USP 88 生物实验
88BIOLOGICAL REACTIVITY TESTS, IN VIVO
The following tests are designed to determine the biological response of animals to elastomerics, plastics, and other polymeric material with direct or indirect patient contact, or by the injection of specific extracts prepared from the material under test. It is essential to make available the specific surface area for extraction. When the surface area of the specimen cannot be determined, use 0.1 g of elastomer or 0.2 g of plastic or other material for every mL of extraction fluid. Also, it is essential to exercise care in the preparation of the materials to be injected or instilled to prevent contamination with microorganisms and other foreign matter. Three tests are described. The Systemic Injection Test and the Intracutaneous Test are used for elastomeric materials, especially to elastomeric closures for which the appropriate Biological Reactivity Tests, In Vitro 87have indicated significant biological reactivity. These two tests are used for plastics and other polymers, in addition to a third test, the Implantation Test, to test the suitability of these materials intended for use in fabricating containers and accessories thereto, for use in parenteral preparations, and for use in medical devices, implants, and other systems.
These three tests are applied to materials or medical devices, if there is a need for classification of plastics and other polymers based on in vivo biological reactivity testing.
For the purpose of this chapter, these definitions apply: the Sample is the specimen under test or an extract prepared from such a specimen. A Blank consists of the same quantity of the same extracting medium that is used for the extraction of the specimen under test, treated in the same manner as the extracting medium containing the specimen under test. A Negative Control1 is a specimen that gives no reaction under the conditions of the test.
CLASSIFICATION OF PLASTICS
Six Plastic Classes are defined (see Table 1). This classification is based on responses to a series of in vivo tests for which extracts, materials, and routes of administration are specified. These tests are directly related to the intended end-use of the plastic articles. The choice of extractants is representative of the vehicles in preparations with which the plastics are likely to be in contact. The Table 1 classification facilitates communication among suppliers, users, and manufacturers of plastics by summarizing the tests to be performed for containers for injections and medical devices if a need for classification exists.
Table 1. Classification of Plastics
Plastic
Classes a Tests to be Conducted
I II III IV V VI Test Material Animal Dose Procedure b
x x x x x x Extract of
Sample in
Sodium
Chloride
Injection Mouse 50 mL/kg A (IV)
x x x x x x Rabbit
or
Guinea
Pig
0.2 mL/animal
at each of 10 or
6 sites B (IC)
x x x x x Extract of
Sample in 1 in
20 Solution of
Alcohol in
Sodium
Chloride
Injection Mouse 50 mL/kg A (IP)
x x x x x Rabbit
or
Guinea
Pig
0.2 mL/animal
at each of 10 or
6 sites B (IC)
x x x
Extract of
Sample in
Polyethylene
Glycol 400Mouse 10 g/kg A (IP)
x x Rabbit
or
Guinea
Pig
0.2 mL/animal
at each of 10 or
6 sites B (IC)
x x x x
Extract of
Sample in
Vegetable Oil Mouse 50 mL/kg A (IP)
x x x Rabbit
or
Guinea
Pig
0.2 mL/animal
at each of 10 or
6 sites B (IC)
x x Implant strips
of Sample Rabbit 4 strips/animal C
x x Implant
Sample Rat
2
Samples/animal C
Plastic
Classes a Tests to be Conducted
I II III IV V VI Test Material Animal Dose Procedure b
a Tests required for each class are indicated by ―x‖ in appropriate columns.
b Legend: A (IP)—Systemi
c Injection Test (intraperitoneal); B (IC)—Intracutaneous Test (intracutaneous); C—Implantation Test (intramuscular or subcutaneous implantation).
With the exception of the Implantation Test, the procedures are based on the use of extracts that, depending on the heat resistance of the material, are prepared at one of three standard temperatures: 50, 70, and 121. Therefore, the class designation of a plastic must be accompanied by an indication of the temperature of extraction (e.g., IV-121, which represents a class IV plastic extracted at 121, or I-50, which represents a class I plastic extracted at 50).
Plastics may be classified as USP Plastic Classes I–VI only on the basis of the response criteria prescribed in Table 1.
This classification does not apply to plastics that are intended for use as containers for oral or topical products, or that may be used as an integral part of a drug formulation. Table 1 does not apply to natural elastomers, which are to be tested in Sodium Chloride Injection and vegetable oils only.
The Systemic Injection Test and the Intracutaneous Test are designed to determine the systemic and local, respectively, biological responses of animals to plastics and other polymers by the single-dose injection of specific extracts prepared from a Sample. The Implantation Test is designed to evaluate the reaction of living tissue to the plastic and other polymers by the implantation of the Sample itself into animal tissue. The proper preparation and placement of the specimens under aseptic conditions are important in the conduct of the Implantation Test.
These tests are designed for application to plastics and other polymers in the condition in which they are used. If the material is to be exposed to any cleansing or sterilization process prior to its end-use, then the tests are to be conducted on a Sample prepared from a specimen preconditioned by the same processing.
Factors such as material composition, processing and cleaning procedures, contacting media, inks, adhesives, absorption, adsorption and permeability of preservatives, and conditions of storage may also affect the suitability of a material for a specific use. Evaluation of such factors should be made by appropriate additional specific tests to determine the suitability of a material for its intended use.
USP R EFERENCE S TANDARDS 11—USP High-Density Polyethylene RS.
Extracting Media—
SODIUM CHLORIDE INJECTION (see monograph). Use Sodium Chloride Injection containing 0.9% of NaCl.
1 IN 20 SOLUTION OF ALCOHOL IN SODIUM CHLORIDE INJECTION. POLYETHYLENE GLYCOL 400 (see monograph).
VEGETABLE OIL— Use freshly refined Sesame Oil (see monograph) or Cottonseed Oil (see monograph) or other suitable vegetable oils.
DRUG PRODUCT VEHICLE (where applicable).
WATER FOR INJECTION (see monograph).
NOTE—The Sesame Oil or Cottonseed Oil or other suitable vegetable oil meets the following additional requirements. Obtain, if possible, freshly refined oil. Use three properly prepared animals, and inject the oil intracutaneously in a dose of 0.2 mL into each of 10 sites per animal, and observe the animals at 24, 48, and 72 h following injection. Rate the observations at each site on the numerical scale indicated in Table 2. For the 3 rabbits or guinea pigs (30 or 18 injection sites), at any observation time, the average response for erythema is not greater than 0.5 and for edema is not greater than 1.0, and no site shows a tissue reaction larger than 10 mm in overall diameter.
The residue of oil at the injection site should not be misinterpreted as edema. Edematous tissue blanches when gentle pressure is applied.
Table 2. Evaluation of Skin Reactions a
Erythema and Eschar Formation Score No erythema 0 Very slight erythema (barely perceptible) 1 Well-defined erythema 2 Moderate to severe erythema 3 Severe erythema (beet-redness) to slight eschar formation (injuries in depth) 4 Edema Formation b Score No edema 0 Very slight edema (barely perceptible) 1 Slight edema (edges of area well defined by definite raising) 2 Moderate edema (raised approximately
1 mm) 3 Severe edema (raised more than 1 mm and extending
beyond the area of
exposure) 4
a Draize JH, Woodward G, Calvery HO. Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. J Pharmacol Exp Ther 1944;82:377–390.
b Excludes noninflammatory (mechanical) edema from the blank or extraction fluid.
