不同抗寒性的杜鹃品种叶片磷脂和脂肪酸组成差异性比较分析
第21卷第2期南 京 林 业 大 学 学 报V o l.21N o.2 1997年6月Journal of N anjing Fo restry U niversity Jun.1997
不同抗寒性的杜鹃品种叶片磷脂和
脂肪酸组成差异性比较分析3α
沈 漫
(南京林业大学林木遗传和基因工程林业部重点实验室 南京 210037)
摘 要 分析了杜鹃两个不同抗寒性的栽培品种毛白杜鹃(R hod od end ron m ucrona tum G.
Don)和西洋杜鹃(R1hy brid um Ho rt.)叶片磷脂的主要组分和脂肪酸组成。杜鹃叶膜磷脂主要是磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇脂(PE)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰肌醇(P I),脂肪酸组成主
要是棕榈酸(16 0)、反式232十六碳烯酸(16 1(t))、硬脂酸(18 0)、油酸(18 1)、亚油酸(18
2)、亚麻酸(18 3)。研究结果表明,叶片膜磷脂的脂肪酸不饱和度及磷脂酰甘油(PG)的饱和脂
肪酸水平均与品种抗寒性相关。抗寒品种毛白杜鹃具有较高的不饱和脂肪酸 饱和脂肪酸比值,其PG的饱和脂肪酸水平2[16 0+18 0+16 1(t)]低于不抗寒品种西洋杜鹃。
关键词 杜鹃;抗寒性;叶膜磷脂;磷脂酰甘油;脂肪酸
中图分类号 Q946;S722136
杜鹃为杜鹃花科(E ricaceae)植物,是我国著名的传统观赏花木之一,在我国有着极其丰富的种质资源,为使杜鹃广泛种植于我国南北庭园,选育耐寒的优良杂交品种成为目前杜鹃育种的主要任务之一。
在植物的抗寒性研究中发现,脂质特别是磷脂在生物膜结构中起着重要作用。有研究者提出的“PG 理论”近年来引起关注,该理论认为磷脂酰甘油(PG)较之总磷脂与植物的抗寒性的相关更为密切〔1〕。但“PG理论”还有待于在更多的树种研究中得以验证。本研究选择抗寒性差异大的木本植物杜鹃品种进行叶膜磷脂组分及其脂肪酸配比的测定,旨在寻求杜鹃抗寒育种中可靠的抗寒性诊断的生理指标,扩大优良杜鹃品种的露地栽培面积。
1 材料与方法
1.1 材料
按品种来源分类,毛白杜鹃(白花杜鹃)属毛鹃类,株型较高,抗寒性强,在长江流域可露地越冬;西洋杜鹃属西鹃类,体型矮小〔2〕,不耐寒,常作温室盆栽。
α收稿日期 1996211213 修改稿收到日期 1997204209
3国家自然科学基金资助项目
第一作者简介:沈漫,女,南京林业大学林木遗传与育种专业在读博士研究生。
毛白杜鹃(R hod od end ron m ucrona tum G.Don)采自南京林业大学校园,西洋杜鹃(R.hy brid um Ho rt.)来自江苏省林科所。1996年春季采集当年生新叶。鲜叶采集后,置100℃水中5m in,使叶片脂酶失活,然后提取叶脂。通过磷脂及其脂肪酸组成的测定,比较两品种间的差异。
1.2 方法
1.2.1 叶片膜磷脂提取
叶片膜磷脂的提取参照苏维埃方法进行〔3〕。磷脂组分的分离与纯化按M u rata方法〔4〕。含有PG的流份用自制20c m×20c m硅胶板(青岛海洋化工厂硅胶H)进行薄层层析,分离纯化PG。展开剂为氯仿 甲醇 丙酮 冰乙酸 水(50 10 20 15 5,V V)。
1.2.2 磷脂含量测定和磷脂组成的分析
定性用薄层色谱分析法,总极性脂经20c m×20c m硅胶H薄板层析,薄层厚度012～014mm,展开剂为氯仿 甲醇 氨水(10 5 015,V V),用钼显色剂喷雾显色,参照标样磷脂的R f值定性。定量用岛津CS-930薄层扫描仪进行薄层扫描的方法,测定波长ΚS=650nm,参比波长ΚR=480nm,狭缝013mm×110mm,扫描方式线性,扫描速度40mm m in,记录速度20mm m in。
1.2.3 脂肪酸组成的分析
磷脂和PG脂肪酸组成分析参照M u rata〔4〕和H u〔5〕方法,直接甲酯化,用气相色谱法分析其脂肪酸组成。气相色谱条件:H P5890A色谱仪,氢火焰离子化检测器(F I D),DB2FFA P石英毛细管柱(30m×0.32mm id,J&W Scien tific),进样温度220℃,柱温升温程序:100℃保持1m in后,以3℃ m in升至170℃,再以1℃ m in升至200℃。载气为氮气,流速20c m3 m in,分流比30 1。以样品保留时间定性,归一化法定量。
2 结果与讨论
2.1 杜鹃叶膜磷脂组成
杜鹃叶膜磷脂主要是PC、PE、PG和P I。其中PC含量最多,约49%。其次是PE,占24%～25%。PG和P I含量较少。抗寒性不同的杜鹃品种叶膜磷脂成分基本相同,总磷脂与抗寒性之间未发现相关性(表1)。
表1 杜鹃叶片磷脂组成(摩尔分数)
Table1 Phospholip id co m position fro m leaf of azalea 品 种P I PC PE PG
毛白杜鹃10157491102413416101
西洋杜鹃9182481572511216150
王洪春等在水稻干胚膜脂组分与抗冷性研究中指出,抗冷性强的品种干胚膜脂中含PE和P I比不抗冷的水稻品种分别高17%和28%,而D e L a Roche等在抗寒性不同的小麦品种间并未观察到磷脂组分上的差异〔6〕。在本研究中,比较抗寒性不同的杜鹃品种叶膜磷脂,如表1所示,毛白杜鹃的P I和PC含量分别比西洋杜鹃高8%和1%,PE和PG含量比西洋杜鹃分别低3%,亦没有发现二者存在显著差异。因膜脂种类与植物抗寒性的研究资料尚少,目前对其在植物抗寒性方面的作用还难以作任何结论。
2.2 杜鹃叶片磷脂脂肪酸组成
杜鹃叶膜磷脂的脂肪酸主要是16 0、16 1(t)、18 0、18 1、18 2和18 3。不同抗寒性的杜鹃品种叶磷脂脂肪酸组成相同,其中以18 3为最大组分,含量占32%以上,三个主要成分18 3、18 2和16 0的含量占脂肪酸总量的78%～81%。毛白杜鹃和西洋杜鹃叶磷脂的脂肪酸配比差异较大,主要反映在18 1和18 2的含量上。虽然毛白杜鹃的18 3含量(32104%)比西洋杜鹃的18 3含量(38108%)低16%,但毛白杜鹃的18 1和18 2含量却比西洋杜鹃分别高113%和50%,使毛白杜鹃叶磷脂的不饱和脂肪酸总量2(18 1+ 18 2+18 3)比西洋杜鹃的高17%(表2)。
研究认为,在植物磷脂中,饱和脂肪酸一般只占总脂肪酸的30%左右,其中以16 0占绝大多数。叶绿体片层结构的极性脂中含较多的不饱和脂肪酸,以18 3为主,三种不饱和脂肪酸18 1、18 2、和18 3在不同植物的同一部分、在不同环境条件下生长的同种植物中都会有很大的差异,这就造成了不同抗寒性的 1997年 总第72期 沈 漫:不同抗寒性的杜鹃品种叶片磷脂和脂肪酸组成差异性比较分析
植物脂肪酸总的不饱和度的变化,而这种变化与植物对环境的适应性有关〔6〕。
表2 杜鹃叶片总磷脂脂肪酸组成3
Table2 Fatty ac id co m position of tot al phospholip id fro m leaf of azalea
品 种
脂肪酸组成(摩尔分数)
16 016 1(t)18 018 118 218 3
比 率
2U 2S
脂肪酸不饱和指数
I U FA
毛白杜鹃20197315431121419925134321042162161179
西洋杜鹃2516991512182710316188381081163155103
注:I U FA=[(18 1)摩尔分数+(18 2)摩尔分数×2+(18 3)摩尔分数×3]×100;
