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限制性内切酶HindIII说明书

限制性内切酶HindIII说明书

Hin d III

A A G C T T

T T C G A A

Takara Code:D1060A

包装量:3,000 Units

附带试剂:10×M Buffer 500 μl

10×Loading Buffer 500 μl

纯度:

1)Overdigestion Test:≥15 Units

2)Ligation-Recutting Test:

Ligation Effi.:100%,Recutting Effi.:100%

3)pKF3 Cloning Test:<2%

●酶贮存液:

10 mM Tris-HCl, pH7.5

400 mM KCl

0.1 mM EDTA

1 mM DTT

0.01 % BSA

50 % Glycerol

●起源:Escherichia coli carrying the plasmid encoding Hin dⅢ

gene.

●一般反应体系:

Hin dⅢ 1 μl

10×M Buffer 2 μl

DNA ≤1 μg

灭菌水up to 20 μl

●反应温度:37℃

●反应时间:

在上述20 μl的反应体系中,37℃反应5分钟可以完全切断λDNA,满足各种实验需求。针对特殊酶切底物DNA,如果得不到良好的酶切效果时,可以将反应时间延长至1小时。

●活性确认:

在50 μl反应液中,37℃温度下反应1小时,将1 μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。

●纯度检测:

1)Overdigestion Test:在1 μg DNA中加入过量的该限制酶,进行长时间(24小时)酶切反应,然后进行琼脂糖电泳,确认切出的DNA片段的电泳谱带不发生变化。

2)Ligation-Recutting Test:在经过10倍量该酶切出的DNA片段中,加入T4 DNA Ligase,使其连接,然后再使用该酶进行切断反应,判断Ligation-Recutting效率。

3)pKF3 Enforcement Cloning Test:使用10倍量的该酶,将Enforcement Cloning Vector pKF3 DNA切开,然后再进行连接后,转化至TH2感受态细胞中,判断该酶切位点受到影响的重组体所占的比率。●在各种Universal Buffer中的相对活性:

L M H K T(+BSA)相对活性(%) (60) 100 <20 200 (100)

●各种DNA的切断数:

●Star活性:

Mn2+存在条件下,识别序列会发生变化。

●Basal Buffer组成:

10 mM Tris-HCl, pH7.5

7 mM MgCl2

60 mM NaCl

●Universal Buffer组成(-20℃保存):

1.10 × L 100 mM Tris-HCl,pH7.5 4.10 × K 200 mM Tris-HCl,pH8.5

100 mM MgCl2100 mM MgCl2

10 mM Dithiothreitol 10 mM Dithiothreitol 2.10 × M 100 mM Tris-HCl,pH7.5 1,000 mM KCl

100 mM MgCl2 5.10 × T 330 mM Tris-Ac,pH7.9

10 mM Dithiothreitol (BSA 100 mM Mg-Ac

500 mM NaCl -Free) 5 mM Dithiothreitol 3.10 × H 500 mM Tris-HCl,pH7.5 660 mM K-Ac

100 mM MgCl2 6. 0.1% BSA

10 mM Dithiothreitol 7. 0.1% Triton X-100

1,000 mM NaCl

●10×Loading Buffer组成

(开封后室温保存)

0.9% SDS

50% Glycerol

0.05% Bromophenol Blue

使用时添加反应液量的1/10,即可停止反应,进行电泳。-20℃保存时,会出现SDS沉淀,请于温水浴中溶解后使用。在室温下保存时,SDS有时也会出现沉淀,此时同样请在温水浴中溶解后使用。

λAd2 SV φX pBR pUC pUC M13 Col

40 174 322 19 119 mp18 E1

7 12 6 0 1 1 1 1

0 V2011.12

常用限制性内切酶酶切位点汇总

Acc65I识别位点AccI识别位点AciI识别位点AclI识别位点AcuI识别位点 AfeI识别位点AflII识别位点AflIII识别位点AgeI识别位点AhdI识别位点AleI识别位点AluI识别位点AlwI识别位点AlwNI识别位点ApaI识别位点ApaLI识别位点ApeKI识别位点ApoI识别位点AscI识别位点AseI识别位点AsiSI识别位点AvaI识别位点AvaII识别位点AvrII识别位点BaeI识别位点BamHI识别位点BanI识别位点BanII识别位点

BbvCI识别位点BbvI识别位点 BccI识别位点BceAI识别位点BcgI识别位点 BciVI识别位点 BclI识别位点 BfaI识别位点 BfuAI识别位点 BglI识别位点 BglII识别位点 BlpI识别位点 Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点BmtI识别位点BpmI识别位点Bpu10I识别位点BpuEI识别位点BsaAI识别位点BsaBI识别位点BsaHI识别位点BsaI识别位点BsaJI识别位点BsaWI识别位点BsaXI识别位点BseRI识别位点BseYI识别位点

BsiEI 识别位点BsiHKAI 识别位点BsiWI识别位点BslI 识别位点BsmAI识别位点 BsmBI识别位点BsmFI识别位点BsmI识别位点BsoBI识别位点Bsp1286I识别位点BspCNI识别位点BspDI识别位点BspEI识别位点BspHI识别位点BspMI识别位点BspQI识别位点BsrBI识别位点BsrDI识别位点BsrFI识别位点BsrGI识别位点BsrI识别位点BssHII识别位点BssKI识别位点BssSI识别位点BstAPI识别位点BstBI识别位点BstEII识别位点BstNI识别位点

