叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定

叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测

定

The latest revision on November 22, 2020

实验报告

课程名称： 植物生理学及实验（甲） 实验类型： 实验名称： 叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定 姓名： 专业： 学号：

同组学生姓名： 指导老师：

实验地点： 实验日期：

一、实验目的和要求 二、实验内容和原理

三、主要仪器设备 四、操作方法与实验步骤

五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析

七、讨论、心得

一、实验目的和要求

1、掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。

2、熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a 和b 的方法及其计算。

二、实验内容和原理

以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。 原理如下：

1、叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。

2、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。

COOCH 3 COO -

C 32H 30ON 4Mg + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH +C20H39OH

COOC 20H 39 COO -

3、取代反应。 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+ ) 褐色 绿色

4、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。

5、定量分析。叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b 及总量，而652可直接用于总量分析。

根据朗伯-比尔定律，最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度C 与吸光值之间有如下的关系： OD 1=Ca*k a1+C b *k b1 OD 2=Ca*k a2+C b *k b2

查阅文献得，叶绿素a 和b 的80％丙酮溶液，当浓度为1g/L 时，比吸收系数k 值如下。

波长/nm

比吸收系数k 叶绿素a 叶绿素b

663

645

将数值代入式子得：OD663=*Ca+*Cb OD645=*Ca+*Cb

经整理后，得到式子：Ca= OD663 - OD645 Cb= OD645 - OD663

三、主要仪器设备 装 订 线

天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机、研具、各种容（量）器、洒精灯等

四、操作方法与实验步骤

1、定性分析：

鲜叶5g+95%30ml （逐步加入），磨成匀浆，过滤入三角瓶中，观察荧光现象。 皂化反应(3ml) ：加KOH 数片剧烈摇均，加石油醚5ml 和H2O 1ml 分层后观察 取代反应（1）：加醋酸约2ml ，取1/2加醋酸铜粉加热。观察颜色变化。

取代反应（2）：鲜叶2-3cm2，加Ac-AcCu 20ml 加热。

2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：

皂化反应的上层黄色石油醚溶液→稀释（470nm OD ）

反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)→稀释（663nm OD ） 两者在400-700nm 处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰

3、叶绿素定量分析：

鲜叶，加，磨成匀浆，各取加80%丙酮,摇匀，4000转离心3min,上清液在645，652，663测定OD ，计算Chla,Chlb 和Chl 总量的值。

五、实验数据记录和处理

1、定性分析：

观察荧光现象，透射光为绿色，反射光为红褐色光。

皂化反应(3ml) ：上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光。下层呈绿色，为叶绿素，吸收红光和蓝紫光。

取代反应（1）：加醋酸约2ml ，变褐（去镁叶绿素），取1/2加醋酸铜粉加热变绿色，为铜代叶绿素。

2、叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：

图 1 图 2

图一在420nm 左右及690nm 左右波长处吸收光谱出现峰值，两者分别位于蓝紫光和红光的波长范围内，根据叶绿素吸收蓝紫光和红光的特性，可以推测图一是叶绿素的吸收光谱。

图二在450nm 以及475nm 波长处吸收光谱出现峰值，都位于蓝紫光的波长范围内，根据类胡萝卜素吸收蓝紫光的特性，可以推测图二是类胡萝卜素的吸收光谱。

3、叶绿素定量分析：

将数值代入式子，计算得：

Ca(mg/L)= OD645=*

mg/L Cb (mg/L) = OD663=*

mg/L CT (mg/L) = Ca+ Cb = mg/L Chla 含量(mg/= （Ca(mg/L)/1000）*2/ *5/ = mg/

Chlb 含量(mg/ = （Cb(mg/L)/1000）*2/ *5/ = mg/

Chl 总含量(mg/ = （CT(mg/L)/1000）*2/ *5/ =

六、实验结果与分析

1、定性实验中，各组实验观测是颜色变化基本相同，区别只是颜色的深浅，与研磨时加入的叶片量、研磨的程度等因素有关。

2、从定量实验所得数据的计算结果来看，实验所用的叶片中，叶绿素a 的含量大 波长/nm

645 652 663 OD 第一组

第二组

平均

约是叶绿素b的三倍左右。

3、邻组所得实验数据与我们的数据有一定差距，分析可能是以下几个原因造成的：1.研磨的充分程度不同 2.所取叶片位置不同，导致叶绿素含量有所区别

七、讨论、心得

1、为什么叶绿素吸收红光和兰紫光

叶绿素有基态（G），第一单线激发态（E1）和第二单线激发态（E2）及第三线态（E3），光子吸收必须遵守普朗克定律。被吸收光子能量必须等于激发态和基态的能量差。蓝紫光能量大，可使叶绿素分子中的电子跃迁到E2，而红光能量小，只能使其跃迁到E1，故叶绿素只能吸收蓝紫光和红光。

2、为什么可用皂化后的叶绿素盐来测定叶绿素的吸收光谱

因为由于叶绿素皂化反应后的叶绿素盐并不影响叶绿素分子的骨架结构，叶绿素对光的吸收规律与叶绿素盐对光的吸收规律几乎是相同的，而且皂化反应可以从叶绿体色素中只筛选出叶绿素，排除了其他色素的干扰，所以可用皂化后的叶绿素盐来测定叶绿素的吸收光谱。