2U 2S=2(18 1+18 2+18 3) 2[16 0+18 0+16 1(3t)],指不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸之比
2.3 杜鹃叶片磷脂脂肪酸不饱和度与抗寒性的关系
由表2可知抗寒品种毛白杜鹃与不抗寒品种西洋杜鹃的磷脂脂肪酸不饱度明显不同。从不饱和脂肪酸指数上看,毛白杜鹃和西洋杜鹃的I U FA分别为161179和155103,从不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比率上看,毛白杜鹃的不饱和脂肪酸总量较高,为饱和脂肪酸总量的216倍,而不耐寒的西洋杜鹃的2U 2S只有116,比毛白杜鹃低38%。
2.4 杜鹃叶片PG与抗寒性的关系
在表3中,比较了毛白杜鹃和西洋杜鹃叶片PG脂肪酸。杜鹃叶PG含16 0、18 0、18 1、18 2、18 3和一种特殊的脂肪酸16 1(t)。在西洋杜鹃叶PG中,16 0是含量最高的脂肪酸,为38182%,在毛白杜鹃叶片PG中,16 0,约20%。两个品种PG的单个脂肪酸相对含量似乎与抗寒性之间并不相关。毛白杜鹃PG中,饱和脂肪酸(16 0+18 0)含量为31163%,低于西洋杜鹃PG(42167%)。相反,毛白杜鹃PG的不饱和脂肪酸之和2U却比西洋杜鹃PG的2U高出10169%(表3)。这可能也是前者比较耐寒的综合因素之一。
表3 杜鹃叶片PG的脂肪酸组成
Table3 Fatty ac id co m position of PG fro m leat of azalea
品 种
脂肪酸组成(摩尔分数)
16 016 1(t)18 018 118 218 3
饱和脂肪酸水平
2[16 0+16 1(t)+18 0]
毛白杜鹃20109101791115418142241731414442142
西洋杜鹃38182515631851114071353312848123
不饱和脂肪酸16 1(t)的结构和所结合脂类上的位点都很特殊,它的物理特征非常相似于那些饱和脂肪酸〔4〕。当把16 1(t)作为饱和脂肪酸计算时,发现毛白杜鹃的饱和脂肪酸水平2[16 0+18 0+16 1 (t)]为42142%,低于西洋杜鹃(48123%)。饱和脂肪酸水平与品种抗寒性之间存在相关性,抗寒性强的杜鹃具有较低的饱和脂肪酸水平。
PG是叶绿体膜的主要磷脂组分,具有较多的饱和脂肪酸。一些原产热带或亚热带的植物遭受冷害的原初反应可能是由于PG发生相变所致,PG及其脂肪酸饱和程度与植物抗寒(冷)性密切相关。在叶绿体酶系统中,决定PG饱和脂肪酸水平关系到甘油-3-磷酸酰基转移酶对18 1或16 0脂肪酸的选择性酰化作用〔4〕。表3数据表明,2[16 0+16 1(t)]含量与抗寒性有关,毛白杜鹃PG的2[16 0+16 1(t)]为30188%,西洋杜鹃PG为44138%,明显高于毛白杜鹃PG。
3 讨 论
从杜鹃叶片磷脂的研究结果来看,磷脂酰甘油的脂肪酸组成比总磷脂脂肪酸组成与植物抗寒性之间存在着更密切的相关性。植物的膜脂脂肪酸不饱和度和PG的饱和脂肪酸水平可作为抗寒性鉴别的较为可靠的生理指标。
研究植物的抗寒性发现,低温有利于不饱和脂肪酸的形成。许多植物对低温反应的一种重要表现就是增加不饱和脂肪酸在总脂肪酸中的比例〔6〕。在本研究中,亦发现毛白杜鹃之所以具有较高的I U FA,与18 1和18 2的相对含量明显高于西洋杜鹃有关。从遗传起源上看,毛白杜鹃原产我国湖北和浙江,较 南 京 林 业 大 学 学 报 第21卷 第2期
1997年 总第72期 沈 漫:不同抗寒性的杜鹃品种叶片磷脂和脂肪酸组成差异性比较分析
抗寒;西洋杜鹃系皋月杜鹃(R.ind icum Sw eet)、映山红(R.si m sii P lanch)及毛白杜鹃等反复杂交而成,在比利时、荷兰及我国浙江沿海地区广泛种植,适应温和的气候条件〔2〕,虽然西洋杜鹃获得了亲本的一定耐寒遗传特性,但总的来说仍是长期作为温室栽培。可以推测抗寒性强的毛白杜鹃之所以具有较高的脂肪酸不饱和度和较低的PG饱和脂肪酸水平,原因可能主要有两个:一是植物本身具有较多的不饱和脂肪酸,这是由植物长期适应一定的环境条件所形成的遗传特性所决定的;另一个是在长期适应环境条件过程中,抗寒植物较之不抗寒植物能迅速合成更多的不饱和脂肪酸以适应低温的生理需要。
植物的脂肪酸不饱和度除了主要决定于植物的遗传特性外,外界的温度条件也能在遗传特性控制的前提下对植物的脂肪酸不饱和度产生影响,因此可以通过抗寒锻炼和低温驯化的途径来提高植物的抗寒力。
致 谢 本文得到胡兹苓教授、黄敏仁教授及汪安琳教授的指导和审阅,特此致谢。
参 考 文 献
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THE COM PAR IS ONS AND ANALY SES OF D IFFERENCES IN COM POSI-T I ON OF PHOSPHOL IP I D S AND FATT Y AC I D S FROM THE L EAF OF
D IFFERENT CH I LL ING-RESISTANT VAR IET IES OF AZAL EA
Shen M an
(Fo rest T ree Genetics and Genetic Engineering Key L abo rato ry of the M in istry
of Fo restry N an jing Fo restry U n iversity N an jing 210037)
Abstract T he fatty acid com po siti on s in pho sp ho li p ids iso lated from the leaves of tw o varieties of aza2 lea w ith differen t ch illing2resistance w ere investigated.T he tw o varieties of azalea w ere R hod od en d ron m ucrona tum G.Don and R.hy brid um Ho rt.In the leaf pho sph li p ids of azalea,the m ajo r pho s2 p ho li p ids classes w ere pho sphatidyl2cho line(PC),pho sp hatidyl2ethan lam ine(PE),pho sphatidyl2 glycero l(PG)and p ho sphatidyl2ino stito l(P I).T he fatty acid com po siti on s w ere16 0,16 1(t),18 0,18 1,18 2and18 3.T he resu lts show ed that bo th the degree of un satu rated fatty acid in leaf p ho sp ho li p ids and thd level of satu rated fatty acid in PG w ere related to the ch illing2resistance.T he rati o of the un satu rated the satu rated in the leaf pho spho li p ids from ch illing2resistan t variety Snow A zalea w as h igher and the level of satu rated fatty acids2[16 0+18 0+16 1(t)]of PG from it w as low er than tho se of R.hy brid um Ho rt.