限制性内切酶

限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(一般4-8bp),并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。主要存在于原核生物,是原核生物自我保护的一种机制。它的作用包含两类,一种是对外的,限制作用,指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用,破坏入侵的外源DNA,使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。另一种是对内的,修饰作用,指在特定位置发生甲基化,可免遭自身限制性酶的破坏。 限制性核酸内切酶的发现是在本世纪中期,Arber等人对λ噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础,发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制和修饰系统。实验是:在K株或B株大肠杆菌上生长繁殖的噬菌体λ(K)或λ(B),再次感染原寄主菌体的成斑率为1,而感染新的寄主菌株的成斑率则分别为10-4和4*10-4所以说受到了限制。在 20 世纪 60 年代,噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。该研究工作在 Me-selson 和 Yuan(1968)纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制性内切酶时达到高峰。因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分离片段,人们认为它一定识别一个靶序列。从而提供了对 DNA 进行可控操作的前景。但不幸的是,K12 内切酶不具备人们希望的性质。虽然它确实是结合到一定的区域序列上,切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的(Yuan 等,1980)。经过大量努力后,终于在1970 年取得了突破,人们发现了在流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)中存在一种酶,其作用更加简单(Kelly & Smith,1970;Smith & W ilcox,1970),即这个酶可以识别双链 DNA 分子中的一个特定靶序列,并在该序列之内切断多聚核苷酸链,从而产生长度和序列一定的分离片段。突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现,他从嗜血流感细菌(Haemophilus influenzae)菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶(Smith & Wilcox,1970),并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的核苷酸序列(Kelly & Smith,1970)。这个酶现在命名为 Hind Ⅱ。嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ,而且含量很大。幸运的是,Hind Ⅲ不切割T7 DNA,因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 Hind Ⅲ将不产生任何问题(Old 等,1975)。在发现 HindⅡ后不久,又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶,并分析了它们的性质,EcoRⅠ是其中最重要的一个(Hedgepeth 等,1972)。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。

限制性内切酶酶切位点汇总

Acc65I识别位点 AccI识别位点 AciI识别位点 AclI识别位点 AcuI识别位点 AfeI识别位点 AflII识别位点 AflIII识别位点 AgeI识别位点 AhdI识别位点 AleI识别位点 AluI识别位点 AlwI识别位点 AlwNI识别位点 ApaI识别位点 ApaLI识别位点 ApeKI识别位点 ApoI识别位点 AscI识别位点 AseI识别位点 AsiSI识别位点 AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点

BbvCI识别位点 BbvI识别位点 BccI识别位点 BceAI识别位点 BcgI识别位点 BciVI识别位点 BclI识别位点 BfaI识别位点 BfuAI识别位点 BglI识别位点 BglII识别位点 BlpI识别位点 Bme1580I识别位点 BmgBI识别位点 BmrI识别位点 BmtI识别位点 BpmI识别位点 Bpu10I识别位点 BpuEI识别位点 BsaAI识别位点 BsaBI识别位点 BsaHI识别位点 BsaI识别位点 BsaJI识别位点 BsaWI识别位点 BsaXI识别位点 BseRI识别位点 BseYI识别位点

BsiEI识别位点 BsiHKAI识别位点 BsiWI识别位点 BslI识别位点 BsmAI识别位点 BsmBI识别位点 BsmFI识别位点 BsmI识别位点 BsoBI识别位点 Bsp1286I识别位点 BspCNI识别位点BspDI识别位点 BspEI识别位点 BspHI识别位点 BspMI识别位点 BspQI识别位点 BsrBI识别位点 BsrDI识别位点 BsrFI识别位点 BsrGI识别位点 BsrI识别位点 BssHII识别位点 BssKI识别位点 BssSI识别位点 BstAPI识别位点 BstBI识别位点 BstEII识别位点 BstNI识别位点

常用限制性内切酶酶切位点保护残基

酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶 发布: 2010-05-24 20:19| 来源:生物吧| 编辑:刘浩| 查看: 161 次 本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列,如AccI,AflIII,AscI,AvaI,BamHI,BglII,BssHII,BstEII,BstXI,ClaI,EcoRI,HaeIII,HindIII,KpnI,MluI,NcoI,NdeI,NheI,NotI,NsiI,PacI,PmeI,PstI,PvuI,SacI,SacII,SalI,ScaI,SmaI,SpeI,SphI,StuI,XbaI,XhoI,XmaI, 为什么要添加保护碱基? 在分子克隆实验中,有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点,用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开,因此在设计PCR引物时,人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列,即保护碱基,用来提高将来酶切时的活性。 其次,在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时,相临的两个酶切位点往往不能同时使用,因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。 该如何添加保护碱基? 添加保护碱基时,最关心的应该是保护碱基的数目,而不是种类。什么样的酶切位点,添加几个保护碱基,是有数据可以参考的。 添加什么保护碱基,如果严格点,是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小,GC%较低,添加时多加G或C,反之亦反。 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求,NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助(比如在多接头上切割位点很接近时),或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。在本表中没有列出的酶,则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基,以确保酶切反应的进行。 实验方法:用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。取1μg已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶,在20°C条件下分别反应2小时和20小时。反应缓冲液含70mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2, 5 mMDTT及适量的NaCl或KCl(视酶的具体要求而定)。20%的PAGE(7M尿素)凝胶电泳分析,经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构,切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。

