胶做固定相,按固定相对样品中组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。又分: a、Gel Filtration Chromatography(GFC)以水为流动相的体积排阻色谱 b、Gel Permeation Chromatography(GPC)以有机溶剂为流动相的体积排阻色谱 5、亲和色谱

(干货)液相色谱基础知识大全

一、基本原理 高效液相色谱(HPLC)法是以高压下的液体为流动相,并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱对样品的适用性广,不受分析对象挥发性和热稳定性的限制,因而弥补了气相色谱法的不足。在目前已知的有机化合物中,可用气相色谱分析的约占20%,而80%则需用高效液相色谱来分析。 高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同,它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。 二、高效液相色谱分析原理 (1)、高效液相色谱分析的流程:由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统,然后输出,经流量与压力测量之后,导入进样器。被测物由进样器注入,并随流动相通过色谱柱,在柱上进行分离后进入检测器,检测信号由数据处理设备采集与处理,并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似,不同的是气相色谱改变温度,而HPLC改变的是流动相极性,使样品各组分在最佳条件下得以分离。 (2)、高效液相色谱的分离过程:同其他色谱过程一样,HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分 离。 开始样品加在柱头上,假设样品中含有3个组分,A、B和C,随流动相一起进入色谱柱,开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留,较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长,较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A,C之间,第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统,则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱,达到分离之目的。 不同组分在色谱过程中的分离情况,首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异,这是热力学平衡问题,也是分离的首要条件。其次,当不同组分在色谱柱中运动时,谱带随柱长展宽,分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。 三、工作原理 储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。 四、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点: 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速——流速为0.1~10.0 ml/min。 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点:

安捷伦1260型高效液相色谱仪操作规程

一、开机 1、开机前准备:流动相使用前必须过0.45um的滤膜(有机相的流动相必须为色谱纯;水相必须用新鲜注射用水,不能使用超过3天的注射用水,以防止长菌或长藻类);把流动相放入溶剂瓶中。A瓶:为水相B瓶:为有机相。 2、打开电脑,选Win 2000,进入Win 2000界面。 3、双击CAG Boodp server图标,放大CAG Boodp server小图标,出现窗口,5min 内打开液相各部件电源开关,等待1100广播信息后,表示通讯成功连接,关闭CAG Boodp serve窗口。 4、双击online图标,仪器自检,进入工作站。 该页面主要由以下几部分组成: ——最上方为命令栏,依次为File,Run Control,Instrumen…等; ——命令栏下方为快捷操作图标,如多个样品连续进行分析、单个样品进样分析、调用文件保存文件……等; ——中部为工作站各部件的工作流程示意图;依次为进样器-输液泵-柱温箱-检测器-数据处理-报告; ——中下部为动态监测信号; ——右下部为色谱工作参数:进样体积、流速、分析停止时间、流动相比例、柱温、检测波长等。 4、从“View”菜单中选择“Method and control”画面。 二、编辑参数及方法 1、开始编辑完整方法: 从“Method”菜单中选择“New method”,出现DEF-LC.M,从“Method”菜单中选择“Edit entire method”,选择方法信息、仪器参数及收集参数、数据分析参数和运行时间表等各项,单击OK,进入下一画面。 2、方法信息: 在“Method Comments”中加入方法的信息,如方法的用途等。单击OK,进入下一画面。 3、泵参数设定: 进入“Setup pump”画面,在“Flow” 处输入流量,如1ml/min;在“Solvent B”处输入有机相的比例如70.0,(A=100-B),也可在Insert 一行“Timetable”,编辑梯度;输入保留时间;在“Pressure Limits Max”处输入柱子的最大耐高压,以保护柱子。单击OK,进入下一画面。 4、DAD检测器参数设定: 进入“DAD signals”画面,输入样品波长及其带宽、参比波长及其带宽(参比波长带宽默认值为100nm);选择Stoptime:as Pupm; 在“Spectrum”中输入采集光谱方式“store”:选All;如只进行正常检测,则可选None;范围Range:可选范围为190~950nm;步长Step可选2.0nm; 阀值:选择需要的灯; Peak width(Response time)即响应值应尽可能接近要测的窄峰峰宽,可选“2s”或4s; Slit-:狭窄缝,光谱分辨率高;宽时,噪音低。可选4nm