Key words A zalea;Ch illing2resistance;L eaf p ho spho li p ids;Pho sphatidyl2glycero l;Fatty acids
(责任编辑 郑琰炎炎)
磷脂脂肪酸
磷脂脂肪酸- 简介 目前已发现磷脂物质有1000多种，依极性强弱可分为：磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid ，PLFAs）、糖脂脂肪酸（glycolipid fatty acids，GLFAs）、中性脂肪酸（Neutral lipid fatty acids，NLFAs）。磷脂脂肪酸是微生物细胞膜主要成分，是由甘油酸第三位羟基被磷酸、其它羟基为脂肪酸酯化而成，其磷酸基部分称为极性头部，两条碳氢链成为非极性尾部。 脂肪酸通常被分成6类:直链、直链顺单烯(cis2) 、直链反单烯(tran2) 、支链饱和、环状及多烯脂肪酸(这些脂肪酸优先与磷脂甘油骨架中间C原子键合) 。脂肪酸经甲酯化后形成脂肪酸甲酯(Fattyacidmethyl esters, FAMEs) ,它们又可分为:羟基取代的FAMEs (OHFAMEs) ;酯连接羟基取代的FAMEs (EL2OHFAMEs) ;非酯连接羟基取代AMEs(NEL2NYFAMEs) ;饱和FAMEs (SAFAMEs) ; 单不饱和FAMEs (MUFAMEs) ;酯连接多聚不饱和FAMEs (PUFAMEs) ;非酯连接不饱和FAMEs (UNSFAMEs)。 不同种类PLFAs常以一系列C原子数目与希腊字母表示。比如,16∶1ω7t 指的是含有“16个C原子P一个双键P双键距甲基(ω)端7个C原子P反式构型”脂肪酸;也可将不饱和程度置于Δx之后,x代表距羧基端(Δ)最近的双键位置。脂肪酸构型可用简单符号表示,如顺式(cis)2(双键两侧2H在同侧)与反式(trans)2(双键两侧2H键在异侧)分别用c2与t2表示;a2与i2代表异型(anteiso)2(甲基在C末端第3位C原子上)和同型2(iso2)(甲基在C末端第二位碳原子上) ;br2表示未知甲基支链的位置;ME2前的数字代表甲基取代基团距分子羧基端C原子数;cy2代表了环丙烷脂肪酸;α2与β2代表羟基脂肪酸的2OH分别在第2、3位C原子上。 磷脂脂肪酸- 应用 PLFAs是几乎所有活体细胞膜的主要成分,周转速率极快且随细胞死亡而迅速降解,脂肪酸结构与种类多样,对环境因素敏感,分析结果重复性较好。既可用简单试剂和设备测定由PLFAs转化的磷酸盐以确定微生物总量,也可以根据不同菌群的特定脂肪酸C链长度、饱和度及羟基等取代基位置差异研究特殊功能菌群。在微生物定量及活力测定方面,PLFAs与微生物量C、底物诱导呼吸(SIR)及ATP等测定方法所得结果十分吻合。因此,PLFAs在土壤微生物学研究中极具潜力。 对PLFAs的鉴定通常用MIDI系统(Microbial IdentificationSystem) 、气质联机(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)和液质联机等方法(High Performance LiquidChromatography2Electrospray Ionization2MassSpectrometry,HPLC2ESI2MS)鉴定PLFAs。通常,分析PLFAs有以下两个途径和目的:①分析单一菌种组成以便比较或评价不同菌种特征性磷脂,提高PLFAs数据库的多项分类能力; ②分析自然环境或实验室中培养的个别微生物类群磷脂成分,研究特定功能菌群结构变化和代谢途径。目前,PLFAs技术已被用于细菌纯培养对外界胁迫的应答、根系排泄物对根际微生物影响、养分对泡囊丛枝菌的影响、农田土壤微生物区系特征以及诱导植物抗病性等领域。
磷脂的提取与分析检测技术_王道营
磷脂的提取与分析检测技术 王道营 徐幸莲 徐为民 (南京农业大学食品科技学院) 【摘 要】磷脂的提取方法主要是萃取法;总含量的测定方法有称重法、比色法、紫外分光光度法等;磷脂不同组分的分离和测定方法有T LC、HPLC和31P-NM R等;利用RP-HPLC和GC可以对磷脂的脂肪酸的组成分析测定;使用HPLC、GC等和M S的联合使用可以对磷脂分子量及分子结构进行分析。本文分别对上述5个方面进行综述,并对不同方法的特点进行了初步探讨。 【关键词】磷脂;组分;脂肪酸组成;分子结构;分析检测 中图分类号:TS224.4 文献标识码:A 文章编号:1009-1807(2005)07-0051-04 磷脂是一类存在于生物界的含磷脂肪物质。在植物的种子、动物血液和脏器、蛋黄及细菌中与油脂并存,是构成细胞基本结构的必需物质,对维持细胞的通透性和细胞内氧的传递起重要作用。磷脂可分为3大类:糖基甘油二酯、神经鞘磷脂(SM)和磷酸甘油酯(PL)。磷酸甘油酯又可分为酯磷脂和醚磷脂,醚磷脂包括胆碱缩醛磷脂和乙醇胺缩醛磷脂,通常所说的磷脂就是指酯磷脂。酯磷脂主要包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酸(PA)、二磷脂酰甘油(DPG)以及N-乙酰基-磷脂酰乙醇胺(NAPE)等。一种磷脂就是多种磷脂分子组成的混合物,这造成了磷脂分离和定量上的困难。本文就磷脂的提取和分析检测技术作一综述。 1 磷脂提取 常用的提取方法可归纳为两大类:一是物理萃取法,即用超临界流体技术(SFE-CO 2 ),这是一种新型的分离技术,其操作简单,萃取纯度较高;二是化学萃取法,即用氯仿、甲醇、丙酮、乙醚、乙醇等有机溶剂反复萃取,其操作步骤较复杂。原料不同,所采用的提取方法也不同。对于一些粗磷脂产品可以直接取样进行分析;对于大豆油、菜籽油等植物油类样品可采用丙酮沉淀法获取磷脂;对于大豆、动物组织等固体类样品,要先提取样品中的粗脂肪,然后对其进行分离获取磷脂。如章建浩等人对金华火腿的肌间脂质成分的分析,取股二头肌根据Folc h.J等人方法提取脂质,然后用氨丙基硅柱分离,用2%乙酸-乙醚(W/ W)溶液洗出游离脂肪酸,用甲醇洗出磷脂。由于磷脂的结构组成比较复杂,采用一种方法可能对某种磷脂的提取效果好但对另一种的提取效果却很差,因此在分析检测之前必须根据分析目的、分析条件等选择合适的提取方法。 2 磷脂总含量的测定方法 2.1 称量法 称量法有两种:一种是将磷脂混合物用浓硫酸和浓硝酸混合物分解,使磷变成正磷酸根离子,再将后者转化成为磷钼酸铵沉淀称量;另一种方法是利用油脂溶于丙酮,而磷脂不溶于丙酮的性质,用丙酮萃取样品,除去油脂,烘干残留物,称量即得磷脂含量,这种方法主要适用于植物油脂中磷脂总量的测定,其优点是操作简单,但其测定值并非磷脂真实值。 2.2 比色法 比色法有钼蓝比色法、硫氰亚铁胺比色法和酶法比色法之分,三者在磷脂检测上均有应用。钼蓝比色法是将样品与金属氧化物灰化,试样中的磷变为磷酸盐,加酸溶解而得磷酸根,在加入钼酸盐后生成磷钼酸盐,磷钼酸盐被还原而产生钼蓝,其颜色深浅与磷脂含量成正比关系,由此可进行比色定量。该法容易受样品中无机磷的影响,而使测定值偏高。高氯酸-浓硫酸-钼锑抗比色法也有报道,它是在钼蓝比色法的基础上发展而来的,由于用强酸消化使分析时间大大缩短,同时用2,6-二硝基酚作酸碱指示