常用限制性内切酶酶切位点

AatII 识别位点 Acc65I 识别位点 AccI 识别位点 AciI 识别位点 AclI 识别位点 AcuI 识别位点 AfeI 识别位点 AflII 识别位点 AflIII 识别位点 AgeI 识别位点 AhdI 识别位点 AleI 识别位点 AluI 识别位点 AlwI 识别位点 AlwNI 识别位点 ApaI 识别位点 ApaLI 识别位点 ApeKI 识别位点 ApoI 识别位点 AscI 识别位点 AseI 识别位点 AsiSI 识别位点

AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI 识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点 BbsI识别位点 BbvCI识别位点 BbvI识别位点 BccI识别位点 BceAI识别位点BcgI识别位点BciVI识别位点BclI识别位点 BfaI识别位点BfuAI识别位点BglI识别位点BglII识别位点BlpI识别位点Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点

BmtI 识别位点 BpmI 识别位点 Bpu10I 识别位点 BpuEI 识别位点 BsaAI 识别位点 BsaBI 识别位点 BsaHI 识别位点 BsaI 识别位点 BsaJI 识别位点 BsaWI 识别位点 BsaXI 识别位点 BseRI 识别位点 BseYI 识别位点 BsgI 识别位点 BsiEI 识别位点 BsiHKAI 识别位点 BsiWI 识别位点 BslI 识别位点 BsmAI 识别位点 BsmBI 识别位点 BsmFI 识别位点 BsmI 识别位点

限制性内切酶考点小结

限制性内切酶考点盘查 限制性内切酶是基因工程中最难把握的知识点,高考中对这种酶的考察特别重视,我们有必要对相关的知识先进行归纳,才有利于解答试题。 1 限制性核酸内切酶的基本知识 ①来源及化学本质:主要是从原核生物中分离纯化出来的。化学本质为蛋白质。 ②作用:催化作用,可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割,切割的化学键为磷酸二酯键。 ③作用特点:特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。 ④切割方式:错位切--产生两个相同的黏性末端,平切--形成平末端。如果是错位切则将一个基因从DNA分子上切割下来,需要破坏4个磷酸二酯键,同时产生4个黏性末端,增加4个游离的磷酸基团。 2 限制性核酸内切酶的难点解析 2.1 目的基因切割要点归纳 ①要把目的基因切割下来需要在目的基因的两边都进行切割,但绝对不可以破坏目的基因的结构。 ②切割目的基因的酶可以用同一种限制酶,也可以用两种不同的限制酶。 ③切割产生的末端有三种情况:都是平末端、都是粘性末端、一

边是粘性末端,一边是平末端。 2.2 质粒切割要点归纳 ①质粒的切割可以切一个切口,也可以切两个切口。如果是一个切口,则连接时可能会产生一些我们不需要的连接物(如自身环化等);如果是两个切口则质粒会丢失一段DNA片段,但可以控制连接物就是我们需要的目的基因和质粒的连接。切割时注意不要破坏了载体上的标记基因(至少保留有一个标记基因)、终止子、启动子、复制原点等。 ②切割质粒的酶可以用同一种限制酶,也可以用两种不同的限制酶。 ③切割产生的末端有三种情况:都是平末端,都是粘性末端,一边是粘性末端,一边是平末端。 2.3 限制性核酸内切酶的说明 不同的酶识别序列一般不同,但也有识别序列相同的。如果识别序列相同,切割点也相同则切割产生的粘性末端一样。一种酶的识别序列中可能包含另外一种酶的识别序列,切割时可以产生相同的粘性末端。不同的酶识别的序列一般不同,但有时也可能相同,这时切割产生的粘性末端也相同。 2.4 酶切割后的DNA片段的连接 如果是用一种限制性内切酶切割质粒表达载体和目的基因,不可以防止载体和目的基因的自身环化,两个DNA片段连接产物有:目的基因—目的基因;目的基因—载体;载体—载体。这些

限制性内切酶的一般原则和建议!