高中生物必修一实验八 叶绿体中色素的提取和分离

实验八叶绿体中色素的提取和分离 教学目的 1．初步掌握提取和分离叶绿体中色素的方法。 2．探索叶绿体中有几种色素。 实验原理 1．叶绿体中的色素能溶解在丙酮（有机溶剂，酒精、汽油、苯、石油醚等）中，所以用丙酮可提取叶绿体中色素。 2．色素在层析液中溶解度不同，溶解度高的色素分子随层析液在滤纸条上的扩散得快，溶解度低的色素分子随层析液在滤纸条上的扩散得慢，因而可用层析液将不同的色素分离。 实验程序 （1）称取5g绿色叶片并剪碎 提取色素 （2）加入少量SiO2、CaCO3和5ml丙酮收集到试管内并塞紧管口 （1）将干燥的滤纸剪成6cm长，1cm宽的纸条，剪去一端两角（使层析液同时 到达滤液细线）制滤纸条 （2）在距剪角一端1cm处用铅笔画线 （1）用毛细管吸少量的滤液沿铅笔线处小心均匀地划一条滤液细线 滤液划线 （2）干燥后重复划2-3次 （1）向烧杯中倒入3ml层析液（以层析液不没及滤液细线为准） 纸上层析（2）将滤纸条尖端朝下略微斜靠烧杯内壁，轻轻插入层析液中 （3）用培养皿盖盖上烧杯 观察结果：滤纸条上出现四条宽度、颜色不同的彩带（如下图） 最宽：叶绿素a； 最窄：叶绿素b； 相邻色素带最近：叶绿素a和叶绿素b； 相邻色素带最远：胡萝卜素和叶黄素。 实验关键 1．选材时应注意选择鲜嫩、色浓绿、无浆汁的叶片。如菠菜叶、棉花叶、洋槐叶等。2．画滤液细线时，应以细、直、颜色浓绿为标准，重复画线时必须等上次画线干燥衙再进行，重复2-3次。 3．层析时不要让滤液细线触及层析液。 注意事项 1．因丙酮和层析液都是易挥发且有一定毒性的有机溶剂，所以研磨要快，收集的滤液要用棉塞塞住，层析时要加盖，尽量减少有机溶剂的挥发。 2．在研磨时要加少许二氧化硅，目的是为了研磨充分，有利于色素的提取；加少许碳酸钙的目的是为了防止研磨过程中，叶绿体中的色素受到破坏。 3．分离色素时，一定不要让滤纸条上的滤液细线接触到层析液，这是因为色素易溶解在层析液中，导致色素带不清晰，影响实验效果。

叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定

! 课程名称：植物生理学及实验（甲）实验类型： + ■■ + I- i实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定 ■■ jl + : 姓名： * 专业：学号： ■■ jl 1 同组学生姓名：指导老师： + 装 实验地点：实验日期: 订 一、实验目的和要求线 r 二、实验内容和原理 i三、主要仪器设备 卜 四、操作方法与实验步骤 + 1 五、实验数据记录和处理六、实验结果与分析 七、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。 2、熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b的方法及其计算。 二、实验内容和原理 以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。 原理如下: 实验报告

1、叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%勺乙醇或80%勺丙酮提取。 2、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。 COOGH COO MoONMg \ + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH +C20H39OH COOCHk COO 3、取代反应。在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg+可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+ ) 褐色绿色 4、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。 5、定量分析。叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。 根据朗伯-比尔定律，最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度C与吸光值 之间有如下的关系：OD=Ca*k a1+G*k b1 OD=Ca*k a2+G*k b2 查阅文献得，叶绿素a和b的80%丙酮溶液，当浓度为1g/L时，比吸收系数k值如下。 比吸收系数k 波长/nm

叶绿素理化性质及含量

实验报告 课程名称： 植物生理学（乙）指导老师： 廖敏 成绩： 实验名称： 叶绿素理化性质和含量 实验类型： 定量探究型 同组学生姓名： 方昊 一、实验目的和要求（必填） 三、主要仪器设备（必填） 五、实验数据记录和处理 七、讨论、心得 二、实验内容和原理（必填） 四、操作方法和实验步骤 六、实验结果与分析（必填） 一、实验目的和要求 掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法； 二、实验内容和原理 以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量 分析。原理如下： 1. 叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取； 2. 叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素 分开； 3. 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素； 4. 叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光； 5. 叶绿素吸收红光和蓝紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a 、b 及总量，而652可直接用于总量分析。 专业：农业资源与环境 姓名： 吴主光 学号： 3110100403 日期： 2013.10.17 地点： 生物实验中心 装 订 线