Apparatus— The apparatus for the tests includes the following. AUTOCLAVE— Use an autoclave capable of maintaining a temperature of 121 ±2.0, equipped with a thermometer, a pressure gauge, a vent cock, a rack adequate to accommodate the test containers above the water level, and a water cooling system that will allow for cooling of the test containers to about, but not below, 20immediately following the heating cycle.
OVEN— Use an oven, preferably a forced-circulation model, that will maintain operating temperatures of 50or 70within ±2.
EXTRACTION CONTAINERS— Use only containers, such as ampuls or screw-cap culture test tubes, of Type I glass. If used, culture test tubes are closed with screw caps having suitable elastomeric liners. The exposed surface of the elastomeric liner is completely protected with an inert solid disk 0.05–0.075 mm in thickness. A suitable disk may be fabricated from a polytef resin.
Preparation of Apparatus— Cleanse all glassware thoroughly with chromic acid cleansing mixture, or if necessary, with hot nitric acid, followed by prolonged rinsing with water. Clean cutting utensils by an appropriate method (e.g., successive cleaning with acetone and methylene chloride) prior to use in subdividing a specimen. Clean all other equipment by thorough scrubbing with a suitable detergent and prolonged rinsing with water.
Render containers and equipment used for extraction, and in transfer and administration of test material, sterile and dry by a suitable process. [NOTE—If ethylene oxide is used as the sterilizing agent, allow adequate time for complete degassing. ]
Procedure—
PREPARATION OF SAMPLE— Both the Systemic Injection Test and the Intracutaneous Test may be performed using the same extract, if desired, or separate extracts may be made for each test. Select and subdivide into portions a Sample of the size indicated in Table 3. Remove particulate matter, such as lint and free particles, by treating each subdivided Sample or Negative Control as follows. Place the Sample into a clean, glass-stoppered, 100-mL graduated cylinder of Type I glass, and add about 70 mL of Water for Injection. Agitate for about 30 s, and drain off the water. Repeat this step, and dry those pieces prepared for the extraction with Vegetable Oil in an oven at a temperature not exceeding 50. [NOTE—Do not clean the Sample with a dry or wet cloth or by rinsing or washing with an organic solvent, surfactant, etc. ]
Table 3. Surface Area of Specimen To Be Used a
Form of
Material Thickness Amount of Sample for
each 20 mL of
Extracting Medium
Subdivided
into
Film or sheet <0.5 mm Equivalent of 120 cm2
total surface area (both
sides combined)
Strips of about
5 × 0.3 cm
0.5–1 mm Equivalent of 60 cm2 total surface area (both sides combined)
Tubing <0.5 mm
(wall)
Length (in cm) = 120
cm2/(sum of ID and OD
circumferences)
Sections of
about
5 × 0.3 cm
0.5–1 mm
(wall)
Length (in cm) = 60
cm2/(sum of ID and OD
circumferences)
Slabs, tubing,
and molded
items >1 mm Equivalent of 60 cm2 total
surface area (all exposed
surfaces combined)
Pieces up to
about 5 × 0.3
cm
Elastomers >1 mm Equivalent of 25 cm2 total
surface area (all exposed surfaces combined)
Do not
subdivide b
a When surface area cannot be determined due to the configuration of the specimen, use 0.1 g of elastomer or 0.2 g of plastic or other polymers for every 1 mL of extracting fluid.
b Molded elastomeri
c closures are teste
d intact.
PREPARATION OF EXTRACTS— Place a properly prepared Sample to be tested in an extraction container, and add 20 mL of the appropriate extracting medium. Repeat these directions for each extracting medium required for testing. Also, prepare one 20-mL blank of each medium for parallel injections and comparisons. Extract by heating in an autoclave at 121for 60 min, in an oven at 70for 24 h, or at 50for 72 h. Allow adequate time for the liquid within the container to reach the extraction temperature. [NOTE—The extraction conditions should not in any instance cause physical changes such as fusion or melting of the Sample pieces, which result in a decrease in the available surface area. A slight adherence of the pieces can be tolerated. Always add the cleaned pieces individually to the extracting medium. If culture tubes are used for autoclave extractions with Vegetable Oil, seal screw caps adequately with pressure-sensitive tape. ]
Cool to about room temperature but not below 20, shake vigorously for several minutes, and decant each extract immediately, using aseptic precautions, into a dry, sterile vessel. Store the extracts at a temperature of 20–30, and do not use for tests after 24 h. Of importance are the contact of the extracting medium with the available surface area of the plastic and the time and temperature during extraction, the proper cooling, agitation, and decanting process, and the aseptic handling and storage of the extracts following extraction.
SYSTEMIC INJECTION TEST
This test is designed to evaluate systemic responses to the extracts of materials under test following injection into mice. Alternate routes of injection may be used with justification.
Test Animals— Use healthy, not previously used albino mice weighing 17–23 g. For each test group use only mice of the same source. Allow water and food, commonly used for laboratory animals and of known composition, ad libitum. Procedure—[NOTE—Agitate each extract vigorously prior to withdrawal of injection doses to ensure even distribution of the extracted matter. ] Inject each of the five mice in a test group with the Sample or the Blank as outlined in Table 4, except to dilute each g of the extract of the Sample prepared with Polyethylene Glycol 400, and the corresponding Blank, with 4.1 volumes of Sodium Chloride Injection to obtain a solution having a concentration of about 200 mg of polyethylene glycol per mL.
Table 4. Injection Procedure—Systemic Injection Test
Extract or Blank Dose per kg Route a Sodium Chloride
Injection 50 mL IV
1 in 20 solution of
Alcohol in Sodium Chloride Injection 50 mL IV Polyethylene Glycol 400 10 g IP Drug product vehicle (where applicable) 50 mL IV
50 mL IP
Extract or Blank Dose per kg Route a Vegetable Oil 50 mL IP
a IV = intravenous (aqueous sample and blank); IP = intraperitoneal (oleaginous sample and blank).
Observe the animals immediately after injection, again 4 h after injection, and then at least at 24, 48, and 72 h. If during the observation period none of the animals treated with the extract of the Sample shows a significantly greater biological reactivity than the animals treated with the Blank, the Sample meets the requirements of this test. If two or more mice die, or if abnormal behavior such as convulsions or prostration occurs in two or more mice, or if a body weight loss greater than 2 g occurs in three or more mice, the Sample does not meet the requirements of the test. If any animals treated with the Sample show only slight signs of biological reactivity, and not more than one animal shows gross symptoms of biological reactivity or dies, repeat the test using groups of 10 mice. On the repeat test, all 10 animals treated with the Sample show no significant biological reactivity above the Blank animals during the observation period.
INTRACUTANEOUS TEST
This test is designed to evaluate local responses to the extracts of materials under test following intracutaneous injection into rabbits or guinea pigs.