(4页)长链脂肪酸(油脂,脂肪酸)对厌氧微生物的抑制
油脂，脂肪酸，脂类 贺延龄—P86 2.长链脂肪酸（LCFA） 长链脂肪酸在厌氧过程中并不总能完全溶解，低的PH值和Ca2+能引起沉淀反应。此外，长链脂肪酸被吸附到厌氧污泥的表面（加入Ca2+沉淀LCFA——解毒）。 贺延龄——含脂类废水的厌氧处理 许多废水中含有脂肪类物质，这些物质在高速厌氧反应器中常因以下两种现象而破坏废水处理的稳定性： 污泥常被漂浮的油脂包裹而上浮，从而引起污泥流失 长链脂肪酸的毒性较强，常引起严重的抑制 以含动植物油脂为原料的工业废水含有的脂肪类物质主要有长链脂肪酸（LCFA）和直链的多元醇（甘油三酸脂，磷脂等）和它们的降解产物。这些脂肪类物质是可以生物降解的，但它们会使厌氧和好氧生物处理产生许多问题。 纺织工业废水（以棉花为原料）则含有蜡以及环状醇与带有分支的链状脂肪酸所成的酸，因此较难生物降解。 因为脂类在厌氧反应器中（或者其他生物处理系统中）降解很慢，需要相当长的停留时间，且容易上浮。 简单的物化方法不能去除废水中乳化了的脂类物质，因此，在应用物理方法（重力分离，上浮，过滤）处理后仍会有大量脂类存在于废水中。 脂类在厌氧处理过程中可分为三阶段：（1）脂的分解，即长链脂肪酸和醇之间的酯键断裂，从而将脂类分解为长链脂肪酸（LCFA）和多元醇（2）LCFA和醇的降解，其结果产生乙酸，CO2和氢气（3）将乙酸，CO2和氢气转化为甲烷的甲烷化。 脂的分解通常不是厌氧处理中限速的一步。整个厌氧过程中主要受LCFA降解或者这些脂肪酸的溶解与传质的制约。LCFA并不总能完全溶解，在较低PH值或含ca2+环境中它容易沉淀。它也不易于被吸附到污泥的表面。 LCFA对微生物有毒，特别是对革兰氏阳性菌有毒。革兰氏阴性菌的细胞壁含有的脂多糖则在一定程度上对细胞起保护作用。革兰氏阳性菌则对LCFA特别敏感。因为大多数产甲烷菌的细胞壁组成与革兰氏阳性菌类似，所以产甲烷对LCFA是相当敏感的。 带有12-14个碳原子的饱和脂肪酸和带有18个碳的不饱和脂肪酸通常被认为是抑制性是最强的。不饱和脂肪酸的毒性随着双键数目增加，而且他们的顺式结构比与之对应的反式异构体毒性更强。 大多数研究者认为LCFA抑制微生物生长的机理是由于（1）LCFA改变细胞膜的通透性（2）LCFA影响细胞壁的表面张力从而影响细胞的分裂（3）不确定的化学过程的影响。 尽管LCFA的降解很缓慢，但它能够在厌氧条件下降解，一旦这种降解发生，LCFA的毒性会减轻。妨碍LCFA降解的因素会增加LCFA的抑制作用，例如乙酸加入LCFA废水中即会发生这种情况。加入反应器的废水应当尽快混合，这样一方面降低浓度过大的危险，一方面促进其降解。 据研究，过高的LCFA浓度将会使厌氧菌死亡。一旦污泥活力降低太严重，可使得系统因出现酸化而运行失败，则反应器中的污泥应当全部更换，否则需要几个月恢复其原有活力。克服LCFA的抑制作用及污泥上浮和洗出将是厌氧处理含脂类废水的关键所在。 1.厌氧消化过程抑制因素的研究进展
代谢综合征患者血清磷脂脂肪酸谱与胰岛素抵抗
代谢综合征患者血清磷脂脂肪酸谱与胰岛素抵抗 朱麒钱楼大钧茅小燕张爱珍李铎 ［摘要］目的研究代谢综合征患者血清磷脂脂肪酸谱与胰岛素抵抗的关系。方法41例代谢综合征患者和50例健康对照者用高效气相色谱法测定血清磷脂脂肪酸谱，HOMA－IR评价IR。结果代谢综合征组的C16:0、C16:1、C18:0、饱和脂肪酸（SFA）、n-6多不饱和脂肪酸（PUFA）/n-3 PUFA较健康对照组显著升高(P＜0.05),C18:2n-6、C18:3n-3、C22:2n-6、C24:1、C22:6n-3、PUFA、PUFA/SFA、n-6 PUFA、n-3PUFA较健康对照组显著降低(P＜0.05)。Spearman相关性分析显示FBG、HbA1c与C20:3n-6呈显著负相关，FINS与C18:0、BMI 呈显著正相关，与C20:4n-6、PUFA、PUFA/SFA呈显著负相关，HOMA-IR与BMI、n-6PUFA /n-3PUFA呈显著正相关，与C20:4n-6、C20:5n-3、n-3PUFA呈显著负相关，BMI与C16:1、SFA、n-6PUFA /n-3PUF呈显著正相关，与C20:5n-3、C20:6n-3、PUFA、n-3PUFA、PUFA/SFA 呈显著负相关。结论代谢综合征患者SFA明显高于健康对照，PUFA则明显低于健康对照。PUFA与胰岛素抵抗负相关。代谢综合征患者应减少SFA的摄入，注意补充PUFA。Serum phospholipid fatty acid and insulin resistance in patients with metabolic syndrome ZHU Qi-qian*, LOU Da-jun MAO Xiao-yan, ZHANG Ai-zhen, LI Duo. * Department of Endocrinology, Shaoxin People’s Hospital, Shaoxin 312000 【Abstract】Objective To investigate the serum phospholipid fatty acid and its relationship with insulin resistance in patients with metabolic syndrome (MS). Methods Serum phospholipid fatty acid profile was analyzed with capillary gas chromatography. Insulin resistance was assessed by homeostasis model assessment(HOMA-IR). Results The percentage of fatty acids (C16:0, C16:1, C18:0), saturated fatty acid (SFA) and the ratio of n-6 polyunsaturated fatty acid (PUFA) to n-3 PUFA were higher in MS than those in normal control group (NC). But the percentage of fatty acids (C18:2n-6, C18:3n-3、C22:2n-6、C24:1、C22:6n-3、PUFA、n-6 PUFA、n-3PUFA) and