限制性内切酶的一般原则和建议! 1.如何做酶切反应? 该问题看似什么简单: DNA中加上酶,然后保温一段时间就可以了。但是在实际操作过程中,我们不断听到:切不动,装不上。问题在什么地方?能系列生产限制性内切酶的公司国际上,就那么几个,位列前 3 的是NEB, Fermentas, SibEnzyme。这些公司提供酶的品质一般都能得到保证。您可以怀疑酶的质量问题,但是更多的问题来源于模板是否合适酶切要求。下面几点对你的酶切是有帮助的。 1) 成功酶切的关键是准备好模板DNA。DNA样品中不能含有有机溶剂(会使酶变性或产生星号货性),不能含有干扰酶活性的污染物质,不能含有高浓度的EDTA (TE中的EDTA浓度较低,对Mg的浓度影响较小);同时要对DNA甲基化程度及其对酶切效率的影响要做到心中有数。 2) 选用合适的酶。根据酶切序列选用,特别注意选用甲基化对酶活性的干扰。 3) 正确使用和保存酶。酶需要保存在-20度的低温环境中,只是在需要用酶才从冰箱中取出来。运输和临时存放时需要将酶至于冰上。手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分,移酶时尽可能用长TIP, 避免污染。用完后需要及时送回原处。注意:酶通常是最后加。所有4) 反应体积需要根据实验目的定,常规的酶切一般要维持在10-50ul,酶切鉴定10-20ul就可以了。 5) 模板浓度问题:浓度过高,溶液黏度过大,酶不能有效扩散,酶切效果不会好。浓度过低,也会影响酶活性。 6) 注意模板用量和反应体积的关系。对酶用量,模板用量,反应体积等要素的确定需要的是时间和经验的积累。 7) 酶切反应的各个组分加完后,需要用TIP小心混匀几次,short spin 一下就可以保温了。一般不能使用振荡器混匀。 8) 反应温度的选择。一般反应都用37度,但是 Sma I 的最适合温度是25度,37度时酶仍表现出活性,但是效率下降50%。部分从耐热菌制备的酶需要在37度以上的温度反应,如Taq I的最适温度为65度,37度保温,效率仅为前者的1/10。 9) 反应时间的选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了。要完全酶切可以采用少量的酶长时间反应,或较高的酶量短时间处理都可以达到。在使用高酶量的时候需要注意甘油的最终浓度不要超过5%,也就是说10ul的体系,酶的用量不要超过1ul。 10) 是否和如何终止反应?酶切鉴定之类的实验不需要特殊处理。灭活的手段:加入高浓度的EDTA;65度或80度热处理20-30分钟;部分从高温菌纯化出来的内切酶由于最适的反应温度比较高,热处理灭活不一定完全,需要用苯酚/氯仿/乙醇方法纯化;电泳回收也是实验室常用除酶的手段。 2.如果遇到酶切不动或切不完全,该怎么办? 要回答这么问题常常需要了解酶活性单位是如何确定,我们多次接到这样的问题:1个单位的酶能在60分钟内切1ug的DNA,为什么我们的DNA那么少切那么长时间也不能切开或切完全?从下面几个因素去考虑: 1) 酶是否有活性:酶的活性单位通常是在60分钟酶切1ug lambda DNA或特定线状DNA所需要的酶量。鉴定酶的活性高低不是用您待切的DNA模板,也不是别的公司的酶来判定。因为不同公司酶可能是从不同系统中纯化的,虽然识别位点相同,但是酶的特性可能是有差异的。鉴定酶必须使用使用说明书上认定的酶活确定的方式,通常需要用lambda DAN做模板来判定。同时如果酶对甲基化敏感,还需要用Dcm-, Dam-的DNA.不排除由于运输或分装不当导致酶活性下降,这种情况是很少发生。我们公

限制性内切酶酶切位点汇总

限制性内切酶酶切位点汇AatII识别位点 Acc65I识别位点AccI识别位点AciI识别位点AclI识别位点AcuI识别位点AfeI识别位点AflII识别位点AflIII识别位点AgeI识别位点AhdI识别位点AleI识别位点AluI识别位点AlwI识别位点AlwNI识别位点 ApaI识别位点 ApaLI识别位点 ApeKI识别位点 ApoI识别位点 AscI识别位点 AseI识别位点 AsiSI识别位点 AvaI识别位点 AvaII识别位点 AvrII识别位点 BaeI识别位点 BamHI识别位点 BanI识别位点 BanII识别位点 BbsI识别位点 BbvCI识别位点 BbvI识别位点 BccI识别位点 BceAI识别位点 BcgI识别位点 BciVI识别位点 BclI识别位点 BfaI识别位点 BfuAI识别位点 BglI识别位点 BglII识别位点

BlpI识别位点 Bme1580I识别位点BmgBI识别位点BmrI识别位点 BmtI识别位点BpmI识别位点 Bpu10I识别位点BpuEI识别位点BsaAI识别位点BsaBI识别位点BsaHI识别位点BsaI识别位点BsaJI识别位点BsaWI识别位点BsaXI识别位点BseRI识别位点BseYI识别位点 BsgI识别位点 BsiEI识别位点 BsiHKAI识别位点 BsiWI识别位点 BslI识别位点 BsmAI识别位点 BsmBI识别位点 BsmFI识别位点 BsmI识别位点 BsoBI识别位点 Bsp1286I识别位点 BspCNI识别位点 BspDI识别位点 BspEI识别位点 BspHI识别位点 BspMI识别位点 BspQI识别位点 BsrBI识别位点 BsrDI识别位点 BsrFI识别位点 BsrGI识别位点 BsrI识别位点 BssHII识别位点 BssKI识别位点 BssSI识别位点 BstAPI识别位点 BstBI识别位点 BstEII识别位点 BstNI识别位点 BstUI识别位点 BstXI识别位点