三、主要仪器设备 1. 天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机、研具、各种容（量）器、洒精灯等 四、操作方法、实验步骤以及实验现象 定性分析： 鲜叶5g+95%30ml（逐步加入）,磨成匀浆 过滤入三角瓶中，观察荧光现象：透射光绿色，反射光红色。 皂化反应（3ml）：加KOH数片剧烈摇均，加石油醚5ml和H2O1ml分层后观察：上层呈黄色，为类胡萝卜素，吸收蓝紫光；下层呈绿色，为叶绿素，吸收红光和蓝紫光。 取代反应（1）：加醋酸约2ml，变褐（去镁叶绿素）；取1/2加醋酸铜粉加热，变鲜绿色，为铜代叶绿素。 取代反应（2）：鲜叶2-3cm2，加Ac-AcCu 20ml加热，观察： 3 min变为褐绿色的去镁叶绿素， 5 min后，变为深绿色的铜代叶绿素。 叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定： 皂化反应的上层黄色石油醚溶液（稀释470nm OD 0.5-1） 反复用石油醚粹取，直到无类胡萝卜素，离心得叶绿素(盐)（稀释663nm OD 0.5-1) 在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰. 叶绿素定量分析：鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，取0.2ml加80%丙酮4.8ml,摇匀，4000转离心3min,上清液在645，652，663测定OD，计算Chla,Chlb 和Chl总量的值。 五、实验数据记录和处理

植物叶绿素测定方法

叶绿素含量的测定 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。 （二）仪器设备：1）分光光度计；2）电子顶载天平（感量0.01g）；3）研钵；4）棕色容量瓶； 5）小漏斗；6）定量滤纸；7）吸水纸； 8）擦境纸；9）滴管。 （三）试剂：1）95%乙醇（或80%丙酮）（v丙酮：v乙醇=2：1的95%水溶液）；2）石英砂；3）碳酸钙粉。暗中2h，0.5g，25ml 三、实验步骤 1）取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。 2）称取剪碎的新鲜样品 0.2g ，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml 95%乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5m 3）取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 4）用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。 5）把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内，以95%乙醇为空白，在波长663nm 和645nm下测定吸光度。在波长663nm、645nm下或652nm测定吸光度。 四、实验结果计算 叶绿素a的含量 = 12.7 ? OD 663 – 2.69 ? OD 645 叶绿素a的含量 = 22.9 ? OD 645 – 4.86 ? OD 663 叶绿素a、b的总含量 = 8.02 ? OD 663 + 20.20 ? OD 645

叶绿素的提取及理化性质的鉴定

植物生理学实验 叶绿体色素的提取分离及其理化性质 姓名 学号 系别 班级 实验日期 同组姓名

摘要：为探究植物叶绿素理化性质，根据不同的叶绿体色素分子结构不同，在有机溶剂中的溶解性和吸附剂上的吸附性差异，本实验在提取菠菜叶片叶绿体色素（叶绿素和类胡萝卜素）后，利用纸层析法将不同的色素分离的方法，对植物叶绿素的理化性质进行观察与检验。 一、实验原理及实验目的 实验原理： 1、提取: 叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)，这两类色素均不溶于水，而溶于有机溶剂，故常用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。 2、分离: 当溶剂沿支持物不断向前推进时，由于叶绿体中不同色素分子结构不同，在两相(流动相与固定相)间具有不同的分配系数，因此它们移动速率不同。对叶绿体色素进行层析可将不同色素分离。 3、理化性质的观察: 叶绿素是一种二羧酸酯，在碱作用下，发生皂化反应；在弱酸作用下，叶绿素中镁可被氢原子取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，叶绿素具有荧光，故从与入射光相垂直的方向观察叶绿素溶液呈血红色。叶绿素的化学性质不稳定，易受强光氧化，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。 分子吸收光能后，从基态转变到激发态。叶绿素分子有两种单线激发态，对应两个主要的光吸收区。 分子在激发态停留的时间不超过数纳秒（10-9秒） 由激发态回到基态的过程称为衰变（Decay)。 叶绿素a：C 55H 72 O 5 N 4 Mg，MW=893.4891 叶绿素b：C 55H 70 O 6 N 4 Mg，MW=907.4727 胡萝卜素：C 40H 56 ， MW= 536.8726 叶黄素：C 40H 56 O 2 ， MW=568.8714 实验目的： 以植物叶片组织为材料,提取叶绿体色素;以纸层析法分离其成分;鉴定叶绿体色素的理化性质. 二、实验材料和方法 1、实验材料：菠菜 2、实验用具：天平、研钵、三角漏斗、滤纸、层析缸、毛细管、分光镜、量筒、烧杯、试 管等 3、实验试剂：丙酮、碳酸钙、层析液（石油醚：丙酮=25：3)，20%KOH-甲醇、乙醚、1%HCl、 醋酸铜 三、实验步骤 1、叶绿体色素的提取 （1）取新鲜菠菜叶片2克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵; （2）加入少许石英砂和CaCO 3 ,再加入无水丙酮10ml,研磨成匀浆,再加丙酮15ml; （3）用漏斗滤去残渣,得叶绿体色素提取液(置于暗处). 2、纸层析分离叶绿体色素 （1）层析样纸制备,将优质滤纸剪成3cm×9cm的长条,将一端剪成中央留约1cm×0.5cm的