the ratio of PUFA to SFA were lower in MS group than those in NC group.There were negative correlations between FBG、HbA1c andC20:3n-6; FINS were positively correlated with C18:0、BMI, but negatively correlated with C20:4n-6、PUFA、PUFA/SFA; HOMA-IR were positively correlated with BMI、n-6PUFA /n-3PUFA, but negatively correlated with C20:4n-6、C20:5n-3、n-3PUFA; BMI were positively correlated with C16:1、SFA、n-6PUFA /n-3PUF，but negatively correlated with C20:5n-3、C20:6n-3、PUFA、n-3PUFA、PUFA/SFA. Conclusion Serum phospholipid SFA in MS group were significantly higher than those of normal control group, but polyunsaturated fatty acid in MS group were significantly lower than those of normal control group. PUFA were negatively correlated insulin resistance in MS. 【Keywords】phospholipid fatty acid, Metabolic syndrome, Insulin resistance 代谢综合征（+MS）是多种代谢异常同时发生于同一个体的临床现象，可明显增加心血管疾病的危险性，胰岛素抵抗是多种代谢异常的共同发病基础。研究发现膳食脂肪是影响代谢综合征的重要危险因素，但不同种类的脂肪酸对胰岛素敏感性的影响不同［1，2］。因血清、血浆磷脂脂肪酸是反映膳食脂肪酸类型和量的稳定而可靠的指标［3］。本实验对代谢综合征患____________________ 作者单位：312000 绍兴市人民医院内分泌代谢科（朱麒钱楼大钧）浙江大学医学院（茅小燕张爱珍）浙江大学食品科学与营养系（李铎） 者和健康人的血清磷脂脂肪酸谱进行比较，并分析其与胰岛素抵抗（IR）之间的相关性，研究脂肪酸与代谢综合征和胰岛素抵抗之间的关系。
磷脂脂肪酸提取
磷脂脂肪酸分析 实验原理： 磷脂脂肪酸是几乎所有活体细胞膜的主要成分，周转速率快且随细胞死亡而迅速降解，脂肪酸结构与种类多样，对环境因素敏感，分析结果重复性较好。 目前已发现的磷脂物质有1000多种。依据极性有强到弱，磷脂可分为磷脂脂肪酸、糖脂脂肪酸和中性脂肪酸。脂肪酸通常被分为6类，直链顺单烯（cis-）、直链反单烯（tran-）、支链饱和、环状及多烯脂肪酸。脂肪酸经甲酯化后形成脂肪酸甲酯（FAMEs），它们又可分为：羟基取代的FAMEs；酯连接羟基取代的FAMEs；非酯连接羟基取代FAMEs；饱和FAMEs；单不饱和FAMEs；酯连接多聚不饱和FAMEs；非酯连接不饱和FAMEs。 仪器及设备 气相色谱、MIDI软件数据库、氮吹仪、固相萃取装置、通风橱、离心机、离心管（Teflon 盖子），试管（Teflon衬垫）、移液管、SPE硅胶柱（6ml），高纯氮气，一次性吸管，水浴锅试剂 柠檬酸缓冲液：柠檬酸3.75g，柠檬酸钠4.41g，用蒸馏水定容至100ml。 甲醇、氯仿、盐酸、丙酮、氢氧化钠、正己烷、甲基叔丁基醚(HPLC级) 试剂1 皂化试剂 氢氧化钠45.0gm 甲醇(HPLC级) 150.0ml 蒸馏水150.0ml 试剂2 甲基化作用试剂: 6N 盐酸325.0ml 甲醇275.0ml 试剂3 抽提溶剂: 正己烷(HPLC级) 200.0ml 甲基特丁醚(HPLC级) 200.0ml 试剂4 洗脱液 氢氧化钠10.80gm 蒸馏水900.00ml 实验步骤： 1、称取2g新鲜土壤于50ml离心管，加入12ml提取液（甲醇:氯仿:柠檬酸缓冲液=2:1:0.8=6.3:3.2:2.5ml）（在加入过程中会有机无机发生分层，建议分别加入），涡旋振荡1min，然后室温下往复式振荡2h，静止10min。 2、室温下5000rpm离心10min，上清转入分液漏斗。 3、再加10ml提取液于离心管（甲醇:氯仿:柠檬酸缓冲液=2:1:0.8=5.3:2.6:2.1ml），涡旋振荡1min，然后室温下往复式振荡30min，静止10min。 4、室温下5000rpm离心10min，上清转入分液漏斗，两次上清合并。 5、分液漏斗中加入氯仿5.8ml和柠檬酸缓冲液5.8ml，振荡1min，静止约1h，将下层转入另一收集管，置于50℃水浴，用氮气吹干。然后再加入2ml氯仿，在50℃水浴中用氮气吹干。样品置于-20℃保存。 6、把硅胶柱放置在固相萃取装置上，用5ml氯仿预洗脱柱子后，用收集管中加3×0.5ml氯仿溶解样品，并转移到SPE萃取，然后分三次加入20ml丙酮，弃掉洗脱液。再分两次加入甲醇12ml，收集含PLFA的洗脱液。在50℃水浴中用氮气吹干。
水稻植株及其内生微生物磷脂脂肪酸生物标记异质性
水稻植株及其内生微生物磷脂脂肪酸生物标记异质 性 胡桂萍，刘波*，郑雪芳，张建福，谢华安* (福建省农业科学院，福州市，350003) 摘要：【研究目的】水稻植株和水稻内生微生物体内都含有大量的磷脂脂肪酸，利用磷脂脂肪酸分析水稻内生微生物时，内生微生物磷脂脂肪酸样本提取是连同植物体一起研磨，磷脂脂肪酸含量包含着来源于植物和微生物磷脂脂肪酸，本研究主要目的就是通过水稻组培苗磷脂脂肪酸的分析，排除植株体磷脂脂肪酸对其内生微生物的磷脂脂肪酸的干扰。【方法】试验以兴优制5、兴优HK02、准优HK05、准优航653和水稻组培苗为材料，采用改良磷脂脂肪酸法分析水稻植物自身磷脂脂肪酸和其内生微生物磷脂脂肪酸生物标记异质性。【结果】试验结果表明，水稻植株和其内生微生物共有磷脂脂肪酸有直链磷脂脂肪酸20:0、12:0、16:0、18:0和支链磷脂脂肪酸如18:3ω6с(6,9,12)、19:0 CYCLOω8с、15:1ω6с等，且共有磷脂脂肪酸在水稻中含量均低于30mg/g，共有磷脂脂肪酸在内生微生物中的含量高于30mg/g。水稻内生微生物独有磷脂脂肪酸主要为支链磷脂脂肪酸，如甲基磷脂脂肪酸，羟基磷脂脂肪酸等，共有22种如i20:0、20:1 ω9с、12:0 3OH等，含量差异很大，为0.91mg/g-11481.25mg/g。