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【推荐】限制性内切酶的特点有哪些-范文word版 本文部分内容来自网络整理,本司不为其真实性负责,如有异议或侵权请及时联系,本司将立即删除! == 本文为word格式,下载后可方便编辑和修改! == 限制性内切酶的特点有哪些 限制性核酸内切酶是可以识别特定的核苷酸序列,并在每条链中特定部位 的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶,简称限制酶。下面是小编 给大家整理的限制性内切酶的特点,希望能帮到大家! 限制性内切酶的特点 1、识别位点的DNA序列呈二重旋转对称(即具有迥文结构); 2、切割DNA均产生含5’-磷酸和3’-羟基的末端; 3、错位切割产生具有5’-或3’-突出的粘性末端;而沿对称轴切割双链DNA产生平头末端,也称钝性末端。 4、少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点,这些酶称为同切酶,如MboI Ⅰ和 Sau3A。 限制性内切酶的分类性质 根据酶的功能特性、大小及反应时所需的辅助因子,限制性内切酶可分为 两大类,即I类酶和Ⅱ酶。最早从大肠杆菌中发现的EcoK、EcoB就属于I类酶。其分子量较大;反应过程中除需Mg2+外,还需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP;在DNA分子上没有特异性的酶解片断,这是I、Ⅱ类酶之间最明显的差异。因此, I类酶作为DNA的分析工具价值不大。Ⅱ类酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等。其分子量小于105道尔顿;反应只需Mg2+;最重要的是在所识别的 特定碱基顺序上有特异性的切点,因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后,可产生特 异性的酶解片断,这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。 限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位点在回文的一 侧(如EcoR I、BamH I、Hind等),因而可形成粘性末端,另一些Ⅱ类酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等,切割位点在回文序列中间,形 成平整末端。Alu I的切割位点如下: 5'-A G^C T-3' 3'-T C^G A-5'

限制性内切酶分类指南

30多年前,当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时,首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵,而这种"限制"病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I 和EcoR II,以及来源于Heamophilus influenzae的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA,产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究 限制性内切酶的主要功能是保护细菌不受噬菌体的感染,这一观点已被人们广泛接受。它们作为微生物免疫机制的一部分行使其功能。当一个没有限制性内切酶的细菌被病毒感染时,大部分病毒颗粒都能成功地进行感染。然而一个有限制性内切酶的同种细菌被成功感染的比率显著下降。出现更多的限制性内切酶将会起到多重保护作用;而一个拥有4到5种各自独立的限制性内切酶将会使细胞坚不可摧。 限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶(甲基化酶)出现。后者的作用是保护细胞自身的DNA 不被限制性内切酶破坏。修饰酶识别的位点与相应的限制性内切酶相同,但只甲基化每条链中的一个碱基,而不是切开DNA链。限制性内切酶识别位点处的甲基基团伸入到双螺旋的大沟中去,阻碍了限制性内切酶的作用。这样,限制性内切酶和它的"搭档"--甲基化酶一起就构成了限制-修饰(R-M)系统。在一些R-M系统中,限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白,它们各自独立行使自己的功能;而在另一些系统中,两种功能由同一种限制-修饰酶的不同亚基,或是同一亚基的不同结构域来执行。 传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。然而,蛋白测序的结果表明,限制性内切酶的变化多种多样,若从分子水平上分类,则应当远远不止这三种。 I型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体。它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链。以前人们认为I型限制性内切酶很稀有,但现在通过对基因组测序的结果发现这一类酶其实很常见;尽管I型酶在生化研究中很有意义,但由于不产生确定的限制片段和明确的跑胶条带,因而不具备实用性。 II型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段和跑胶条带,因此是三类限制性内切酶中唯一用于dna分析和克隆的一类。II型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成,因而任意一种限制性内切酶的氨基酸序列可能与另一种限制性内切酶的氨基酸序列截然不同。实际上,从已知的情况上看,这些酶很可能是在进化过程中各自独立产生的,而非来源于同一个祖先。 II型限制性内切酶中最普遍的是象Hha I、Hind III和Not I这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上,因而识别的是对称序列;但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上,识别非对称序列。一些酶识别连续的序列(如EcoR I识别GAATTC);而另一些识别不连续的序列(如Bgl I识别GCCNNNNNGGC)。限制性内切酶的切割后产生一个3"羟基端和一个5"磷酸基团。它们的活性要求镁离子,而相应的修饰酶则需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。这些酶一般都比较小,亚基一般都在200-300个氨基酸左右。 另一种比较常见的酶是所谓的IIS型酶,比如Fok I和Alw I,它们在识别位点之外切开DNA。