(完整word版)叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定 一、原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A 与其中溶质浓度C 和液层厚度L 成正比，即A ＝αCL 式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm 时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。 如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a 、b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A ，并根据叶绿素a 、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a 、b 时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 已知叶绿素a 、叶绿素b 的80%丙酮溶液在红外区的最大吸收峰分别位于663、645nm 处。已知在波长663nm 下叶绿素a 、叶绿素b 在该溶液中的吸光系数的分别为82.04和9.27；在波长645nm 处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据加和性原则列出以下关系式： A663=82.04Ca+9.27Cb （1） A645=16.76Ca+45.60Cb （2） 式（1） （2）A 663nm 和A645nm 为叶绿素溶液在663nm 和645nm 处的吸光度，C a C b 分别为叶绿素a 、叶绿素b 的浓度，以mg/L 为单位。 解方程（1） （2）组得 C a =12.72 A 663—2.59 A 645 (3) C b =22.88 A 645—4.67 A 663 (4) 将C a +C b 相加即得叶绿素总量C T C T ＝ C a 十C b ＝20.29A 645—8.05 A 663 (5) 从公式（3）、（4）、（5）可以看出，，就可计算出提取液中的叶绿素a 、b 浓度另外，由于叶绿素a 叶绿素b 在652nm 的吸收峰相交，两者有相同的吸光系数（均为30.5），也可以在此波长下测定一次吸光度（A 652）而求出叶绿素a 、叶绿素 b 总量 所测定材料的单位面积或单位重量的叶绿素含量可按下式进行计算： C T ＝ 5 .341000 652 A (6) 有叶绿素存在的条件下，用分光光度法可同时测出溶液中类胡萝卜素的含量。Licht-enthaler 等对Arnon 进行了修正，提出了 80%丙酮提取液中3种色素含量的计算公式： C a ＝12.21A 663—2.59 A 646 (7)

叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定

实验报告 植物生理学及实验（甲）实验类型：课程 名称：实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶 绿素含量的测定姓名：专业：学 号：指导老师：同组学生姓名： 实验日期：实验地点： 二、实验内容和原理一、实验目的和要求装 四、操作方法与实验步骤三、主要仪器设备订 六、实验结果与分析五、实验数据记录和处理 七、讨论、心得一、实验目的和要求、掌握植物中叶绿体色素的分离和 性质鉴定、定量分析的原理和方法。1 和b的方法及其计算。a2、熟悉在 未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素二、实验内容和原理以青菜为 材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。 原理如下：80%的乙醇或95%叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，1、常用的丙酮提取。、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应， 形成绿色的可溶性叶绿素2． 盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。- COOCHCOO3 Mg + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH

HONC43230+C20H39OH 、3H+可依次被在酸性或加温条件下，叶-COOCOOCH39 20 绿素卟啉环中的Mg++取代反应。Mg2+, Cu2+ 取代Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+和H+ ) 取代(Zn2+) 绿色褐色 、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。4645其中叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，5、定量分析。 652可直接用于总量分析。663用于定量叶绿素a,b及总量，而和C最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度根据朗伯-比尔定律， *k+C*kOD=Ca*k与吸光值之间有如下的关系： OD=Ca*k+C b2 1g/L和b的80查阅文献得，2b1 b1a1a2b时，比吸收系％丙酮溶液，当浓度为 叶绿素a 值如下。数k k 比吸收系数波长/nm b 叶绿素a 叶绿素 9.27 82.04 663 45.60 645 16.75

叶绿素理化性质的测定

一、原理 叶绿素是一种二羧酸—叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定；叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。 皂化反应式如下： 二、仪器与用具 20ml刻度试管；10ml小试管；试管架；分光镜；石棉网；药匙；烧杯（100ml）；酒精灯；玻棒；铁三角架；刻度吸量管2ml、5ml各1支；火柴。 三、试剂 1. 95%乙醇；苯；醋酸铜粉末；5%的稀盐酸； 2. 醋酸-醋酸铜溶液：6g醋酸酮溶于100ml 50%的醋酸中，再加蒸馏水4倍稀释而成； 3. KOH-甲醇溶液：20g KOH溶于100ml甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。 四、方法 用叶绿体色素乙醇溶液和水研磨匀浆，进行以下实验。 1.光对叶绿素的破坏作用 （1）取4支小试管，其中两支各加入5ml用水研磨的叶片匀浆，另外两支各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀释1倍。 （2）取1支装有叶绿素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片均浆的试管，放在直射光下，另外两支放到暗处，40min后对比观察颜色有何变化，解释其原因。 2.荧光现象的观察 取1支20ml刻度试管加入5ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同？解释原因。 3.皂化作用（绿色素与黄色素的分离） （1）在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀。

叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定 一.实验原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL.式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。 如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。就是吸光度的加和性。如欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b 及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 植物叶绿素含量测定----丙酮提取法 高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素(光合色素)吸收的。叶绿体色素由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。叶绿体色素的提取、分离和测定是研究它们的特性以及在光合中作用的第一步。叶片叶绿素含量与光合作用密切相关，是反眏叶片生理状态的重要指标。在植物光合生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。叶绿素含量也是指导作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。 ● 叶绿素不溶于水，溶于有机溶剂，可用多种有机溶剂，如丙酮、乙醇或二甲基亚砜等研磨提取或浸泡提取。叶绿色素在特定提取溶液中对特定波长的光有最大吸收，用分光光度计测定在该波长下叶绿素溶液的吸光度(也称为光密度)，再根据叶绿素在该波长下的吸收系数即可计算叶绿素含量。 ●利用分光光计测定叶绿素含量的依据是Lambert-Beer定律，即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。其数学表达式为： ●A=Kbc 式中：A为吸光度；K为吸光系数；b为溶液的厚度；c为溶液浓度。 ●叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。叶绿素a 和b在663nm处的吸光系数（当溶液厚度为1cm，叶绿素浓度为g·L-1时的吸光度）分别为82.04和9.27；在645nm处的吸光系数分别为16.75和45.60。根据Lambert-Beer定律,叶绿素溶液在663nm和645nm处的吸光度（A663和A645）与溶液中叶绿素a、b和总浓度（a+b）（Ca、Cb 、Ca十b，单位为g·L-1），的关系可分别用下列方程式表示： ●A663=82.04C a+9.27C b （1） ●A645=16.76C a+45.60C b（2） ●C a=12.7 A663—2.59 A645(3) ●C b=22.9 A645—4.67 A663 (4) ●C a十b＝20.3 A645—8.04 A663 (5) ●

绿叶中色素的提取和分离

绿叶中色素的提取和分离》实验教学设计 学院附中陈建志 一、教材分析 生物学是以实验为基础的科学，实验教学对提高学生的生物科学素养起着无可替代的重要作用，他是素质教育和创新教育的重要场所和前沿阵地，也是基础教育改革的基础、前提和保证。 《绿叶中色素的提取和分离》是一个探究性实验，通过本实验，可以让学生知道绿叶中色素的种类和颜色对植物叶片颜色的影响，是学习光合作用的基础。本实验要求层次较高、操作难度较大、考查频率高的一个实验，但是按照教材的实验步骤和方法，多数学生把握不够，操作不当。分离后的色带或不全或色浅，辨认困难，实验效果皆不理想。笔者在实验教学中将有关操作作了调整。 1、教材中值得推敲的地方 实验选材和研磨教材推荐用菠菜为实验材料。菠菜生长受季节的限制，有的季节很难采集。另外菠菜叶片含水量较高，较多的水分子与丙酮分子接触，降低了丙酮对色素分子的萃取率，导致提取液中含色素分子少，进而影响实验结果。 教材中选用5克叶片．相对于仅需的几滴滤液来说，显然太多，也增加了研磨的时间和难度。相对于5克叶片，5毫升丙酮又显太少。丙酮极易挥发，实验中常出现叶片未研碎。丙酮已挥发干的情况。因为研磨不彻底，提取液中色素含量少。 研磨剂的配制学生只是按课本要求按顺序添加无水、乙醇、CaCO、3 SiO2,并不能很深刻的理解添加这些物质的原理和作用。 过滤装置课本要求用放置单层尼龙布的漏斗过滤滤液，但实际操作中这个方法耗时且费力。 画线方法由于学生平时的实验操作中很少用到毛细吸管，所以采用课本要求的方法划线，很难做到滤液细线细、直、均匀的要求。色素分离装置分离色素是将滤纸条插入到

加入层析液的烧杯中，为了防止层析液挥发，还可以给烧杯加盖。而实际操作很难做到滤纸条在烧杯中保持竖直，也不能有效减少层析液的挥发。 分离色素的方法课本是让色素在长形滤纸条上扩散分离，方法单一，不能很好地激发学生的创新思维。 2 实验改进 只要是新鲜、浓绿的叶片皆可选，但要对叶片作些处理。将叶片用沸水处理，即将2克叶片置于沸水中煮20—40 秒（时间不宜过长。否则会破坏色素分子的结构）后。立即捞出置于冷水中降温，再用吸水纸吸千水分．剪碎后放人研钵。 研磨剂的配制 试验设计： 1）分别在A 、B、C 三个研钵中加入 5 克剪碎的叶片 2） A 中加少量的二氧化硅和无水乙醇， B 中加少量的二氧化硅、碳酸钙和水 C 中加少量的二氧化硅、碳酸钙和无水乙醇； 3）经研磨、过滤得到三种不同颜色的溶液（A黄绿色、B几乎无色、 C 深绿色）； 4）分析实验结果得出结论：碳酸钙可以防止色素被破坏，色素可以溶于酒精但不溶于水。 通过分组对照，让学生通过具体的实验探究，更直观更容易理解提取色素过程中所添加的各种物质的作用。 过滤装置的改进将过滤用的尼龙布改为用棉花塞住漏斗口过滤，一个人就能独立完成，而且过滤速度快，操作更为简单。 画线方法的研究这一步是本实验的一个操作难点，学生很难用毛细吸管画出细、直、均匀的滤液细线。如果用钢笔沾色素、硬币边缘压线、盖玻片或者棉线画线等，则操作起来更容易。色素分离装置的制作，用厚纸板作个烧杯盖，上面剪开 1.5 —2 厘米的缝隙，滤纸条只需要从层析缸上盖子的缝隙插入到层析液中，根据实验需要可以选择缝隙数量不同的盖子做出调整。分离色素的方法的创新1）用圆形滤纸片分离。用圆形滤纸片分离，取平面培养皿 1 只，将一干燥的圆形定性滤纸盖在培养皿中，在圆形滤纸（直径为l0 cm ）中央滴上2 ~ 3滴色素提取液，静置约1 min,在滤纸的中央点成圆形的色素