安捷伦1100及液相色谱仪的基本知识

安捷伦1100液相色谱仪各项性能指标 悬赏分:5|解决时间:2010-10-16 22:13|提问者:4329211 最佳答案 朋友,直接致电agilent的800-820-3278免费电话就可以得到Agilent的满意答复了 系列Agilent 1100泵系统 ●电子流控阀(EFC)控制的毛细液相泵系统,精度高、流速范围广柱流速范围:1-20ul/min;10-100ul/min(可选件) 0.001-2.5m1/min(EFC关闭状态) ●高压制备泵系统,单元或双元高压制备泵 流速范围:0.001-100m1/min ●分析型泵系统 流速范围: 单元泵:0.001-10m1/min 二元泵:0.001-5m1/min 四元泵:0.001-10m1/min 品种齐全的Agilent 1100系列进样系统 ●标准手动进样器(分析型或制备型) ●标准自动进样器 样品瓶容量:可达100个(2mlx100) 进样量:0.1-100ul(0.1-1800ul)可选件 ●微盘式自动进样器 样品瓶容量:2x96(孔板),2x386(孔板)或100x2ml 进样量:0.1-100ul(标准件) 0.1-1500ul可选件 ●微量标准自动进样器/微盘式自动进样器 进样量:0.01-8ul(标准);0.01-40ul(可选) ●恒温标准自动进样器/微盘式自动进样器 温度范围:4-40℃可设定步进1℃ ● 220型微孔板式自动进样器-组合化学样品管理系统 样品瓶容量:各种规格试管多达12个微孔板(96孔板,384孔板) 进样量:0.1-5ul;0.1-20ul Agilent 1100系列检测器 ●可变波长扫描紫外检测器(VWD) 波长范围:190?600nm ●多波长检测器(MWD)

HPLC原理和操作详解

H P L C原理和操作详解 Revised as of 23 November 2020

高效液相色谱 我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表: 鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多,因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。

I.概论 一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是:溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时,由于与固定相(stationary phase)发生作用(吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同,在固定相中滞留时间不同,从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特(Tswett)在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的,色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相,称为经典液相色谱法,此方法柱效低、时间长(常有几个小时)。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography,HPLC)是在经典液相色谱法的基础上,于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀,小颗粒具有高柱效,但会引起高阻力,需用高压输送流动相,故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid

Chromatography,HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography,HSLP)。也称现代液相色谱。 二、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点: 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速——流速为~ ml/min。 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点: 速度快——通常分析一个样品在15~30 min,有些样品甚至在5 min内即可完成。 分辨率高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 灵敏度高——紫外检测器可达,荧光和电化学检测器可达。 柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少,容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏,可以收集单一组分或做制备。 三、色谱法分类