Test Animals— Select healthy, rabbits or guinea pigs with fur that can be clipped closely and skin that is free from mechanical irritation or trauma. In handling the animals, avoid touching the injection sites during observation periods, except to discriminate between edema and an oil residue. Procedure—[NOTE—Agitate each extract vigorously prior to withdrawal of injection doses to ensure even distribution of the extracted matter. ] On the day of the test, closely clip the fur on the animal's back on both sides of the spinal column over a sufficiently large test area. Avoid mechanical irritation and trauma. Remove loose hair by means of vacuum. If necessary, swab the skin lightly with diluted alcohol, and dry the
skin prior to injection. More than one extract from a given material can be used per rabbit or guinea pig, if it is determined that the test results will not be
affected. For each Sample use two animals and inject each intracutaneously, using one side of the animal for the Sample and the other side for the Blank , as outlined in Table 5. [NOTE —Dilute each g of the extract of the Sample prepared with Polyethylene Glycol 400, and the corresponding Blank , with 7.4 volumes of Sodium Chloride Injection to obtain a solution having a concentration of about 120 mg of polyethylene glycol per mL. ]
Table 5. Intracutaneous Test
Extract or Blank Number of Sites (per animal) Dose
(μL per site)
Sample
5 200 Blank 5 200
Examine injection sites for evidence of any tissue reaction such as erythema, edema, and necrosis. Swab the skin lightly, if necessary, with diluted alcohol to facilitate reading of injection sites. Observe all animals at 24, 48, and 72 h after injection. Rate the observations on a numerical scale for the extract of the Sample and for the Blank , using Table 2. Reclip the fur as necessary during the observation period. The average erythema and edema scores for Sample and Blank sites are determined at every scoring interval (24, 48, and 72 h) for each rabbit or guinea pig. After the 72-hour scoring, all erythema scores plus edema scores are totalled separately for each Sample and Blank . Divide each of the totals by 12 (2 animals × 3 scoring periods × 2 scoring categories) to determine the overall mean score for each Sample versus each corresponding Blank . The requirements of the test are met if the difference between the Sample and the Blank mean score is 1.0 or less. If at any observation period the average reaction to the Sample is questionably greater than the average reaction to the Blank , repeat the test using three additional rabbits or guinea pigs. The requirements of the test are met if the difference between the Sample and the Blank mean score is 1.0 or less.
IMPLANTATION TEST
The implantation test is designed for the evaluation of plastic materials and other polymeric materials in direct contact with living tissue. Of importance are the proper preparation of the implant strips and their proper implantation under aseptic conditions. The intramuscular implantation test requires healthy adult New Zealand rabbits. The test specimens are placed into needles as the delivery system for implantation. Although most materials lend themselves readily to this method, there are a number of materials that are unsuitable for intramuscular implantation. For materials with physical characteristics unsuitable for routine intramuscular implantation, the subcutaneous rat implantation model is a viable alternative.
Intramuscular Implantation in Rabbits
Prepare for implantation 8 strips of the Sample and 4 strips of USP
High-Density Polyethylene RS. Each strip should measure not less than 10 × 1 mm. The edges of the strips should be as smooth as possible to avoid additional mechanical trauma upon implantation. Strips of the specified minimum size are implanted by means of a hypodermic needle (15–19 gauge) with intravenous point and a sterile trocar. Use either presterilized needles into which the sterile plastic strips are aseptically inserted, or insert each clean strip into a needle, the cannula and hub of which are protected with an appropriate cover, and then subjected to the appropriate sterilization procedure. [NOTE—Allow for proper degassing if agents such as ethylene oxide are used. ]
Test Animals— Select healthy, adult rabbits weighing not less than 2.5 kg, and with paravertebral muscles that are sufficiently large in size to allow for implantation of the test strips. Do not use any muscular tissue other than the paravertebral site. The animals must be anesthetized with a commonly used anesthetic agent to a degree deep enough to prevent muscular movements, such as twitching. See the Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) guidelines.
Procedure— Perform the test in a clean area. On the day of the test or up to 20 h before testing, clip the fur of the animals on both sides of the spinal column. Remove loose hair by means of vacuum. Swab the skin lightly with diluted alcohol, and dry the skin prior to injection.
Implant four strips of the Sample into the paravertebral muscle on one side of the spine of each of two rabbits, 2.5–5 cm from the midline and parallel to the spinal column, and about 2.5 cm apart from each other. In a similar fashion implant two strips of USP High-Density Polyethylene RS in the opposite muscle of each animal. Insert a sterile stylet into the needle to hold the implant strip in the tissue while withdrawing the needle. If excessive bleeding is observed after implantation of a strip, place a duplicate strip at another site. Keep the animals for a period of not less than 120 h, and sacrifice them at the end of the observation period by administering an overdose of an anesthetic agent or other suitable agents. Allow sufficient time to elapse for the tissue to be cut without bleeding. Examine macroscopically the area of the tissue surrounding the center portion of each implant strip. Use a magnifying lens and auxiliary light source. Observe the Sample and Control implant sites for hemorrhage, necrosis, discolorations, and infections, and record the observations. Measure encapsulation, if present, by recording the width of the capsule (from the periphery of the space occupied by the implant Control or Sample to the periphery of the capsule) rounded to the nearest 0.1 mm. Score encapsulation according to Table 6.
Table 6. Evaluation of Encapsulation in the Implantation Test
Capsule Width Score
None 0
Up to 0.5 mm 1
0.6–1.0 mm 2
1.1–
2.0 mm 3
Greater than 2.0 mm 4
Calculate the differences between average scores for the Sample and Control sites. The requirements of the test are met if the difference does not exceed
1.0, or if the difference between the Sample and Control mean scores for more than one of the four implant sites does not exceed 1 for any implanted animal.
Subcutaneous Implantation in Rats
Prepare for implantation 10 sample specimens and 10 control specimens. The size and shape of the control specimens shall be as similar to that of the test specimens as practically possible. For example, specimens made of sheeting material shall be 10–12 mm in diameter and from 0.3–1 mm in thickness. The edges of the specimens should be as smooth as possible to avoid additional mechanical trauma upon implantation.
Test Animals— Select healthy albino rats weighing 225–350 g at the time of implantation.
Procedure— Perform the test in a clean area. Anesthetize (see AAALAC guidelines) the animal until a surgical plane is achieved. Clip the fur of the animals on both sides of the spinal column. Remove loose hair by means of vacuum. Clean the clipped area with povidone–iodine solution. Using aseptic technique, make two midline incisions (approximately 1.0 cm long) through the skin at the cranial and caudal regions on the dorsal surface. Using blunt dissection, separate the fascia connecting skin to muscle to form a pocket underneath the skin lateral to each side of the incision (base of pocket approximately 20 mm from the line of implant). Insert a sterile sample into each pocket, and close the incision with wound clips or sutures. Implant two test samples and two control samples in each of five rats. Keep the animals for a period of at least seven days, and sacrifice them at the end of the observation period by CO2 induced hypoxia or administering an overdose of an anesthetic agent. Allow sufficient time to elapse for the tissue to be cut without bleeding. Cut the skin (dorsal surface) longitudinally and lay back. Carefully examine macroscopically the area of the tissue surrounding the implant. Cut the sample in half and remove for close examination of the tissue in direct contact with the sample. Use a magnifying lens and auxiliary light source, if appropriate. Observe the Sample and Control implant sites for hemorrhage, necrosis,
discolorations, and infections, and record the observations. Measure encapsulation, if present, by recording the width of the capsule (from the periphery of the space occupied by the implant Control or Sample to the periphery of the capsule) rounded to the nearest 0.1 mm. Score encapsulation according to Table 6. Calculate the differences between average scores for the Sample and Control sites. The requirements of the test are met if the difference does not exceed 1.0.
