实时荧光定量PCR技术

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PCR技术

螈简述实时荧光定量

实时荧光定量PCR技术的原理

薆1.

袃所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术结合了实时定量PCR仪、实时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。实时PCR的设想是由Higuchi于1992年最早提出[1]。

芁荧光探针技术是根据标记基团的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)原理而实现的。当某个荧光基团的发射光谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且2个基团距离足够近时，能量可以从短波长(高能量)的荧光基团传递到长波长(低能量)的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。

腿定量原理：实时荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团，使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系，从而得出产物的扩增曲线。理想的扩增曲线应为J型，符合2N方程(其中N为PCR的循环次数)，但实际上扩增曲线为S型。在PCR反应早期，不能将产生荧光的水平与背景明显区别，之后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在指数期的某一点上检测PCR产物的量，并由此推断起始模板含量[2-3]。

羄实时荧光定量PCR的标准扩增曲线如图1。其中Rn+表示每点测量的荧光强度，代表反应管含有模板DNA；Rn-表示荧光基线强度，代表反应管不含有模板DNA，其在理想情况下是一条平线，只具有背景荧光数值；△Rn的值表示PCR过程中，探针降解的量，也即PCR产物的量。基线(baseline)是背景曲线的一段，范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定，到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。

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莁图1 实时荧光定量PCR的标准扩增曲线

薀荧光阈值(threshold)是以PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline)，荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号标准差的10倍，即：Threshold=10SD(cycle 3-15)，一般认为在荧光阈值以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。Ct值也称阈值循环(threshold cycle)，指在PCR循环过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。研究结果表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准样品可作出标准曲线，因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

螆简单地说，实时荧光定量PCR的基本原理就是样本核酸扩增呈指数增长，在反应体系和条件完全一致的情况下，样本DNA含量与扩增产物的对数成正比，由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物(荧光探针)与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。

实时荧光定量PCR技术的类型及特点

蚅2.

蚈实时荧光定量PCR技术的常用机制包括荧光染料检测和水解探针检测。

羄2.1 SYBR GreenI检测

蚅SYBR GreenI是一种能结合到dsDNA小沟部位的具有绿色激发波长的染料，它只有与dsDNA结合后才会发出荧光。在变性时，DNA双链分开，不产生荧光；在复性和延伸时，形成dsDNA，SYBR GreenI发出荧光。荧光强度逐渐增强，直到达到阈值，被荧光探测系统检测到[4]。因此，荧光强度可以代表扩增产物的数量。SYBR GreenI的优点在于：①成本较低，不需合成和标记探针；②适合初步筛查：选用SYBR筛查，再用探针法精确定量少数关键样品。但其缺点有：①特异性差，不能分辨主带与杂带，给出的是总信号，所以在低样本浓度时，不能进行基因突变分析。但该方法可利用熔点曲线分析将特异产物、引物二聚体和非特异性产物区别开来，不需要通过电泳鉴定；②不能做多重检测，每孔只能检测1个目标基因；

③灵敏度低，适合于5000拷贝以上的基因定量。

蚁2.2 TaqMan探针

螈PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报

告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

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膃图2 常规TaqMan探针检测原理

莀常规TaqMan探针的5’端标记荧光发射基团FAM(6-羧基荧光素)，3’端标记荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)。该探针在PCR过程中不能被延伸。根据FRET原理，当探针保持完整时，3’端淬灭基团抑制5’端发射基团的荧光发射。在PCR的退火期，探针与模板发生特异性杂交，延伸期引物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸，当到达探针处，Taq酶发挥5’-3’外切活性，继而发生置换。切断探针后，FAM与TAMRA分离，荧光信号得到释放。这时荧光探测系统就能检测到光密度有所增加。模板每复制1次，就有1个探针被切断，并有1个荧光信号被释放。由于理论上被释放的荧光基团数和PCR产物数是一对一的关系，且光密度同被释放的荧光基团数也呈正比关系，因此该技术可对模板进行准确定量[5]。但TaqMan也存在一定不足，主要表现在：①由于采用荧光和淬灭基团双末端标记，因此淬灭难以

彻底，本底较高。②报告基团的水解利用的是Taq酶的5’-3’外切活性，因此定量时容易受酶活性影响。③探针标记成本较高，不便普及应用。

袈另外还有TaqMan MGB(minor groove binder)探针、分子信标、双杂交探针、复合探针等特异性检测技术，在此不一一介绍。

结语和展望

螆3.

袄荧光定量PCR技术自建立以来，发展迅速、应用广泛，表明其具有强大的生命力。由于具有定量、特异、灵敏和快速等特点，是目前检测目的核酸拷贝数的可靠方法，已广泛应用于人类和动植物疾病的快速检测、基因型的鉴定、肿瘤基因检测、转基因研究等方面，也为畜牧兽医领域的研究提供了重要的方法。近些年来，许多科研工作者基于荧光PCR的基本原理对荧光PCR技术进行不断深入的研究和改进，使荧光PCR技术得到了进一步的完善，并在此基础上开发出了许多新的荧光定量PCR技术。随着科技的发展，功能更强大、操作更方便的实时定量PCR 仪不断推出，更特异、更灵敏的荧光标记材料的不断出现，数据分析软件的不断改进更新，使得实时定量PCR技术的应用前景更加广泛，使之成为生物定量分析的强有力手段。TaqMan和分子信标荧光探针是目前用于荧光定量PCR检测的主流，但都存在各自的优缺点，其他荧光探针都是在此基础上为了克服它们的不足而设计出来的，随着探针技术的发展，更特异更稳定的探针将会出现[6]。

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参考文献

节4.

膁[1] Higuchi R，Fockler C．Kinetic PCR analysis real-time monitoring of DNA amplification reactions田．Biotechnology，1993，11(9)：1026-1030．

羈[2] 黄留玉．PCR最新技术原理、方法及应用[M]．北京：化学工业出版社。2005：131-139

芃[3] 韩俊英等.国外医学遗传学分册，2000,23(3):117-120

羄[4] Yin J L，Shackel N A，Zekry A，et a1．real-time reverse transcript-tase -polymerase chain reaction(RT-PCR)for measurement of cytokine and growth factor mRNA expression with fluorescent probes or SYBR Green I[J]．Immunol Cell Biol，2001，79(3)：213．

羀[5] Livak K J，Flood S J，Marmaro J，et a1．Oligo nueleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization[J]．PCR Methods APPI，1995，4(6)：357．

[6] 陈旭等。实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J].东北农业大学学报。2010：41(8):148-155.

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