高效液相色谱法基本知识

10 高效液相色谱法基本知识 (见第7章) u HPLC 法分类与定义 正相高效液相色谱法(NP-HPLC )——固定相极性大于流动相极性。常用色谱柱有硅 胶柱、氰基柱、氨基柱;流动相为烷烃加适量极性溶剂,如正己烷-异丙醇、正己烷-乙醇等。 主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物,如维生素 A 、维生素D 、维 生素 K 1 的含量测定。 反相高效液相色谱法(RP-HPLC )——流动相极性大于固定相极性。常用色谱柱为十 八烷基硅烷键合硅胶(ODS )柱;流动相主要成分为甲醇-水或乙腈-水(添加适量酸或缓冲 盐),用于大多数非极性、弱极性药物的分离分析。 v 系统适用性试验内容与要求 理论板数(n )=16(t R /W ) 2 或 n =5.54(t R /W h /2) 2 ,计算 n 时应指明测定物质。当 测定结果有异议时,应以峰宽(W )计算结果为准。 分离度(R ) W W t t R R 2 1 ) ( 2 1 2 + - = 或 ) ( 70 . 1 ) ( 2 2 / , 2 2 / , 1 1 2 h h R R W W t t R + - = ,一般要求待测组分与相邻共 存物之间的 R 应大于 1.5。当测定结果有异议时,应以峰宽(W )计算结果为准。 重复性:用于评价连续进样中,色谱系统响应值的重复性能。取同一溶液连续进样 5 次,其峰面积的相对标准偏差(RSD )应不大于 2.0%。 拖尾因子(T ) 1 05 . 0 2d W h = ,峰高法定量时 T 应在 0.95~1.05 之间。 w 测定方法 内标法:按规定,取被测物对照品和内标物质一定量,混合,配制成校正因子测定用的 对照溶液,注入高效液相色谱仪,记录色谱峰面积。根据对照溶液色谱图中对照品和内标物 质的峰面积或峰高,以及对照品和内标物的浓度,按下式计算校正因子(f ): 对 对 内 内 C A C A f / / = 另取被测物适量,加一定量内标溶液,混合,制成供试品溶液,注入高效液相色谱仪, 记录色谱峰面积。根据供试品溶液色谱图中待测成分和内标物质的峰面积或峰高,按下式计 算供试品溶液中待测成分的浓度( 样 C ): ' ' / 内 内 样 样 C A A f C ′ = 外标法:按规定,精密称取对照品和供试品,分别配制成溶液,注入高效液相色谱仪, 记录各自色谱图,测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积(或峰高),按下式计 算供试品溶液中待测成分的浓度( 样 C ): 对 样 对 样 A A C C =

HPLC基础知识.doc

被分离组分在柱中的洗脱原理 II基本概念和理论 一、基本概念和术语 1.色谱图和峰参数 十色谱图(chromatogram)一样品流经色谱柱和检测器,所得到的信号一时间曲线,又称色谱流出曲线(elution profile). 十基线(base line) 一流动相冲洗,柱与流动相达到平衡后,检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 十噪音(noise)——基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 十漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起,柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。 十色谱峰(peak)一组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。不对称色谱峰有两种:前延峰 (leading peak)和脱尾峰(tailing peak ).前者少见。 十拖尾因子(tailing factor,?) —T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)《中国药典》规定T应为0.95~1.05。 1X0.95为前延峰,T>1.05为拖尾峰。 十峰底——基线上峰的起点至终点的距离。 十峰高(Peak height, h) --- 峰的最高点至峰底的距离。 十峰宽(peak width, W) --峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=40o 十半峰宽(peak width at half-height, Wh/2) --峰高一半处的峰宽。W h/2 = 2. 355a0 十标准偏差(standard deviation, o) --正态分布曲线x=± 1 时(拐点)的峰宽之半。正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。。小,分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高;反之,。大,峰形胖、柱效低。 十峰面积(peak area, A) --- 峰与峰底所包围的面积。A=X (jxh = 2. 507ah=1.064Wh/2h 2.定性参数(保留值)