叶绿素含量测定方法(精)

叶绿素含量测定方法---丙酮法 由于微藻的生长周期比较复杂，包括无性繁殖阶段和有性繁殖阶段，其在不同阶段的生理形态不同，有时藻细胞会聚集在一起，以片状或团状形式存在，在显微镜下难以确定其所包含的细胞数量。 藻细胞中叶绿素的含量（特别是叶绿素a的含量）通常随与细胞的生长呈较好的线性关系，因此可通过测定藻细胞中叶绿素含量变化来反映微藻的生长情况。叶绿素测定采用丙酮研磨提取法。 取适量藻液于10 mL离心管中在4000 rpm转速下离心10 min，弃去上清液，藻泥中加入适量的100 %的丙酮。采用丙酮提取法时在试管研磨器中冰浴研磨5 min，4000 rpm离心后，上清液转入10 mL容量瓶中。按上述方法对藻体沉淀进行萃取，直至藻体沉淀呈白色为止。定容后，采用722S型可见分光光度计分别测定645 nm和663 nm下萃取液的吸光值，叶绿素含量用以下公式进行计算（Amon,1949）： 叶绿素a含量用以下公式进行计算： Chlorophyll a (mg/L) = (12.7×A663 nm－2.69×A645 nm)×稀释倍数 叶绿素b含量用以下公式进行计算： Chlorophyll b (mg/L) = (22.9×A645 nm－4.64×A663 nm)×稀释倍数 叶绿素总含量用以下公式进行计算： Chlorophyll a＋b (mg/L) = (20.2×A645 nm＋8.02×A663 nm)×稀释倍数 由于丙酮的沸点较低，较高温度下挥发很快。此外，叶绿素稳定性较差，见光易分解，因此，本实验中叶绿素的提取和测定均在低温黑暗条件下进行，以减少提取过程中的损失。 叶绿素提取方法 提取液：本试验用DMSO/80%丙酮(l/2，v/v)提取的叶绿素，谭桂英周百成底栖绿藻叶绿素的二甲基亚砜提取和测定法* 海洋与湖沼 1987 18（3）295--300. 一、直接浸提法： 1、准确量取10ml藻液,加到15ml离心管中，放在台式离心机离心，3500r/min （根据不同的藻选择不同那个的离心转速）离心5min倒上清；留藻泥。随后在盛有藻泥的离心管中加入蒸馏水，与藻泥混匀后再次离心，目的是除去藻细胞表面的盐份，此清洗过程重复三次。 2、往藻泥中加二甲基亚砜3.33ml，65℃水浴9h，20h； 3、然后离心，将上清转移到10ml棕色瓶中， 4、添加6.67ml80%丙酮到离心管中，混匀，离心，再将上清转移到10ml棕色瓶中。 5、定容，待测。

叶绿素含量的测定

植物生理学实验报告实验题目：叶绿素含量的测定 姓名 班级 学号

一、实验原理和目的 根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比。叶绿素(丙酮)在652nm(混合）、663nm、645nm有最大吸收峰。 叶绿素(95%乙醇)在665nm、649nm，类胡萝卜素在470nm有最大吸收峰，根据在分光光度计下测定的吸光度，求得叶绿素的含量 二、实验器具和步骤 植物材料：女贞 实验器具：分光光度计；电子天平；研钵；试管；小漏斗；滤纸；吸水纸；移液管；量筒；剪刀 试剂：95％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉 步骤：1.称取剪碎的新鲜样品0.1g 左右，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3～5ml 95％乙醇，研成均浆，继续研磨至组织变白。静置3～5min 2. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到10ml试管中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 3.用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入漏斗中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至10 ml ，摇匀 4. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm、470nm下测定吸光度 5. 计算公式： 叶绿素的含量（mg/g）= (浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重。 Ca=13.95A665－6.88A649； Cb=24.96A649－7.32A665 C类=(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245 单位：mg/L 三、实验数据和作业

2、计算叶绿素含量 计算公式： 叶绿素的含量（mg/g）= (浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重。 Ca=13.95A665－6.88A649； Cb=24.96A649－7.32A665 C类=(1000A470-2.05Ca-114.8Cb)/245 单位：mg/L 由上面的公式进行代入计算，有： Ca=13.95*1.820-6.88*0.953=18.83236 Cb=24.96*0.953-7.32*1.820=10.46448 C类=（1000*1.948-2.05*18.83236-114.8*10.46448）/245=2.8901 则：叶绿素含量=（29.29684*10*0.001*1）/0.1=2.9297 四、数据分析 实验中可能清洗研钵和滤纸不是特别干净可能造成误差 五、思考题 为什么提取叶绿素时干材料一定要用80％的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取？答：因为叶绿素存在于叶绿体内囊体上与其上的蛋白质组成色素蛋白复合体，要 分离叶绿素和蛋白质必须有水，叶绿素的头部为极性的，有亲水性