对水稻内生微生物独有磷脂脂肪酸进行对应分析CA得到，遗传距离近的水稻品种其对应距离也近，CA载荷图显示内生微生物磷脂脂肪酸对应距离小于2的为多元分布，即该磷脂脂肪酸分布在多个水稻品种中；大于2的为单一分布，即仅在特定的水稻品种中分布。【结论】水稻植株及其内生微生物磷脂脂肪酸有异质性。水稻植株和其内生微生物共有磷脂脂肪酸在水稻中含量均低于30mg/g，在内生微生物中的含量高于30mg/g。内生微生物独有磷脂脂肪酸主要为支链磷脂脂肪酸，有单一和多元分布两种，并与水稻品种遗传有关。 关键词：水稻；组培苗；内生微生物；磷脂脂肪酸；异质性 Heterogeneity of fatty acids contained in the plants from rice and their endophytes HU Gui-ping, LIU Bo *, ZHENG Xue-fang, ZHANG Jian-fu, XIE Hua-an * （Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou, 350003, P. R. China） Abstract: 【OBJECTIVE】The fatty acids were existed both in the rice plant and the rice endophytes. The research aim was to distinguish the fatty acids in the rice endophtes from that in the rice plant.【METHOD】The distribution characteristics of fatty acids contained in the plants from rice and their endophytes were analysised by the modified detecting method with four hybrid rices named in xingyouzhi5、xingyouHK02、zhunyouHK05、zhunyouhang653 and a rice tissue culture plantlet as a control.【RESULTS】The results revealed that fatty acids of straight chain fatty acid such as 20:0、12:0、16:0、18:0 and unsaturated fatty acids such as 18:3ω6с(6,9,12)、19:0 CYCLOω8с、a17:0、i16:1 H、16:0 N ALCOHOL、15:1ω6с、i15:0 3OH were found both in the rice plants and the rice endophytes, however, the amounts of the fatty acid in the rice plant were all less than 30mg/g compared to that of more than 30mg/g in the rice endophytes. The other 22 fatty acids including iso-, anteiso-, methyl- branched and hydroxy fatty acids etc. were only detected in the rice endophyes, for example i20:0、20:1 ω9с、12:0 3OH, the amounts of them were arranged from 0.91mg/g-11481.25mg/g 收稿日期： 基金项目：国家863项目“高产优质多抗水稻分子品种创制”（2006AA100101），国家863项目“农作物重大病害多功能广谱生防菌剂研究和创制”（2006AA10A211）；福建省财政专项－福建省农业科学院科技创新团队建设基金(STIF－Y03)。 作者简介：胡桂萍，硕士，从事微生物物质分析研究，E-mail:hugp_2007@https://www.wendangku.net/doc/507366178.html, 通讯作者：刘波，博士、研究员，从事微生物生物技术与农业生物药物研究，E-mail:fzliubo@https://www.wendangku.net/doc/507366178.html, 谢华安，研究员/中国科学院院士，从事水稻遗传育种研究，E-mail:huaanxie@https://www.wendangku.net/doc/507366178.html,
磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图分析技术
微生物生态学的研究方法 ——磷脂脂肪酸分析（PLFA）【内容摘要】定量描述微生物群落是微生物生态学的难题之一。应用传统的微 生物培养方法和显微技术, 需要在选择性培养基上培养微生物, 即首先从环境样 品中分离出纯菌株, 再对该菌株进行一系列的生理生化分析。文章综述了磷脂脂 肪酸谱图分析法在微生物生态研究中的应用，包括估算微生物生物量、确定群落 结构、指示特定微生物，指示生理和营养状况等，并指出此种方法存在的问题及 改进方法。 【关键词】磷酸脂肪酸微生物生态学应用及发展 一、引言： 环境中微生物的种类和数量是及其丰富的[1]，微生物能把有机质作为营养源转化为组成物质和能量，它们在环境治理过程中扮演着极其重要的作用。分离和鉴定处理系统中的优势菌，了解特定环境下微生物群落的种群分布、遗传多样性及其动态变化规律和认识微生物群落的稳定性及功能菌的作用，是环境微生物学研究的重要内容。传统的微生物鉴定和群分析方法建立在微生物纯种培养分离基础上，但自然环境中有 99%以上的微生物还不能通过人工培养，在微生物的分析和研究工作中具有很大的局限性。 二、正文： 1．磷脂脂肪酸(PLFAs)谱图分析技术概述 1.1 PLFA 概念、分类和命名 磷脂是含有磷酸基团的脂质，目前已发现了1000多种磷脂类物质。磷脂作为微生物细胞膜主要成分，是甘油分子的第3位羟基被磷酸或其他羟基所酯化形成的。其结构特点是：具有由磷酸相连的取代基团（含氨碱或醇类）构成的亲水头（hydrophilic head）和由脂肪酸链构成的疏水尾（hydrophobictail）。 PLFAs(磷脂脂肪酸，phosphohpids fattyacids)谱图分析方法的原理是基于磷脂——几乎是所有生物细胞膜的重要组成部分，细胞中磷脂的含量在自然条件下(正常的生理条件下)恒定[ 2 ]，其长链脂肪酸的形式——磷脂脂肪酸PLFAs 可作为微生物群落的标记物。此外，磷脂不能作为细胞的贮存物质，在细胞死亡后将很快降解(厌氧条件下约需2d，而好氧条件下约需12—16d)m，可代表微生