SAFETY TESTS—BIOLOGICALS
The safety test set forth here is intended to detect in an article any unexpected, unacceptable biological reactivity. This in vivo test is provided for the safety assessment of biotechnology-derived products.
Safety Test
Select five healthy mice not previously used for testing, weighing 17–23 g, unless otherwise directed in the individual monograph or elsewhere in this chapter, and maintained on an adequate balanced diet. Prepare a test solution as directed in the individual monograph. Unless otherwise directed in the individual monograph or elsewhere in this chapter, inject a dose of 0.5 mL of the test solution into each of the mice, using a 26-gauge needle of suitable length, or of the length specified below as applicable. Observe the animals over the 48 h following the injection. If, at the end of 48 h, all of the animals survive and not more than one of the animals shows outward symptoms of a reaction not normally expected of the level of toxicity related to the article, the requirements of this test are met. If one or more animals die or if more than one of the animals shows signs of abnormal or untoward toxicity of the article under test, repeat the test using at least another 10 mice similar to those used in the initial test, but weighing 20 ± 1 g. In either case, if all of the animals survive for 48 h and show no symptoms of a reaction indicative of an abnormal or undue level of toxicity of the article, the requirements of the test are met. Body weights of mice before and at the end of the test should be obtained to
detect any untoward effects. Animals that show signs of toxicity should be grossly necropsied and subjected to histopathology if necessary.
For biologics, perform the test according to the procedures prescribed in the Code of Federal Regulations, Section 610.11.
1USP High-Density Polyethylene RS.
Auxiliary Information—Please check for your question in the FAQs before contacting USP.
Topic/Question Contact Expert Committee
General Chapter Desmond G. Hunt,
Ph.D.
Senior Scientific
Liaison
(301) 816-8341 (GCPS2010) General Chapters - Packaging Storage and Distribution
Reference Standards RS Technical Services
1-301-816-8129 rstech@https://www.wendangku.net/doc/5b9452829.html,
USP38–NF33 Page 158 Pharmacopeial Forum: Volume No. 38(2)
分子生物学综合实验报告
分子生物学综合试验报告
综合实验Ⅰ.Southern杂交 （质粒DNA提取、PCR技术体外扩增DNA、质粒载体和外源DNA的连接反应、 地高辛标记的Southern杂交） 一.实验目的 1.学习Southern杂交的原理及操作方法。 2.学习碱裂解法提取质粒的原理。 3.学习PCR反应的基本原理和实验技术；了解引物设计的一般要求。 4.掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。 二.实验原理 利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的碱裂解法提取质粒的主要原理是：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术，PCR 进行的基本条件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）、引物、dNTP （dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、Taq DNA聚合酶、反应缓冲体系。 PCR循环由三个步骤组成：变性、退火、延伸。每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。
DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来。最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。 地高辛随机引物法标记的原理：在随机引物法标记的反应液中，有随机合成的六聚核苷酸作为引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作为合成底物，以单链DNA作为模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA链。以地高辛标记的探针与靶基因DNA链杂交后，再通过免疫反应进行检测。一般通过酶标记地高辛抗体检测，就可以肯定杂交反应的存在。免疫检验一般用碱性磷酸酶系统，BClP/NBT显色，敏感性很高。 三．实验准备 1.实验材料： 含质粒的大肠杆菌DH5α，LB液体培养基， LB平板培养基 2.实验试剂： Taq DNA聚合酶，10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2），dNTP，引物（P1、P2），溴乙啶 (EB) ，点样缓冲液Loading buffer（10×）：%溴酚蓝，40%甘油，目的基因及载体， 2×ligation 缓冲液，T4 DNA连接酶， L CaCl2，氨苄青霉素（100mg/mL）， TBE电泳缓冲液（5×）， DIG Random Labeling Mix（高效），Anti-DIG-AP Conjugate， BCIP/NBT Stock Solution，Blocking Reagent。 20×SSC：柠檬酸钠，3M NaCl，2×SSC：柠檬酸钠， NaCl， EDTA，变性液： NaOH， NaCl，中和度： Tris-HCl、、3M NaCl，Standard buffer：5×SSC、%(w/v) N-Lauroylsarcosine, % (w/v) SDS, 1% Blocking Reagent，Standard buffer+50% formamide，Anti-DIG-AP 碱性磷酸酶标记抗地高辛单抗体，BCIP/NBT储备液，冲洗液：0. 1M