叶绿素理化性质的测定

叶绿素理化性质的测定 一、原理 叶绿素是一种二羧酸—叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定；叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。 皂化反应式如下： 二、仪器与用具 20ml刻度试管；10ml小试管；试管架；分光镜；石棉网；药匙；烧杯（100ml）；酒精灯；玻棒；铁三角架；刻度吸量管2ml、5ml各1支；火柴。 三、试剂 1. 95%乙醇；苯；醋酸铜粉末；5%的稀盐酸；

2. 醋酸-醋酸铜溶液：6g醋酸酮溶于100ml 50%的醋酸中，再加蒸馏水4倍稀释而成； 3. KOH-甲醇溶液：20g KOH溶于100ml甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。 四、方法 用叶绿体色素乙醇溶液和水研磨匀浆，进行以下实验。 1. 光对叶绿素的破坏作用 （1）取4支小试管，其中两支各加入5ml用水研磨的叶片匀浆，另外两支各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用95%乙醇稀释1倍。 （2）取1支装有叶绿素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片均浆的试管，放在直射光下，另外两支放到暗处，40min后对比观察颜色有何变化，解释其原因。 2. 荧光现象的观察 取1支20ml刻度试管加入5ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不同？解释原因。 3. 皂化作用（绿色素与黄色素的分离） （1）在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5ml 20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀。 （2）片刻后，加入5ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1~1.5ml蒸馏水，轻轻混匀（勿激烈摇荡），于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静置。可以看到溶液逐渐分为两层，下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b（以及

叶绿素含量的测定

植物生理学实验报告 实验题目：叶绿素含量的测定 姓名 班级 学号 一、实验原理和目的 根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比。 叶绿素(丙酮)在652nm(混合）、663nm、645nm有最大吸收峰。 叶绿素(95%乙醇)在665nm、649nm，类胡萝卜素在470nm有最大吸收峰，根据在分光光度计下测定的吸光度，求得叶绿素的含量 二、实验器具和步骤 植物材料：女贞 实验器具：分光光度计；电子天平；研钵；试管；小漏斗；滤纸；吸水纸；移液管；量筒；剪刀 试剂：95％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉 步骤：1.称取剪碎的新鲜样品左右，放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及3～5ml 95％乙醇，研成均浆，继续研磨至组织变白。静置3～5min 2. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到10ml试管中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。 3.用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入漏斗中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至10 ml ，摇匀 4. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm、470nm下测定吸光度 5. 计算公式： 叶绿素的含量（mg/g）= (浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重。 Ca=－； Cb=－ C类= 单位：mg/L 三、实验数据和作业 2、计算叶绿素含量 计算公式： 叶绿素的含量（mg/g）= (浓度×提取液体积×稀释倍数）/样品鲜重。 Ca=－； Cb=－ C类= 单位：mg/L 由上面的公式进行代入计算，有： Ca=* Cb=* C类=（1000*）/245= 则：叶绿素含量=（*10**1）/= 四、数据分析

绿叶中色素的提取和分离

实验：绿叶中色素的提取和分离 杨琪 一．实验原理 实验中的色素能够溶解在有机溶剂无水乙醇(丙酮，汽油，苯等)中，所以，可以用无水乙醇提取绿叶中的色素。 绿叶中的色素不止一种，他们都能溶解在层析液中。然而，它们在层析液中的溶解度不同；溶解度高的随层析液在滤纸上扩散的快；反之则慢。这样，几分钟之后绿叶中的色素就会随着层析液在滤纸上的扩散而分离开。且溶解度最高的是胡萝卜素，它随层析液在滤纸上扩散的最快；叶黄素和叶绿素a的溶解度次之，叶绿素b的溶解度最低，扩散的最慢。 二．实验目的 1. 掌握提取和分离叶绿体色素的方法 2. 探究绿叶中含有几种色素 三．实验材料用具 材料：新鲜的绿色叶片（如菠菜的绿叶）。无水乙醇，层析液，SiO2、CaCO3 用具:干燥的定性滤纸，烧杯（100ml）,小试管，试管架，培养皿盖，棉塞，研钵，玻璃漏斗，尼绒布，毛细吸管，剪刀，药勺，量筒（10ml）,天 平，铅笔 四．实验步骤 1.提取绿叶中的色素 取材：用天平称取5g的新鲜绿叶，剪碎，放入研钵中。向研钵中加入少许SiO2、CaCO3 ，再加入10ml无水乙醇，进行快速，充分的研磨。 过滤：将研磨液迅速倒入玻璃漏斗（漏斗基部放一块单层尼绒布）中进行过滤。将滤液收集到小试管中，及时用棉塞将试管口塞严。 2.制备滤纸条 将干燥的定性滤纸剪成略小于试管长与直径的滤纸条，将滤纸条的一端剪去两角，并在距这一端1cm处用铅笔画一条细的横线。 3.画滤液细线 用毛细吸管吸取少量滤液，沿铅笔线均匀的画出一条细线。待滤液干后，再画一两次 4.分离绿叶中的色素 将适量的层析液倒入烧杯中，将滤纸条（有滤液细线的一端朝下）略微倾斜靠着烧杯的内壁，轻轻插入层析液中，随后用培养皿盖盖住烧杯口。注意，不能让滤液细线触及层析液 5.观察与记录 几分钟以后，打开培养皿盖，取出滤纸条，干燥后观察滤纸条上的色素带，以及每条色素带的颜色和宽度，将观测结果记录下来。 6．观察结果分析结果：滤纸条上出现四条宽度、颜色不同的彩带（如下图）