脂肪酸测定步骤
细胞脂肪酸组成分析 Sherlock Microbial Identification System(MIS)就是一套由美国MIDI公司开发成功的微生物鉴定自动化系统，该系统操作安全、简单、快速，实验成本也相对较低。它主要根据不同种类微生物细胞膜中磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid，PLFA)的类型和含量具有种的特异性、指示性和遗传稳定性等特殊性能对微生物进行全自动鉴定和分析，该系统备有图谱识别软件和迄今为止微生物鉴定系统中最大的数据库资源，包括嗜氧菌1 100余种，厌氧菌800余种，酵母菌和放线菌约300种，共计超过2 200种。 一、仪器设备 安捷伦6 890N气相色谱、Sherlock MIS系统、旋转式混合振荡仪、水浴锅、XW．80A旋涡混合器、10 IIll带聚四氟乙烯塞的玻璃瓶等。所有的玻璃器皿均需在马福炉中400~C烘烤1 h。 二、培养基 MIDI推荐培养基--TSBA培养基：加热混合溶解30 g胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptiease soy broth，TSB)、15 g琼脂(Granulated ar)和1 L去离子水制成。 三、配置试剂（所有有机试剂均为HPLC级，无机试剂均为优级纯） 溶液I（皂化试剂）：混合150 ml水和150 ml甲醇，加入45 g NaOH，同时搅拌至完全溶解。 溶液II（甲基化试剂）：325 ml 6 mol L 的盐酸加入到275 ml甲醇中，混合均匀。 溶液III（萃取试剂）：加200 ml甲基叔丁基醚到200 ml正己烷中，混合均匀。 溶液IV（碱洗液）：在900 ml去离子水中加入10.8 gNaOH，搅拌至完全溶解。 溶液V（饱和NaC1溶液）：在100 ml去离子水中加入40 g NaC1。 四、实验方法 试验方法主要参照MIDI操作手册，即在培养基上28℃恒温培养细菌24 h后取菌，通过提取和分离细菌细胞膜中的磷脂脂肪酸(PLFA)，甲基化后进行气相色谱鉴定分析。具体如下： 1 细菌的培养在含TSBA培养基的培养皿和含牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿上按照四区划线法分别接种4~C保存的菌株，28℃恒温培养箱中培养24 h。随机选取部分TSBA培养基上培养的菌株，转接到另一含TSBA培养基的培养皿中，28℃再培养24 h，用于比较活化处理时间长短对鉴定结果的影响。 2 菌株的获取按照MIDI推荐的方法，三区取样获取的菌株脂肪酸最具代表性。因此用普通接种环获取已培养好的三区菌株至少40 mg到10ml带聚四氟乙烯塞的玻璃瓶中。 3 皂化在取好菌株样的玻璃瓶中加入1.0 ml的溶液I（皂化试剂），盖好盖子，旋涡振荡5～10 S，于100℃的沸水浴中加热5 min，稍冷却后振荡5～10 s，再将玻璃瓶放入水浴中继续加热25 min，然后冷却至室温。 4 甲基化每个玻璃瓶中加入溶液II（甲基化试剂）2.0 ml，盖紧盖子旋涡振荡后，放入80℃水浴加热10 min，再将玻璃瓶冷却至室温。 5 萃取往玻璃瓶中加入1.25 ml溶液III（萃取试剂），玻璃瓶盖紧盖子在旋转式}昆合振荡仪上温和振荡10 min后，打开盖子，取出每个样品的下层相并丢弃，保留上层有机相。 6 基本洗涤每个玻璃瓶中加入3.0溶液IV（碱洗液），盖紧盖子后在旋转式混合振荡仪上温和旋转振荡5 min。静置几分钟，若两相界面不清楚，加数滴溶液V（饱和NaC1溶液）使两层液面的接口更清楚。 7 分析吸取上层有机相于气相色谱样品瓶中，在安捷伦6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器（FID）及HP气相色谱化学工作站（HP CHEMSTATION ver A 5.01）；色谱柱为Ultra-2柱，长25m，内径0.2mm，液膜厚度0.33?m；气相色谱各参数由MIDI Sherlock程序(MIDI，Inc．Newark，DE)设置调用（炉温为二阶程序升温：起始温度170 ℃，每分钟5 ℃升至260 ℃，随后以40 ℃/ min升至310℃，维持1.5min；进样口温度250℃，载气为氢气，流速0.5ml/min，分流进样模式，分流比100:1，进样量2?l；检测器温度300℃，氢气流速30 ml/min，空气流速216ml/min，补充气（氮气）流速30ml/min。） 五、注意事项结果 MIDI操作手册指明，当鉴定结果第一选择的相似指数(Similarity Index，SI)在0．500以上，且第一选择和第二选择的sI 差值大于0.100，则可以认为鉴定成功，鉴定结果为第一选择所列的菌种名。若sI值在0.300到0.500之间，且第一选择和第二选择的sI差值大于0.100，则表明第一选择与第二选择分开，鉴定可能成功，但是第一选择所列的菌种为非典型的菌株。当sI值小于0．300时，则认为该菌株不存在于数据库中，但软件会给出一个最相关的菌株。 不同培养基对细菌鉴定结果有明显的影响。这可能与MIDISherlock系统中微生物数据库是创建于指定培养基培养的微生物直接有关，其他培养基的化学成分不同于TSBA培养基，它含其他外源的磷脂以成分，这些成分会引起脂肪酸的描绘定量上出现偏移而干扰菌种鉴定中脂肪酸图谱分析，影响鉴定结果。因此，建议利用MIDI Sherlock系统鉴定细菌时应选用TSBA培养基培养细菌。
MIDI脂肪酸提取步骤
培养皿的建议划线法(Streaking plates) 利用Sherlock MIS 鉴定微生物时，建议使用Array四区划线法(Quadrant streak pattern) (图2-2)，在该模 式中，第四区有单克隆生长，以确认是否是纯培养， 第三区菌落生长处于对数后期(Late Log)。 图2-2-四区画线式样(Quadrant streak pattern) 从分离培养皿中选择分离良好的单克隆进行 划线。接种环采用火焰灭菌，接种环可以通过接触 培养皿中无菌落的区域来冷却。 用无菌冷却的接种环挑取菌落，移至另一个新的培养皿中。划第一区时全部的接种环都与培养基接触，所以此区域为稠密的接种培养；第二区转动接种环90°角，并且用接种环边划过第一区的角落二次，如图表的划法，连续划平行线，不再利用第一区。 接种第三区时，将接种环转动90度角并通过第二区的角落边缘二次，然后连续划平行线，不再通过第二区。 灭菌及冷却你的接种环，接种环可以通过接触培养皿中无菌落的区域来冷却。 接种第四区时，利用转动接种环90度角并通过第三区的角落边缘二次，然后连续划平行线，不再通过第三区。这种划线方式提供了充足的材料以供分析，同时能确认所得的细菌是纯培养物。 培养条件(Incubation) 大多数稳定的脂肪酸成份是从培养的对数后期（late log）中生成的。Sherlock数据库构建时也多数选择在此培养条件下微生物。下述的标准培养条件状况也符合多数实验室的习惯。所使用例外的注意事项在实验室的列表在Appendix B。 选用小容积高质量的培养箱，使得生长条件可以得到良好的控制。培养箱过大或者大量样品共用培养箱可能难以维持良好的生长条件。不要在培养箱中残留任何消毒药剂，因为这些药剂即使在空气中只有低浓度残留，也可能影响微生物的生长。 好氧菌培养条件(Aerobic Incubation)