生物技术工程实验室建设
2007-2010年中央与地方共建高等学校共建专项资金项目 生物技术工程实验室建设 可行性论证报告 重庆科技学院 生物系 二○○七年六月二十日
一、总论 1、学科基本情况 原化学与生物工程学院是一个多学科及交叉学科并存的综合性学院，有化学与化学工程、生物技术、环境科学三个一级学科，以及交叉学科覆盖了全院八个专业：化学工程与工艺、应用化学、精细化工、工业分析、商品质量检测、生物制药、制药工程、环境工程，其中已有化学工程与工艺、应用化学两个本科专业。07年3月学校完成了学科专业结构布局调整，进行资源重组，由原来的化学与生物工程学院，新组建成立了化学化工学院和生物系。生物系现有15人，副教授1人，讲师7人，助教4人，全部具有硕士学位，其中博士5人。现有生物制药、制药工程两个专业，2001年以来形成了以能力培养为主线，以基础知识的传授和学习能力的培养、工程观念和创新能力的培养为两个教学重心。全面体现“厚基础、宽口径、重实践、高素质、创造性”整体思路，突出本专业在新药研究与开发方面所形成的特色。 2、实验室现状 化学化工实验室始建于1950年，经过五十六年的发展与建设，特别是经过2004、2005年中央与地方共建基础化学实验室及化工原理实验室的建设，生物系和化学化工学院现共有：制药工程实验室、微生物实验室、生化技术实验室、化工原理实验室、化工仿真实验室、基础化学实验室、化学工程与工艺实验室等实验室，拥有包括高效液相色谱仪、气相色谱仪、原子吸收仪、紫外分光光度仪、红外光谱仪、元素分析仪、发射光谱仪等贵重精密仪器，设备总价值505多万元设备。 3、建设概况 （1）概况 项目名称：生物技术工程实验室建设 项目类型：仪器设备购置 项目需要的投入总额：1200万元。其中对中央财政专项资金的最低需求960万元。 （2）预期目标： 为了全面贯彻落实教育部、财政部《关于实施高等学校本科教学教学质量与教学改革工程的意见》文件精神，集中力量有效提升专业实验室的水平，保证本科教学质量，对2千多平方米的教学实验设备进行整体建设，推进实验教学内容、方法、手段、队伍、管理及实验教学模式的改革与创新。 ①该项目建设完成后，“生物技术工程实验室”的设备档次、规模、台套数满足“质量工程”的要求，增加了设计性、综合性、创新性实验内容，使实验开出率达到100%、设备利用率90%以上，全面提高本科实验教学质量，使学生的综合素质和实践能力得到培养和锻炼；该项目建设完成后，可进一步加强产学研密切合作，与社会、行业以及企事业单位共同建设实习、实践教学基地，培养出一大批社会需要的适用人才。
分子生物学实验设计报告-四川大学
分子生物学实验设计报告 绿色荧光蛋白的克隆表达 一、引言 荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。 绿色荧光蛋白是由日本学者下村修于1962年从多管水母中发现并分离得到的一种发光蛋白。它是由238个氨基酸构成的“β-桶”型三维立体结构，其中65至67位氨基酸（丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸）形成发光团，为主要的发光位置。 通过生物化学的方法将基因做小小的改变，就可以改变GFP中的氨基酸，得到变异GFP。目前应用较多的GFP的突变体-增强型绿色荧光蛋白（简称EGFP） 传统的PCR产物克隆方法主要有两种：一种是PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上；另一种是TA载体连接。这两种方法费时费力，过程繁冗。 而本实验采用的无缝克隆和组装技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，这个重组载体能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。 < 菌液PCR是直接用菌液作为模板进行PCR的一种选取成功导入载体的菌落的方法，省
时，快捷，但容易出现假阳性。为了避免这种情况，我们需在设计引物时加上目的基因片段以及改进菌液处理方法。 三、实验步骤 1.质粒DNA的提取 实验原理： ~
分子生物学实验报告
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
中学生物实验室简介
务教育标准化学校建设档案（四号宋体） （六）核心指标6 （二号加粗楷体） 初中生物实验室简介 生物实验室位于综合楼三楼,建于2012年,于2012年8月正式投入使用。生物实验室实用面积约66平方米，可同时容纳48名学生进行实验，仪器室准备室一个面积24平方米。 所有仪器和实验设施都是按普通中小学理科实验室装备建设的基本要求标准来配备。共有仪器9 类，180 种，600 件。 仪器按使用范围分为：通用、测量、专用、模型、标本、挂图、玻璃仪器、药品及其他试验材料和工具。 实验室备有固定资产明细帐及安全防盗防火措施，并建立健全学生实验守则，仪器使用制度等，确保试验过程的安全有效。所有仪器完好率达100%，为我校实施素质教育做出了贡献！
生物实验室门口
实验室内景 仪器室内仪器的陈列 二、在任何事情上都不要觉得自己受了多大的委屈，哭哭啼啼和别别扭扭改变不了糟糕的现状。心子开一点，认真地该干啥干啥，反倒走得顺畅许多。扛得住多少东西，最后就会得到多少东西，大致就是这么个理儿吧。 三、生命本没有意义，你要能给他什么意义，他就有什么意义。与其终日冥想人生有何意义，不如试用此生做点有意义的事。
四、爱怕沉默。太多的人，以为爱到深处是无言。其实，爱是很难描述的一种情感，需要详尽的表达和传递。 五、有些路，只能一个人走。 六、有一种落差是，你配不上自己的野心，也辜负了所受的苦难。 七、有些决定，只需要一分钟，可是，却会用一辈子，去后悔那一分钟。 八、“忽然想通了”,这五个字说来简单，要做到可真不容易。我佛如来在菩堤树下得道，就因为他“忽然想通了”.达摩祖师面壁十八年，才总算“忽然想通了”.无论什么事，你只要能“忽然想通了”,你就不会有烦恼，但达到这地步之前，你一定已不知道有过多少烦恼。 九、如果他总为别人撑伞，你何苦非为他等在雨中。 十、我对前任的感觉很简单，哪怕他的女朋友来我面前秀恩爱，我也不会觉得烦。就像在看别人吃一碗很香的卤肉饭，吧唧嘴巴弄得很大声，但我自己心里是明白的：我吃过那种饭，其实没那么好吃。 十一、为什么我们总是不懂得珍惜眼前人？在未可预知的重逢里，我们以为总会重逢，总会有缘再会，总以为有机会说一声对不起，却从没想过每一次挥手道别，都可能是诀别，每一声叹息，都可能是人间最后的一声叹息。 十二、我在最好的时候碰到你，是我的运气。可惜我没时间了。想想，说人生无悔，都是赌气的话。人生若无悔，那该多无趣啊。我心里有过你。可我也只能到喜欢为止了。 十三、我说不出来为什么爱你，但我知道，你就是我不爱别人的理由。 十四、当你在转圈的时候，这个世界很大，当你勇往直前，这个世界就很小。 十五、现在男女之间的恋爱，总是答应太快，结果分手也快。人性的规律是容易得到的就容易放弃。凡是通过努力得到的，不管是感情还是物品，都会使人顿生珍惜之感。所以在感情上，当
分子生物学实验设计实验
分子生物学实验 设计实验 题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP ） 学院：生命科学学院 专业：生态学 教师：吴传芳 姓名/学号：余光辉/20 方成/20