限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶:是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一 类内切酶。 限制性核酸内切酶的分类: 根据限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式,可将限制酶分为三种类型,分别是第一 型(Type I)、第二型(Type II)及第三型(Type III)。 第一型限制酶 同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用;另有认知(recognize)DNA上特定 碱基序列的能力,通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition site)可达数千个碱基之远,并不能准确定位切割位点,所以并不常用。例如:EcoB、EcoK。 第二型限制酶 只具有认知切割的作用,修饰作用由其他酵素进行。所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence);所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。是遗传工程上,实用性较 高的限制酶种类。例如:EcoRI、HindIII。 第三型限制酶 与第一型限制酶类似,同时具有修饰及认知切割的作用。可认知短的不对称序列,切割位与 认知序列约距24-26个碱基对,并不能准确定位切割位点,所以并不常用。例如: EcoPI、HinfIII。 限制酶在遗传学方面的应用: 1、在甚因工程方面 利用能产生“粘性末端”的限制酶, 进行DNA的体外重组, 是较为方便的, 只要用同一 限制酶处理不同来源的DNA, 由于所产生的水解片段具有相同的粘性末端, 可以彼此“粘合”,再经连接酶处理, 就成为重组DNA分子了. 目前, 基因工程上, 限制酶主要应用于以下两方面 ? (1)目的基因与载体的重组 细菌细胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必须通过适当的载体(质粒或噬菌体)的帮助 才能将外源DNA引人受体细胞并在其中增殖和表达。将供体DNA与载体用同样的限制酶处理, 使载体带上各种各样的外源DNA片断, 然后引人受体细菌细胞增殖, 菌细胞增殖, 再筛 选出所需的菌株, 便获得带有某一目的基因的繁殖系.用这种方法, 已成功地将酵母菌的咪哇

常用限制性内切酶酶切位点汇总

ApaI识别位点Acc65I识别位点 ApaLI识别位点AccI识别位点 ApeKI识别位点AciI识别位点 ApoI识别位点AclI识别位点 AscI识别位点AcuI识别位点 AseI识别位点AfeI识别位点 AsiSI识别位点AflII识别位点 AvaI识别位点AflIII识别位点 AvaII识别位点AgeI识别位点 AvrII识别位点AhdI识别位点 BaeI识别位点AleI识别位点 BamHI识别位点AluI识别位点 BanI识别位点AlwI识别位点 BanII识别位点AlwNI识别位点

BmrI识别位点BbvCI识别位点 BmtI识别位点BbvI识别位点 BpmI识别位点BccI识别位点 Bpu10I识别位点BceAI识别位点 BpuEI识别位点BcgI识别位点 BsaAI识别位点BciVI识别位点 BsaBI识别位点BclI识别位点 BsaHI识别位点BfaI识别位点 BsaI识别位点BfuAI识别位点 BsaJI识别位点BglI识别位点 BsaWI识别位点BglII识别位点 BsaXI识别位点BlpI识别位点 BseRI识别位点Bme1580I识别位点 BseYI识别位点BmgBI识别位点

BspMI识别位点BsiEI识别位点 BspQI识别位点BsiHKAI识别位点 BsrBI识别位点BsiWI识别位点 BsrDI识别位点BslI识别位点 BsrFI识别位点BsmAI识别位点 BsrGI识别位点BsmBI识别位点 BsrI识别位点BsmFI识别位点 BssHII识别位点BsmI识别位点 BssKI识别位点BsoBI识别位点 BssSI识别位点Bsp1286I识别位点 BstAPI识别位点BspCNI识别位点 BstBI识别位点BspDI识别位点 BstEII识别位点BspEI识别位点 BstNI识别位点BspHI识别位点

限制性内切酶

第二章限制性内切核酸酶 一、填空题 1.严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是的酶。基因工程中把那些具有识别的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。2.年Luria和Human在T偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的现象。 3.1970年,Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶,能够特异性的切割DNA,这个酶后来被命名为,这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。 4.通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段,可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的。5.Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小.一般在20~40kDa,通常由亚基所组成。它们的作用底物为双链DNA,极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA,或DNA/RNA杂合双链。这类酶的专一性强,它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求,而且对更远的碱基也有要求,因此,Ⅱ类酶既具有专一性,也具有专一性,一般在识别序列内切割。切割的方式有,产生末端的DNA片段或的DNA 片段。作用时需要作辅助因子,但不需要和。6.完全的回文序列具有两个基本的特点,就是:(1) (2) 。 7.Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别个碱基,也有识别多序列的限制性内切核酸酶。根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析,限制性内切核酸酶识别序列具有倾向,即它们在识别序列中含量较高。 8.EcoK是I类限制性内切核酸酶,分子组成是α2β2 γ,分子量300kDa。在这些亚基中,o亚基具有作用;β亚基具有的活性;γ亚基的作用则是。 9.个体之间DNA限制性片段长度的差异叫。10.限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的,第一个大写字母取自,第二、第三两个字母取自,第四个字母则用表示。11.限制性内切核酸酶Acy I识别的序列是5’—GRCGYG-3’,其中R ,Y 。12.在酶切反应管加完各种反应物后,需要离心2秒钟,其目的是和。13.部分酶切可采取的措施有:(1) (2) (3) 等。14.第一个分离的限制性内切核酸酶是;而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是。 15.限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同,但识别的序列都是,它们属于。 16.由于DNA是由4种碱基组成的,所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值应该是。 17.Sal I和Not I都是哺乳动物中识别序列稀有的酶,在哺乳动物基因组的5kb片段中,找到NotI切点的概率是。 18.部分酶切是指控制反应条件,使得酶在DNA序列上的识别位点只有部分得到切割,它的理论依据是。 19.I类限制酶识别DNA的位点和切割的DNA位点是不同的,切割位点的识别结合有两种模型,一种是,另一种是。20.限制性内切核酸酶通常保存在浓度的甘油溶液中。