土壤微生物脂肪酸
一、实验名称 土壤微生物脂肪酸分析方法（FAMEs） 二、实验目的 通过测定土壤磷脂中脂肪酸的组成，可以估算土壤微生物生物量及其群落结构与多样性状况。 三、实验原理 土壤磷脂分析方法的基本原理是，将新鲜土壤用浸提剂浸提，再进行萃取和色谱柱分离出磷脂，磷脂中的磷含量可指示微生物生物量。磷脂与甲醇进行酯化反应，形成脂肪酸甲酯，再用色谱法测定各种脂肪酸含量。 四、实验仪器及分析方法 GC－MS测试采用日本岛津QP-5000GC-MS仪。色谱柱为DB-1（28m×0.25 mm）石英弹性毛细柱。采用程序升温100~270℃，5℃/min。界面温度为280℃。汽化室温度280℃，离子源温度260℃，电子能量：70eV。不同样品测定之间，在270℃下清洗柱子2min，质谱图的确认采用NIST62LIB及NIST12LIB谱库检索及EPA/NIH质谱标准图相结合。 五、实验步骤 土壤微生物脂肪酸的甲脂化和提取 1.将15mL的0.2M的KOH甲醇溶液和相当于烘干重3g的新鲜土壤加到35mL 的离心试管中。 2.混合均匀，在37℃下温育1h(脂肪酸释放，并甲脂化，每10分钟涡悬样品一次)。 3.加3mL的1.0M醋酸于离心管中，混匀。 4.加10mL的正己烷，使FAMEs转到有机相中，480×g离心10分钟。 5.将正己烷相转到干净试管中，在N2气流下挥发掉溶剂。 6.将FAMEs溶解在0.5mL的1：1（V/V）的（正己烷：甲基叔丁基醚(methyl-tert butyl ether)），作GC-MS分析。 六、实验数据处理方法 细菌往往不含有多个不饱和键的脂肪酸，链长是奇数、带支链的、主链上含有
大豆磷脂中磷脂酰胆碱的脂肪酸组成分析
大豆磷脂中磷脂酰胆碱的脂肪酸组成分析 夏海涛3 刘玉芬 侯进龙 (齐齐哈尔大学化学与化学工程学院,齐齐哈尔161006) 2002202230收稿;2002206226接受 1 引 言磷脂是生物膜的主要成分,是由甘油骨架、极性基团和不饱和脂肪酸组成的脂质类化合物。磷脂种类(PC ,PE 等)的化学组成决定磷脂的物理特性,进而影响生物膜的功能。研究表明:磷脂脂肪基团中不饱和碳2碳键是决定其相变温度的关键因素,同时,环境因素影响磷脂的脂肪酸组成,随环境温度的变化,磷脂的脂肪酸组成也作出相应的调整。因此,测定磷脂酰胆碱的脂肪酸组成,对研究大豆的遗传性及环境因素对其所造成的影响具有重要意义。 磷脂脂肪酸组成的分析已有报道,但对于大豆磷脂酰胆碱脂肪酸组成的分析国内至今未见报道。本文用正相半制备高效液相色谱法分离制备大豆磷脂酰胆碱,水解酯化后,用气相色谱法测定脂肪酸组成。结果表明,大豆磷脂酰胆碱主要由C 16∶0,C 18∶0,C 18∶1,C 18∶2和C 18∶35种脂肪酸组成,该方法可用于各种磷脂的脂肪酸分析。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 P2000型高效液相色谱仪(美国Therm o Separation 公司);Lichros orb si 260色谱柱(大连依利特公司),SE DEX 55型蒸发光散射检测器(法国Dikma 公司);Vista 402型色谱数据处理机(美国Varian 公司);VIST A 6000型气相色谱仪(美国Varian 公司);FI D 检测器。正己烷、异丙醇(色谱纯)、脂肪酸(分析纯);二次蒸馏水;磷脂酰胆碱PC 、磷脂酰乙醇胺PE 、磷脂酰肌醇PI 、磷脂酸PA 均为标准品(美国S igma 公司);粉末大豆磷脂。 2.2 半制备液相色谱分析条件 Lichros orb si 260色谱柱(10μm ,30cm ×8mm i.d ),流动相∶(A )正己烷Π异丙醇=58Π42 (V ΠV );(B )正己烷/异丙醇/水=55Π42Π3(V ΠV );梯度程序:0～5min ,溶剂A 从100%变为0%,保持20min ,25～30min ,溶 剂A 从0%变为100%,保持10min ;流速:1.8m L Πmin ;蒸发光散射检测器温度80℃,空气压力2.2×105Pa 。进样量:0.5 m L 。各磷脂用相同条件下标准品的保留时间定性。从柱后收集磷脂酰胆碱,在氮气流下蒸发干燥,储存冰箱中备用。 2.3 脂肪酸的甲酯化 称取磷脂酰胆碱1mg ,加入苯2正己烷(1∶1)3m L ,1m ol ΠL 氢氧化钾2乙醇溶液3m L ,密封,于40℃放置40min 完成甲酯化。冷却,稀酸中和,加25m L 水,吸出析出的有机相,浓缩后供气相色谱分析。 2.4 气相色谱分析条件 色谱柱4m ×2mm i.d ,固定相为Chroms orb WHP 60～80,10%DEG S;FI D 检测器,柱温195℃;氮气流速25m L Πmin ,H 2流速30m L Πmin ,空气流速250m L Πmin ;进样量5μL 。 3 结果与讨论 3.1 磷脂的分离 磷脂的分离有多种方法,应用最多的是以硅胶为固定相的正相高效液相色谱法,由于流动相组成的变化影响磷脂的分离,所以本实验比较了流动相组成比例不同时的分离效果,选定以上的梯度程序为磷脂分离的最佳洗脱条件。在该条件下,样品中组分的出峰顺序为:PE 18.89min ,PA 23.38min ,PI 26.88min ,PC 31.25min 。 3.2 磷脂的酯交换甲酯化 气相色谱分析脂肪酸一般采用甲酯化法,常用的有硫酸2甲醇法,三氟化硼2甲醇法等。本实验选择的方法特别适用于微量和痕量脂肪酸的分析。 3.3 测定结果 气相色谱分析脂肪酸采用增加峰高法定性,峰面积归一化法定量。3次平行测定的结果为:亚油酸5411%,RS D =0.43%,油酸22.4%,RS D =1.68%,棕榈酸11.6%,RS D =2.37%,亚麻酸7.5%,RS D =5.68%,硬脂酸414%,RS D =0.98% 。第31卷 2003年1月 分析化学(FE NXI H UAX UE ) 来稿摘登Chinese Journal of Analytical Chemistry 第1期126? 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. https://www.wendangku.net/doc/507366178.html,