一、实验目的 在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白 二、实验流程 三、实验试剂、材料及步骤 (一)质粒DNA的提取 1.原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌 体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后， 质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染 色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常 规亚克隆及探针标记等要求 2.试剂 LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g， 琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。 溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖， 10mmol/ EDTA-Na， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 溶液Ⅱ：0.4mol/L NaOH ， 2% SDS 临用前1：1配制。 溶液Ⅲ：5mol/L 醋酸钾60ml 冰醋酸11.5ml 双蒸水28.5ml 卡那霉素(20mg/mL) 抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ） 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液或ddH2O
3.材料 含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液 1.5ml塑料离心管 EP管架 微量取液器和取液器吸头 常用玻璃器皿 4.实验步骤 （1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50μg/mL），37℃培养过夜 （2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液 （3）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min （4）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min （5）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min （6）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中 （7）向上清液中加入等体积（约400μL）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min ,取上清液于新离心管中 （9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h （10）12000rpm × 5 min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体 （11）加0.8mL70%乙醇，离心1 min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min （12）加30μL ddH2O ，-200C保存备用 5.注意 （1）饱和酚（取下层）单独吸200μL，氯仿：异戊醇（24：1）吸200μL （2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II 和III ），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用 (二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 1.原理 在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、 开环DNA 、闭环超螺旋DNA 。 当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA泳动速度：闭环超螺旋〉线状〉开 环。 但有时也有也会出现相反情况，因为与琼脂糖浓度、电流强度、离子强度及核 酸染料含量有关。 2.试剂 Gold view（DNA染料） 0.5×TBE缓冲液 上样缓冲液（6×） 3.材料 提取的pEGFP-N3和pET-28a ，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，
分子生物学实验技术考试题库
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
初中生物实验室工作总结
--------------------------可以编辑的精品文档，你值得拥有，下载后想怎么改就怎么改--------------------------- ==========================================================生物实验室工作总结 本学期生物实验室的各各方面工作都能顺利开展，现将这学期来的工作情况总结如下。 一.实验室的管理工作: 1、制定实验教学计划和实验室建设发展建议 2、购置仪器、药品要先行申请，由主管领导审阅后报校长室审批后再购置，入库要验收，同时填写入库清单。仪器原则不外借，若借出要由主管教导或校长同意后才能，并要及时追回。 3、认真记录仪器使用.损毁.丢失情况并报学校有关部门核对备案。 4、及时做好实验仪器的验收.核对.入库工作。如实填写年度库存仪器登记表。 5、加强安全制度。药品、仪器橱要上锁，沙桶要定期检查、补充。实验室经常通风换气，设备保持经常运转。 6、仪器、药品存放制度。做到分类存放，定橱定位。分组实验所用仪器药品一律应实验员发放，实验结束，及时清洗、整理、归放。 7、科学管理.规范摆放.井井有条。 8、保持仪器整洁.完好。确保仪器的正常使用。 9、搞好室内外卫生。 二.实验教学工作:
1、按照实验教学计划安排，及时开足开好试验课程。 2、积极和任课老师沟通交流，认真研究，确保实验教学的场地.器材和实验过程中学生人身安全.仪器安全。 3、根据实验通知单提前.充足准备仪器，确保教学需要。 4、协助教师进行实验演示，指导学生分组试验。 5、及时补充实验材料，教育学生勤俭节约并充分发挥其作用，禁止浪费。 6、不断改进实验方法和实验步骤，提高实验效果。 7、编排学生实验座次表，教育学生爱护仪器，损坏仪器要赔偿。 8、及时回收.清洗.摆放教学仪器。 9、积极和任课教师做好实验课的分析总结，更好的提高教学质量。 三、工作任务完成情况 本人在开学初就制订出生物实验计划，推动了本期实验教学有序、有计划的进行。 1、严格实验准备制度，演示实验三天前，分组实验一周前交实验通知单到实验室，准备好实验后，老师先预做实验，以此保证实验顺利地进行。实验中损坏的仪器严格依照教学仪器赔偿制度实施处罚。 2、做到购物有登记，帐目清楚，帐物卡三对应工作。教学仪器的借用严格按照教学仪器借用制度实行登记，如期归还，追还等。 3、对显微镜等教学精密仪器，做到了定期检修、除尘、防锈、保养等工作。 对标本类实施了定期检查、防蛀等加以妥善管理。有害、有毒的药品实行了专柜存放。 4、对新的实验仪器的性能、使用、操作方法做了充分了解，能熟炼地操作使用。而且积极参与了学生实验操作的指导工作，进一步锻炼了自己的动手能
生物工程大实验报告
生物工程大实验 30L发酵罐上黄原胶发酵实验 姓名： 学号： 学院：生命学院 专业：生物工程 年级： 同组成员：