EcoR I限制性内切酶

Eco R I G A A T T C C T T A A G TaKaRa Code:D1040A 包 装 量:4,000 Units 附带试剂: 10×H Buffer 500 μl 10×Loading Buffer 500 μl 纯 度: 1) Overdigestion Test:≥12 Units 2) Ligation-Recutting Test: Ligation Effi.:100%,Recutting Effi.:100% 3) pKF3 Cloning Test:<2% ●酶贮存液: 10 mM Tris-HCl, pH7.5 100 mM KCl 0.1 mM EDTA 1 mM DTT 0.01 % BSA 0.15 % TritonX-100 50 % Glycerol ●起 源:Escherichia coli RY13 ●一般反应体系: Eco R I 1 μl 10×H Buffer 2 μl DNA ≤1 μg 灭菌水 up to 20 μl ●反应温度:37℃ ●反应时间: 在上述20 μl的反应体系中,37℃反应5分钟可以完全切断λDNA,满足各种实验需求。针对特殊酶切底物DNA,如果得不到良好的酶切效果时,可以将反应时间延长至1小时。 ●活性确认: 在50 μl反应液中,37℃温度下反应1小时,将1 μg的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 ●纯度检测: 1) Overdigestion Test:在1 μg DNA中加入过量的该限制酶,进行长时间(24小时)酶切反应,然后进行琼脂糖电泳,确认切出的DNA片段的电泳谱带不发生变化。 2) Ligation-Recutting Test:在经过10倍量该酶切出的DNA片段中,加入 T4 DNA Ligase,使其连接,然后再使用该酶进行切断反应,判断Ligation-Recutting效率。 3) pKF3 Enforcement Cloning Test:使用10倍量的该酶,将Enforcement Cloning Vector pKF3 DNA切开,然后再进行连接后,转化至TH2感受态细胞中,判断该酶切位点受到影响的重组体所占的比率。 ●在各种Universal Buffer中的相对活性: L M H K T(+BSA)相对活性(%)(20)(100) 100 (120) (80) ●各种DNA的切断数: ●甲基化的影响: 根据识别序列后续碱基的不同,有时受CG methylase影响。 ●Star活性: 高甘油浓度、Mn2+存在、低离子强度条件下,识别序列会发生变化。如果在反应液中添加Spermine (0.2 mM左右),活性降低20~30%,但可以抑制30~50%的Star活性。 ●Basal Buffer组成: 100 mM Tris-HCl, pH7.5 7 mM MgCl2 50 mM NaCl 7 mM 2-Mercaptoethanol 0.01 % BSA ●Universal Buffer组成(-20℃保存): 1.10 × L 100 mM Tris-HCl,pH7.5 4.10 × K 200 mM Tris-HCl,pH8.5 100 mM MgCl2100 mM MgCl2 10 mM Dithiothreitol 10 mM Dithiothreitol 2.10 × M 100 mM Tris-HCl,pH7.5 1,000 mM KCl 100 mM MgCl2 5.10 × T 330 mM Tris-Ac,pH7.9 10 mM Dithiothreitol (BSA 100 mM Mg-Ac 500 mM NaCl -Free) 5 mM Dithiothreitol 3.10 × H 500 mM Tris-HCl,pH7.5 660 mM K-Ac 100 mM MgCl2 6. 0.1% BSA 10 mM Dithiothreitol 7. 0.1% Triton X-100 1,000 mM NaCl ●10×Loading Buffer组成 (开封后室温保存) 0.9% SDS 50% Glycerol 0.05% Bromophenol Blue 使用时添加反应液量的1/10,即可停止反应,进行电泳。-20℃保存时,会出现SDS沉淀,请于温水浴中溶解后使用。在室温下保存时,SDS有时也会出现沉淀,此时同样请在温水浴中溶解后使用。 λ Ad2SVφX pBR pUC pUC M13Col 40174322 19 119 mp18E1 5 5 1 0 1 1 1 1 1 V2010.10