高效液相色谱基本常识

被分离组分在柱中的洗脱原理 Ⅱ基本概念和理论 一、基本概念和术语 1.色谱图和峰参数 ⊕色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器,所得到的信号-时间曲线,又称色谱流出曲线(elution profile). ⊕基线(base line)--流动相冲洗,柱与流动相达到平衡后,检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 ⊕噪音(noise)――基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 ⊕漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起,柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。 ⊕色谱峰(peak)--组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线(高斯Gauss曲线)。不对称色谱峰有两种:前延峰(leading peak)和脱尾峰(tailing peak ).前者少见。 ⊕拖尾因子(tailing factor,T)--T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)《中国药典》规定T应为0.95~1.05。T<0.95为前延峰,T>1.05为拖尾峰。 ⊕峰底――基线上峰的起点至终点的距离。 ⊕峰高(Peak height,h)――峰的最高点至峰底的距离。 ⊕峰宽(peak width,W)--峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。W=4σ。⊕半峰宽(peak width at half-height,Wh/2)--峰高一半处的峰宽。W h/2=2.355σ。 ⊕标准偏差(standard deviation, σ)--正态分布曲线x=±1时(拐点)的峰宽之半。正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。σ小,分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高;反之,σ大,峰形胖、柱效低。 ⊕峰面积(peak area,A)――峰与峰底所包围的面积。A=×σ×h=2.507σh=1.064Wh/2h 2.定性参数(保留值) ⊕死时间(dead time,t0)--不保留组分的保留时间。即流动相(溶剂)通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。 ⊕死体积(dead volume,V0)――由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分:进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙(被流动相占据,Vm)、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程,其他3部粉只起峰扩展作用。为防止峰扩展,这3部分体积应尽量减小。V0=F×t0(F为流速) ⊕保留时间(retention time,tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。⊕保留体积(retention volume,VR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR=F*tR . ⊕调整保留时间(adjusted retention time,tR’)--扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reduced retention time)。在实验条件(温度、固定相等)一定时,tR’只决定于组分的性质,因此,tR’(或tR)可用于定性。TR’=tR-t0 ⊕调整保留体积(adjusted retention volume,VR’)--扣除死体积后的保留体积。VR=VR-V0 或VR=F*tR’ 3.柱效参数 ⊕理论塔板数(theoretical plate number,N)用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。 N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布,N可近似表示为: N=(tR/σ)2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2 W:峰宽;σ:曲线拐点处峰宽的一半,即峰高0.607处峰宽的一半。 N为常量时,W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上,如果各组份含量相当,则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽,峰高则逐渐降低。 用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用,因为半峰宽更容易准确测定,尤其是对稍有拖尾的峰。

HPLC的常用术语及符

HPLC的常用术语及符号 第一部分色谱曲线 1、色谱图(chromatogram):色谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图,或者通过适当的方法观察到的纸色谱或薄层色谱斑点、谱带的分布图。 2、(色谱)峰(chromatographic peak):色谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。 3、峰底(peak base):峰的起点与终点之间的连接的直线(图1 中的CD)。 4、峰高(h ,peak height):色谱峰最大值点到峰底的距离(图1 中的BE)。 5、峰宽(W,peak width):在峰两侧拐点(图1 中的F ,G)处所作切线与峰底相交两点的距离(图1中的KL)。 6、半高峰宽(W h/2,peak withd at half height):通过峰高的中点作平行于峰底的直线,此直线与峰两侧相交两点之间的距离(图1 中的HJ)。 7、峰面积(A,peak area):峰与峰底之间的面积(图1中的CHEJDC)。 8、拖尾峰(tailing peak):后沿较前沿平缓的不对称的峰。 9、前伸峰(leading peak):前沿较后沿平缓的不对称的峰。(又叫伸舌峰、前延峰) 10、假峰(ghost peak):除组分正常产生的色谱峰外,由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰,即并非由试样所产生的峰。这种色谱峰并不代表具体某一组分,容易给定性、定量带来误差。(又叫鬼峰) 11、畸峰(distrorted peak):形状不对称的色谱峰,前伸峰、拖尾峰都属于这类。 12、反峰(negative peak):也称倒峰、负峰,即出峰的方向与通常的方向相反的色谱峰。 14、原点(origin):纸或薄层板上滴加试样部位的中心点(图2)。 15、斑点(spot):平面色谱法中,组分在展开和显谱后呈现近似圆形或椭圆形的色区(图2)。 16、区带(zone):在色谱柱、纸或薄层板上被分离组分所占的区域。 17、复斑(multiple spot):一种组分展开后形成两个或多个清晰斑点。 18、区带拖尾(zone tailing):由于物理、化学等作用的影响,一种组分在展开后形成的彗星形状斑点。

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