1.材料和方法 1.1菌株：HYJ 1.2培养基 1.2.1斜面培养基（100ml） 葡萄糖 3.0；蛋白胨0.5；酵母粉0.3； 氯化钠0.5；琼脂 2.0；pH 7.0-7.3 灭菌条件：115℃，20min；培养温度：30℃；培养时间：24-48 h 1.2.2种子培养基（100ml） 葡萄糖 2.0；蛋白胨0.5；酵母粉0.1； 牛肉膏0.3 g；pH 7.0-7.3 灭菌条件：115℃，20 min；培养温度：30℃；培养时间：10-15 h 1.2.3发酵培养基（100ml） 葡萄糖 3.0；蛋白胨0.2；酵母粉0.1；Na2HPO4·12H2O 0.252；KH2PO4 0.3； K2SO4 0.1；MgSO4·7H2O 0.1；pH 7.0-7.3 灭菌条件：115℃，20 min；培养温度：30℃；培养时间：48-62 h 1.3. 培养条件 1.3.1斜面培养 1）配置400 ml的斜面培养基，分装试管，于115℃下灭菌20 min，之后摆斜面，冷却至室温后，将凝固后的斜面放于30℃培养箱过夜。 2）转接斜面菌种，将转接好的斜面菌放于30℃培养箱培养24-48 h。 1.3.2一级种子培养 1）配置种子培养基：按照种子培养基配方配制3000 ml，分别分装到5000 ml 和500 ml的三角瓶中，装液量分别为100 ml/500 ml三角瓶（用于一级种子培养）；1000 ml/5000 ml三角瓶（用于二级种子培养），于115℃下灭菌20 min。 2）接种：将培养好的斜面菌种接种到一级种子培养基中（100 ml/500 ml三角瓶），
生物工程专业实验大纲
生物工程专业实验大纲 目录 《生物反应工程实验》实验教学大纲 (1) 《生物工程专业实验》实验教学大纲 (2) 《生物化学实验》实验教学大纲 (4) 《微生物学实验》实验教学大纲 (6) 《仪器分析实验》实验教学大纲 (8) 《药物分析实验》实验教学大纲 (10) 《分子生物学实验技术》实验教学大纲 (11) 《基础生物学》实验教学大纲 (13) 《免疫学》实验教学大纲 (15) 《现代生物技术》实验教学大纲 (16)
一、实验课程目的与任务 本实验通过对生化反应的了解和生化反应器的使用，熟悉生化反应工程原理，掌握简单的生物反应工程操作，巩固和检验已学的理论知识，为今后的生物工程专业实验和毕业论文打下基础。 二、实验课程内容及具体要求 通过测定反应器的氧体积传质系数a k L 、反应器的停留时间分布以及采用此反应器进行微生物的间歇和连续发酵过程的实验，熟悉生化反应工程原理，重点掌握生化反应器的使用，掌握简单的生物反应工程实验操作。 三、实验项目设置及学时分配 四、实验计划与学时安排 本课程实验20学时，各实验与讲课穿插进行。 五、实验考核及评分办法 1．学生进实验室要求做好预习报告； 2．对实验过程中学生完成情况进行考核，并提出相应存在问题进行质疑； 3．综合每项实验状况给出成绩。 执笔人：曹飞
一、实验课程目的与任务 通过对工业化L－天冬氨酸的酶法生产过程进行实验，深入了解生化工程原理，掌握典型的生物反应过程操作，巩固和检验已学的理论知识，为毕业论文和走向工作岗位打下基础。 二、实验课程内容及具体要求 本实验综合了发酵工程、酶工程、生物分离工程和生物反应器的基本知识，要求学生通过典型产品的酶法制备了解生物工程的相关基本操作，掌握微生物菌种保存与培养、细胞固定化和酶法转化、目标产品的分离提取等基本实验技能。 三、实验项目设置及学时分配
生物工程工艺综合性实验报告
(此文档为word格式，下载后您可任意编辑修改！) 生物工程工艺综合性实验报告 院（系）：城市建设学院 专业班级：生物工程1101 学生姓名：马雪文 学号： 指导教师：李世杰 20 14 年 5 月 26 日至20 14 年 6 月 15 日
发酵工艺综合性实验指导书 一、实验目的 微生物发酵技术是生物工程最核心的技术，微生物发酵按其对 氧的需求可分为好氧微生物发酵，和厌氧微生物发酵。好氧和厌氧发酵有较大的区别，各自对工艺条件、发酵设备有不同的要求。分别掌握好氧和厌氧发酵技术也就比较全面的掌握了工业微生物技术。 本实验分别开出典型的好氧和厌氧发酵实验，训练学生掌握这两种工艺的基本技术、操作程序、分析手段，全面锻炼同学们实际动手能力。巩固和提高微生物净化操作能力、显微观察技术、培养基配制和灭菌技术、无菌取样和细胞量的确定、生长曲线的制作、光谱分析技术、气象色谱分析技术。初步培养同学们工业微生物领域科学研究和技术开发的基本能力。 二、实验原理 红曲霉通过有氧发酵将淀粉质原料转化为次级代谢产物红曲色素。 丙丁梭状芽孢杆菌经厌氧发酵将农副产品转化为丁醇和丙酮。 三、实验内容 1、好氧实验：红曲的发酵实验及其抑菌作用研究 2、厌氧实验：丁醇的发酵实验及其气相色谱检测 四、仪器设备和试剂、消耗品： 1．仪器设备： 电子分析天平 手提式蒸汽灭菌锅、自动控制蒸汽灭菌锅 双孔水浴锅 1000W电炉 5台 生物显微镜、电脑成像生物显微镜 生物培养箱、培养摇床 真空干燥箱 紫外可见分光光度计 离心机
真空泵、真空干燥器 蒸发器 气象色谱仪 2．药品和耗材： 药品：可溶淀粉 1瓶（500克），蛋白胨 1瓶（500克），琼脂，饴糖（麦 芽汁）麦芽1000克，大米粉 5公斤，硝酸钠NaNO 31瓶（500克），磷酸二氢钾KH 2 PO 4 1瓶（500克），磷酸氢二钾K 2HPO 4 1瓶，硫酸镁MgSO 4 ·7H 2 O 1瓶（500克）,硫酸 铵(NH 4) 2 SO 4 1瓶，氯化锰MnCL 2 1瓶，硫酸锰MnSO 4 ·H 2 O 1瓶，碳酸钙CaCO 3 1瓶， 维生素B1(盐酸硫胺素)1小瓶，酵母膏1瓶，乳酸（液态1瓶500克），葡萄糖（分析纯）1瓶，乙醇（分析纯）5瓶(5×500克)，乙醇(色谱纯Aladdin) 2瓶,丁醇（色谱纯Aladdin）2瓶，丙酮（色谱纯Aladdin）2瓶，叔戊醇（色谱纯Aladdin）2瓶 耗材：500ml三角瓶50只， 250ml三角瓶16个，100ml粗口径试管50只，1000ml烧杯10个，培养皿160套，常规试管160个，200ml烧杯16个，1ml移液枪头5盒，标签纸若干，玻璃真空干燥器大号1个，波美计8只，移液枪（1000ml）2只，玻璃珠2盒，100ml量筒8个，500ml量筒2个，称量纸2盒，不锈钢试剂勺4根， pH试纸2包，玻璃棒若干，玻璃推棒32根，5ml移液管16只 五、实验方法步骤和具体操作过程 （一）红曲的发酵实验及其抑菌作用研究 红曲是一种具有一定营养和药理作用的纯天然红色素，可赋予肉制品、食品、饮料等鲜艳的色泽及特殊风味，而且具有较好的营养价值和一定的防腐作用，因而被广泛地应用于食品工业。 红曲是由红曲霉经发酵分泌到胞外的一种色素，发酵的主要原料是淀粉类如大米、薯类等。红曲霉发酵合成色素同时对有害菌产生抑制作用。本实验分为两个部分，前一部分为红曲的发酵实验，后一部分为红曲的抑菌试验。 （Ⅰ）红曲的发酵实验 1．菌种 本实验室保藏的红曲霉菌种monascus purpureus。用本实验室自主设计的保藏方法，在短梗霉多糖膜片中封存，置于冰箱中保藏。使用时每取出一片，
初中生物学实验设计方案
一、实验名称:临时装片、切片、涂片的制作、观察与指导 二、实验目标:让学生通过独立自主的制作临时装片、切片、涂片的方法来感知细胞的形态与结构,从而使学生对细胞达到一定的认识,为以后的教学作下铺垫。制作临时装片的成功,对提高学生的生物学兴趣与生物科学素养都起着重要的作用。同时,这样锻炼了学生的动手能力,也培养了学生的自己动脑思考的能力。 三、实验方法及步骤: (一)实验材料:显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、刀片、吸水纸、解剖针、毛笔、滴管、擦镜纸;清水、碘酒溶液;西红柿、空心莲子草、洋葱;创可贴(切片时可能会有人受伤) (二)实验步骤: 1、临时装片的制作 ⑴准备 擦用擦镜纸把载玻片与盖玻片擦拭干净 改进:将洁净的纱布改为擦镜纸,擦拭玻片时要注意用左手的拇指与食指 夹住玻片的两端,右手的拇指与食指衬垫上洁净的纱布后,夹在玻片两面,同时擦拭,以防将玻片损坏, 滴用滴管在载玻片中央滴1-2滴清水 改进:在制片时至少滴2滴清水,这样加盖玻片时,盖玻片下的空间中水 较充盈,气泡就少,细胞的活性也较好 取用刀片在洋葱表面上划“井”字(大约0、5cm2),用镊子撕取外表皮 问题:由于叶表皮皱缩、学生不熟练等,导致撕下的表皮薄膜过厚,在显微 镜视野中难以找到理想的观察对象,致使实验效果较差。 改进:首先将洋葱鳞片叶切成宽1、0-1、5 cm 的纵向窄条,再用刀片将 洋葱鳞片叶内侧表皮划成小块(切忌划透),然后用镊子夹住所划表皮的 边缘,将其轻轻取下(洋葱鳞片叶内侧表皮易与叶肉分离,操作简便)即 可。这一改进降低了实验操作难度,提高了制片质量。 放把撕取的表皮浸入载玻片上的水滴中,并展平 ⑵盖盖玻片 盖用镊子夹起盖玻片,使它的一边先接触载玻片上的水滴,然后缓缓地 放下,盖在要观察的材料上 ⑶染色 染:将玻片倾斜10度左右,从高的一侧滴入碘液,让其自己流入玻片。 问题: 染色时书中要求就是把1-2滴碘液滴在盖玻片的一侧,然后用吸 水纸从盖玻片的另一侧吸引,使染液浸润标本的全部。然而,部分同学可 能将盖玻片下所有水全部吸干,做出的装片会有很多的大气泡,且气泡将 细胞掩盖了,或者有人将气泡误认为细胞。 改进:染色时不用吸水纸吸水,而就是将玻片倾斜10度左右,这个角度一