叶绿素的提取与含量测定

实验报告 课程名称： 植物生理学实验 指导老师： 成绩：__________________ 实验名称： 叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定 实验类型： 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 一、 实验目的和要求： 1． 掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定。 2． 掌握定量分析的原理和方法。 二、 实验内容和原理： 以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。原理如下： 1．叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。 2．皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。 3．取代反应。 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+,可依次被H+和Cu2+装 订

取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。 4．叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。 5．定量分析。叶绿素吸收红光和蓝紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。 三、实验材料与试剂 材料：青菜叶 试剂：KOH固体、醋酸铜粉末、醋酸 四、主要仪器设备： 1．天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机 2．研具、PE管、酒精灯等 五、操作方法和实验步骤（必填） 1．定性分析： 荧光现象：鲜叶3-5g+95%乙醇15ml（逐步加入）,磨成匀浆，过滤入三角瓶，观察荧光现象 O 1ml，分层后观察皂化反应：加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和H 2 取代反应：加醋酸约1ml，观察颜色，取1/2加醋酸铜粉，加热变亮绿色2．叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定： 皂化反应的上层黄色石油醚溶液（稀释470nm OD ），在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素的吸收峰 反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)，（稀释663nm OD ），分别测定叶绿素的吸收峰

叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定

叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测 定 The latest revision on November 22, 2020

实验报告 课程名称： 植物生理学及实验（甲） 实验类型： 实验名称： 叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定 姓名： 专业： 学号： 同组学生姓名： 指导老师： 实验地点： 实验日期： 一、实验目的和要求 二、实验内容和原理 三、主要仪器设备 四、操作方法与实验步骤 五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析 七、讨论、心得 一、实验目的和要求 1、掌握植物中叶绿体色素的分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法。 2、熟悉在未经分离的叶绿体色素溶液中测定叶绿素a 和b 的方法及其计算。 二、实验内容和原理 以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。 原理如下： 1、叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。 2、皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。 COOCH 3 COO - C 32H 30ON 4Mg + 2KOH C32H30ON4Mg + 2KOH +CH3OH +C20H39OH COOC 20H 39 COO - 3、取代反应。 在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg++可依次被H+和Cu++取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。(H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+ ) 褐色 绿色 4、叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。 5、定量分析。叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b 及总量，而652可直接用于总量分析。 根据朗伯-比尔定律，最大吸收光谱不同的两个组分的混合液，它们的浓度C 与吸光值之间有如下的关系： OD 1=Ca*k a1+C b *k b1 OD 2=Ca*k a2+C b *k b2 查阅文献得，叶绿素a 和b 的80％丙酮溶液，当浓度为1g/L 时，比吸收系数k 值如下。 波长/nm 比吸收系数k 叶绿素a 叶绿素b 663 645 将数值代入式子得：OD663=*Ca+*Cb OD645=*Ca+*Cb 经整理后，得到式子：Ca= OD663 - OD645 Cb= OD645 - OD663 三、主要仪器设备 装 订 线

叶绿素的提取与含量测定

实验报告Array课程名称：植物生理学实验指导老师：成绩：__________________ 实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定实验类型： 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填）二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得 一、实验目的和要求： 1．掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定。 2．掌握定量分析的原理和方法。 二、实验内容和原理： 以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。原理如下： 1．叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂，常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。 2．皂化反应。叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。 3．取代反应。在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+,可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。 4．叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。 5．定量分析。叶绿素吸收红光和蓝紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。 三、实验材料与试剂 材料：青菜叶 试剂：KOH固体、醋酸铜粉末、醋酸 四、主要仪器设备： 1．天平（万分之一）、可扫描分光光度计、离心机 2．研具、PE管、酒精灯等 五、操作方法和实验步骤（必填） 1．定性分析： 荧光现象：鲜叶3-5g+95%乙醇15ml（逐步加入）,磨成匀浆，过滤入三角瓶，观察荧光现象皂化反应：加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和H2O 1ml，分层后观察 取代反应：加醋酸约1ml，观察颜色，取1/2加醋酸铜粉，加热变亮绿色 2．叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定： 皂化反应的上层黄色石油醚溶液（稀释470nm OD 0.5-1），在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素的吸收峰 反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)，（稀释663nm OD 0.5-1），分别测定