原位杂交实验指导
原位杂交
原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization)，是用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再使用与标记物相应的检测系统，在显微镜或电子显微镜下观察细胞内定位。
原位杂交技术可分为直接法和间接法两种。直接法主要用放射性同位素、荧光或酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图,转基因检测,基因表达定位等。并也深入到产前诊断,肿瘤和传染性疾病诊断等临床诊断的领域中。
实验前准备
在实验开始前，需准备好所需的试剂，如2×、0.5×、0.2×的SSC缓冲液，DAB 试剂盒和原位杂交试剂盒（其中包含了蛋白酶K，预杂交液，杂交液，封闭液，兔抗地高辛抗体，HRP-山羊抗兔IgG）
本实验所使用的仪器和耗材有：赛默飞公司提供的F1单道移液器、QSP盒装吸头，湿盒，切片缸，温箱，硅化盖玻片等
本教材主要通过间接法原位杂交来展开实验，大体的流程有：样品玻片制备，杂交前处理，杂交，杂交后处理以及显色。
样品玻片制备
首先制备细胞涂片：将2-3滴PBS重悬的细胞液滴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上，培养箱干燥5min。
杂交前处理
滴加1μg/ml的蛋白酶K稀释液，37°C细胞通透30min后，滴加0.1mol/L 的甘氨酸溶液终止消化。
预杂交：用吸水纸轻轻吸去多余的液体，滴加20μl的预杂交液，盖上硅化盖玻片，37°C湿盒孵育30min。用0.2× SSC缓冲液室温洗三次，每次洗涤5min。
擦去周围多余的液体，滴加20μl的杂交液，盖上硅化盖玻片，将切片置于90°C环境下孵育10min ，将切片置于盛有2× SSC缓冲液的湿盒中，37°C孵育过夜。
杂交后处理
轻轻揭去盖玻片，42°C预热的2× SSC缓冲液洗2次，每次5min；37°C预热的0.5× SSC缓冲液洗1次，每次15min；0.2× SSC缓冲液洗1次，每次15min。滴加封闭液37°C孵育30min，去除多余的液体。滴加兔抗地高辛IgG，湿盒37°C 孵育30min。轻轻去除多余的液体，浸泡在PBS中5min。滴加HRP -山羊抗兔IgG，将切片放入湿盒中37°C孵育30min。
显色
去除多余的液体，滴加新鲜的DAB工作液显色20min后，用蒸馏水终止显色。最后可在显微镜下观察结果。
结果分析
经过DAB染色后，实验组阳性信号呈棕黄色，位于胞浆中。
疑问解答
Doctor A，您能再跟我们讲解一下探针的选择吗？
可以，其实我们使用的探针是指标记的有放射性或带有其他标记物的单链聚核苷酸片段，用于检验核酸样品中特定核苷酸序列。选择探针的最基本原则是有高度的特异性。根据探针的来源，可分为：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA 探针和寡核苷酸探针。每种探针都有优缺点，可根据自己具体的实验进行选择。与此同时，探针的长度、浓度和标记也是我们选择探针时需要考虑的因素。
探针的长度为50-300个核苷酸最佳，同时在合成时也要考虑模板长度。探针过长，不容易进入细胞；过短，特异性不高。探针过长时可用碱水裂解达到长度要求。
对探针的标记主要利用放射性同位素、酶、荧光素、半抗原或生物素标记，其检测系统也十分完善。放射性同位素灵敏度高，但由于其半衰期短、实验周期长、标记物不稳定以及污染环境等缺陷。用酶标记的探针由于分子大、穿透力差以及对温度的要求，在组织原位杂交领域运用不广。荧光素标记便于检测，但荧
光容易淬灭，杂交后的片子无法长久保持。生物素和半抗原成为探针的首先标记物，被用于间接标记原位杂交，目前最常用的是地高辛，灵敏度更高。生物素本身是一种半抗原，当由于它可与抗生物素蛋白或链亲和素有更高的亲和力，所以在实际运用中多采用酶标亲和素。
杂交反应的时间可能随着探针浓度的增加而缩短，但在一个相当大的范围内，杂交反应应在4-6h内完成，杂交时间不能超过24h。反应时间过长，形成的杂交体会自动解链，杂交信号反而会减少。生物素或地高辛标记的探针浓度为5到8微克每毫升，荧光标记的探针浓度为2.5-4μg/ml。
Doctor A，原位杂交的难度较高，在实验进行过程中，我们需要注意什么呢？
的确，这实验需要注意的细节很多。刚才已经讲解了有关探针的选择，选择合适的探针已经成功了一大步。细胞通透化也是这实验的关键，因实验样本不同，选择的通透液和通透消化的时间也不同，此时需要我们自己摸索最佳的通透条件。此外，要严格控制好杂交的温度和时间，探针种类的不同，杂交温度也略有差异。探针变性后需冰上放置冷却，以防复性。在做RNA原位杂交时，要避免RNA 酶的污染。此外，一定要设置对照实验以较好地分析结果。
Doctor A，我之前遇到过非特异性染色，这是怎么一回事呢？
Miss Q，这是做原位杂交的常见问题。非特异性染色可能是来自探针、组织内源性酶、组织细胞、显色系统等。探针特异性不高以及组织细胞内某些成分与显示系统中的抗体成分非特异结合也可造成非特异性染色。组织细胞内源性酶是原位杂交中非特异性着色的重要原因,目前最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶,这两种酶都广泛存在于组织细胞中,因此用这些酶时应有消除内源性酶的相应步骤。如过氧化物酶用3%过氧化氢处理5-10min；10%冰醋酸处理组切片10min,或在底物显色液中加入1Mm/L左旋咪唑可防止内源性碱性磷酸酶的染色。背景颜色深的可能原因是探针浓度过高，信号产生过剩；切片在孵育中干涸；切片未冲洗或冲洗时间过短。而着色浅则可能为试剂未预温或室温低，可延长孵育时间；探针或靶核酸变性不足，可延长变性时间；杂交不完全，可延长杂交时间