限制性核酸内切酶相关知识归纳

名师精编优秀资料 限制性核酸内切酶相关知识归纳 编制:军长 2013.12.10 限制性核酸内切酶是基因工程中最难把握的知识点,高考中对这种酶的考察特别重视,我们有必要对其相关的知识进行归纳,才有利于解答试题。 1 限制性核酸内切酶的基本知识 ①来源及化学本质:主要是从原核生物中分离纯化出来的。化学本质为蛋白质。 ②作用:催化作用,可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割,切割的化学键为磷酸二酯键。 ③作用特点:特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。 ④切割方式:错位切--产生两个相同的黏性末端,平切--形成平末端。如果是错位切则将一个基因从DNA分子上切割下来,需要破坏4个磷酸二酯键,同时产生4个黏性末端,增加4个游离的磷酸基团。 2 限制性核酸内切酶的难点解析 2.1 目的基因切割要点归纳 ①要把目的基因切割下来需要在目的基因的两边都进行切割,但绝对不可以破坏目的基因的结构。 ②切割目的基因的酶可以用同一种限制酶,也可以用两种不同的限制酶。 ③切割产生的末端有三种情况:都是平末端、都是粘性末端、一边是粘性末端,一边是平末端。 2.2 质粒切割要点归纳 ①质粒的切割可以切一个切口,也可以切两个切口。如果是一个切口,则连接时可能会产生一些我们不需要的连接物(如自身环化等);如果是两个切口则质粒会丢失一段DNA片段,但可以控制连接物就是我们需要的目的基因和质粒的连接。切割时注意不要破坏了载体上的标记基因(至少保留有一个标记基因)、终止子、启动子、复制原点等。 ②切割质粒的酶可以用同一种限制酶,也可以用两种不同的限制酶。 ③切割产生的末端有三种情况:都是平末端,都是粘性末端,一边是粘性末端,一边是平末端。 2.3 限制性核酸内切酶的说明 不同的酶识别序列一般不同,但也有识别序列相同的。如果识别序列相同,切割点也相同则切割产生的粘性末端一样。一种酶的识别序列中可能包含另外一种酶的识别序列,切割时可以产生相同的粘性末端。不同的酶识别的序列一般不同,但有时也可能相同,这时切割产生的粘性末端也相同。 2.4 酶切割后的DNA片段的连接 如果是用一种限制性内切酶切割质粒表达载体和目的基因, 不可以防止载体和目的基因的自身环化,两个DNA片段连接产物有:目的基因—目的基因;目的基因—载体;载体—载体。这些连接物可以环化。如果是用两种不同的限制性内切酶切割载体和目的基因, 可以防止载体和目的基因的自身环化, 同时可以防止目的基因和质粒表达载体在酶切后不发生任意连接。两个DNA片段连接产物也有:目的基因—目的基因;目的基因—载体;载体—载体。这些连接物也可以环化。

常见限制性内切酶识别序列(酶切位点)

The Type II restriction systems typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and cleave at constant positions at or close to that sequence to produce 5-phosphates and 3-hydroxyls. Usually they require Mg 2+ ions as a cofactor, although some have more exotic requirements. The methyltransferases usually recognize the same sequence although some are more promiscuous. Three types of DNA methyltransferases have been found as part of Type II R-M systems forming either C5-methylcytosine, N4-methylcytosine or N6-methyladenine. ApaI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5'GGGCC^C 3' BamHI(类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' G^GATCC 3' BglII (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' A^GATCT 3' EcoRI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' G^AATTC 3' HindIII (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' A^AGCTT 3' KpnI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' GGTAC^C 3' NcoI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' C^CATGG 3' NdeI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' CA^TATG 3' NheI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' G^CTAGC 3' NotI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' GC^GGCCGC 3' SacI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' GAGCT^C 3' SalI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' G^TCGAC 3' SphI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' GCATG^C 3' XbaI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' T^CTAGA 3' XhoI (类型:Type II restriction enzyme )识别序列:5' C^TCGAG 3' 当然,上面总结的这些肯定不全,要查找更多内切酶的识别序列,你还可以选择下面几种方法: 1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站;NEB网站上提供的识别序列图表下载 2. 用软件如:Primer Premier5.0或Bioedit等,这些软件均提供了内切酶识别序列的信息;

限制酶使用说明

限制酶使用说明 一、分类 目前,已被发现的限制酶,根据其反应的必须因子和切断点等特性,被分为以下三大类: 类别反应必须因子切点酶例 I 型 s-腺苷基蛋氨酸、ATP、Mg2+识别部位和切点不同,切断部位不定Eco B、Eco K II 型 Mg2+切断识别部位或其附近的特定部位Eco R I、Bam H I III 型 ATP、Mg2+识别部位和切点不同,但切断特定部位Eco P I、Hin f III 应用于基因工程研究用的限制酶,一般全是II型酶,现在市场上销售的酶都属于II型酶, 这些限制酶由于其反应条件和底物DNA种类的不同,其切断状况及出现Star活性的频率等各有不同,并且其程度也根据酶的不同而千差万别。因而在使用限制酶时,必须对这些要素充分注意,确保目标序列的切断反应能顺利进行,下面具体介绍一下使用限制酶时的一些注意点。 二、注意事项 1. 甲基化的影响 从带有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制备的DNA,其碱基的一部分已经被甲基化,因此即便使用能够识别、切断被甲基化部分的序列的限制酶,也几乎无法切断被甲基化的部分。被甲基化的部位,根据底物DNA及宿主种类的不同而不同。例如宿主菌为大肠杆菌的情况下,根据宿主的种类有以下两种情况: 在进行转化时,通常使用的菌株为C600、HB101、JM109等,因为都带有dam、dcm甲基化酶,所以使用这些菌株制备的DNA时,必须注意。另外,动物由来的DNA,CG序列多为5m CG;植物由来的DNA,CG及CNG序列多为5m CG和5m CNG。 2. Star活性 限制酶在一些特定条件下使用时,对于底物DNA的特异性可能降低。即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断,这个现象叫Star活性。Star活性出现的频率,根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同,可以说几乎所有的限制酶都具有Star活性。并且,它们除了识别序列的范围增大之外,还发现了在DNA的一条链上加入切口的单链切口活性,所以为了极力抑制Star活性,一般情况下,即使会降低反应性能,我们也提倡在低甘油浓度、中性pH、高盐浓度

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