初级中学生物实验室管理制度
XX初级中学生物实验室规章制度 一、生物实验室管理制度 一、生物实验室要专人管理。注意防火、防尘、防潮、防霉、防蛀、防碎裂等，对各类仪器设备要经常维护，及时保养，确保始终处于完好备用状态。 二、按配备标准和教学要求，及时申购仪器、设备及材料，保证实验室正常运行。 三、仪器、设备及时入库，做好登记、编号、分类、存放等事宜，使账物相符，账目清晰。 四、保持实验室环境整洁，妥善保养设备，及时更新仪器，实验室仪器、模型、标本、药品等，要分门别类，定橱定位，橱有编号。 五、凡需借用仪器设备，必须办理借用手续，按期归还，按照出借制度执行。 六、学生进入实验室按指定座位就坐，保持室内安静。 七、实验前对照实验要求，认真检查仪器、设备，发现问题及时报告教师。实验过程中，为防止意外事故发生，要求严格遵守操作细则，并保持良好的上课纪律。如实记录实验数据，仔细观察，准确填写报告。 八、实验完毕，做好清洁工作，保持台面整洁，在实验过程中产生的垃圾丢入垃圾桶，填好《实验使用记录》，爱护公物，如有损坏按赔偿制度处理 二、生物实验室安全管理制度 一、室要保持安静，自觉遵守纪律，按班级有秩序地入座，不经教师允许不得擅自摆弄教学仪器，药品和模型标本等教学设备二、做实验前，要认真检查所有仪器，药品是否完好，齐全，如有缺损应及时向教师报告，予以调整补齐，未经教师宣布开始不得擅自进行实验. 三、实验药品不得入口，取用有毒药品更要小心，不得接触伤口，实验时所产生
的有毒或腐蚀性废物，污水等要妥善排出或集中深埋，严格按环保部门规定处理，严禁随地抛弃. 四、实验完毕后，要认真清点整理好教学仪器，药品及其它设备，玻璃仪器要刷洗干净，摆放整齐，并向教师询问仪器，药品禁止使用情况及问题，经教师或实验教师验收并得到允许后，再放好桌凳关闭门窗，方可离开实验室. 五、要爱护公共财物，小心使用教学仪器和实验设备，注意节约药品和水电。 六、实验室内的仪器，药品，模型标本和其他设备未经实验教师许可不准带出实验室。 七，熟悉灭火器材，砂箱以及校医药箱等的放置地点和使用方法，安全用具要妥善保管。 三、生物实验室危险品使用制度 为了加强我校危险品的消防安全监督、管理，保障学校财产和师生员工生命安全，《危险化学品安全管理条例》，结合我校实际，制定本制度如下： 一、本制度所称的危险化学品，是指用于教学实验易爆、易炸品、、易燃液体、易燃固体、自燃物品和遇湿易燃物品、氧化剂和有机过氧化物、有毒品和腐蚀品等。 二、对危险化学品的保管、使用和废弃处置，必须按照危险化学品安全管理的有关法规执行，危险化学品专用铁皮橱要设置明显标志，设备和安全设施应当定期检测。 三、储存、使用危险化学品，应当根据危险化学品的种类、特性，在实验室、库房等场所设置相应的监测、通风、防晒、调温、防火、灭火、防爆、泄压、防毒、消毒、中和、防潮、防雷、防静电、防腐、防渗漏、防护围堤或者隔离操作等安
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告专业：****** 班级：*** 指导老师：** 学生姓名：*** 目录： 实验一质粒DNA的小量制备 实验二DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定 实验三感受态细胞的制备及转化 实验四PCR扩增技术与琼脂糖凝胶电泳检测 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，
如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂 材料：大肠杆菌E.coli，含pBR322质粒。 试剂：
生物工程专业实验讲义汇总
生物工程专业实验讲义(适用于生物工程专业) 袁丽红曹飞 制药与生命科学学院 二零零四年四月
目录 实验一发酵种子的制备 (1) 实验二 E.coli细胞发酵培养 (2) 实验三高速冷冻离心机的使用方法 (3) 实验四固定化生物催化剂的制备 (4) 实验五游离细胞与固定化细胞酶活比较 (5) 实验六固定化生物催化剂的连续生产 (6) 实验七Ｌ－Asp的分离 (7) 实验八离子交换树脂的预处理及交换容量的测定 (8)
实验一发酵种子的制备 一、目的要求 1．了解实验室种子制备过程。 2．掌握实验室不同菌种种子生产方法。 二、原理 实验室种子制备过程包括琼脂斜面、固体培养基扩大培养或摇瓶液体培养。 不同菌种其具体制备方法不同，其过程如下图： 种子扩大培养过程 三、试验及器材 1．菌种：斜面低温保藏的大肠杆菌（E.coli） 2．培养基：牛肉膏0.5% NaCl 0.5% 蛋白胨1% PH 7.6~7.8 若配固体培养基，在其中加2%琼脂。 3．器材：天平、灭菌锅、试管、三角瓶（500mL） 四、操作方法 1．按培养基配方配制100mL固体培养基，分装于试管中。 压力1Kg/cm2灭菌30mins，结束后取出、趁热制成斜面。 2．按培养基配方配制1000mL液体培养基，分装于三角瓶中，每瓶100mL，压力1Kg/cm2灭菌30mins，结束后取出。 3．挑一环斜面低温保藏的E.coli接于液体培养基中，37℃培养24hs。 4．挑斜面长好的E.coli约2环接入液体培养基中，37℃振荡培养24hs，转速约150rpm。 五、思考与讨论 实验室种子制备的原则是什么？
分子生物学试验设计
分子生物学
利用半定量RT-PCR检测烟碱生物合成的方法 1 研究背景 烟碱是影响烟叶品质和安全性的最主要的因素之一，是烟草栽培和烟草制品消费者追求的主要目的物，也是烟草具有商品价值的根本所在。烟碱合成的第一步是腐胺到N-甲基腐胺的转化，由腐胺-N-甲基转移酶(PMT)催化，而腐胺-N-甲基转移酶(PMT)是合成烟碱过程中的关键限速酶。目前，国内外鲜有将烟碱的快速积累跟烟碱合成关键酶的转录水平直接对应起来的报道。研究表明，打顶后可导致烟草中烟碱的快速积累。所以利用烟草打顶可以增加烟碱生物合成的特点，选择参与烟碱合成的关键酶腐胺-N-甲基转移酶(PMT)，利用半定量RT-PCR检测PMT基因表达变化；同时结合上部烟叶烟碱含量的测定结果，比较两者的变化是否成正相关。这种方法的建立有利于通过检测烟碱合成关键基因的表达来分析烟草中烟碱生物合成情况，增强了检测不同大田管理措施影响烟碱合成的力度。 2 材料与方法 2.1 试验材料 试验材料为普通烟草栽培种K326。烟苗培育采用漂浮育苗法，烟苗长到4叶时，用作水培试验，烟苗管理按常规的溶液培养方法进行。烟苗水培65d时打顶，于打顶后24 h时取样，取烟株的上部叶和根系进行试验。 2.2 测定烟碱含量 烟碱含量的测定采用王瑞新(2003)的紫外分光光度法。每个样品5个重复，数据分析采用student,t检验，显著水平为P<0.05。 2.3 RNA提取 提取打顶烟草和不打顶烟草根部总RNA，总RNA提取后，分别测260nm、280 nm处的吸光值，计算A260/A280的值，估计总RNA的纯度，通过A260的值对总RNA进行定量。在l％琼脂糖凝胶上检测总RNA的提取质量。 2.4 RT-PCR法检测PMT表达变化 取等量打顶处理和不打顶烟株的总RNA，用RT-PCR法检测PMT基因的表达变化。 3 预计结果 3.1 烟碱含量的测定 与对照相比打顶后烟碱含量显著上升 3.2 RNA电泳检测 总RNA提取后，经检测RNA样品纯度好，并没有发生降解，可用于cDNA 第一链的合成。 3.3 PMT引物和内参引物进行分管PCR