前花青素含量测定方法(UV)

编号:TCD0150 原花青素（Proanthocyanidin）含量测定方法

一、仪器与试剂

1．仪器：UV-2101 PC紫外-可见光分光光度计

2．试剂：2%NH4Fe(SO4)2·12H2O的2N盐酸水溶液：量取浓盐酸17mL，加水至100mL，加入2gNH4Fe(SO4)2·12H2O，振摇溶解，即得。(两周内有效) 酸性正丁醇溶液：95mL正丁醇中加入5mL浓盐酸，混匀。(当日使用)

二、溶液制备

1．样品溶液制备精密称取葡萄籽提取物样品约100mg，置50mL容量瓶中，加甲醇溶解定容。精密吸取2mL于50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即为供试液。

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红米原花青素的测定方法

红米原花青素的提取及测定方法 1、标准曲线的配置 标准溶液的配制，用甲醇配制原花青素母液2mg/mL 标准液配制： 母液：2ml 3ml 4ml 5ml 6ml 7ml 8ml 甲醇：8ml 7ml 6ml 5ml 4ml 3ml 2ml 2、试剂 试剂a：10g/L香草醛甲醇溶液，10g香草醛溶于1L甲醇溶液 试剂b：245ml浓硫酸（18.4mol/L）溶于500ml甲醇溶液，并用甲醇定容直1L。 3、提取方法 将红米磨粉后称0.5g，放入15ml试管中，加入8ml的80%甲醇溶液，至于黑暗的地方，每隔2h左右振荡一次，一直浸泡提取8小时。 4、测定方法 吸取1ml提取液或标准液，加入10ml离心管中，然后依次加入2.5ml试剂a和2.5ml试剂b，混匀后35℃下水浴20min，水浴结束后

8000rm离心10min，用移液器取上清液测定其在500nm下的吸光值。 5、参考文献： 1、Sun B, Ricardo-da-Silva JM, Spranger I Critical Factors of Vanillin Assay for Catechins and Proanthocyanidins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46: 4267-4274 2、Gunaratne A, Wu K, Li D, et al. Antioxidant activity and nutritional quality of traditional red-grained rice varieties containing proanthocyanidins. Food Chemistry, 2013, 138: 1153-1161

花青素含量测定

花青素含量测定 实验目的：掌握花青素含量测定的简单方法。 实验原理：花青素又称花色素，是苯并吡喃衍生物，属于多酚类化合物，常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通过糖苷键形成花色苷，是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，也是树木叶片中的主要呈色物质，在植物细胞液泡不同的pH 条件下，呈现不同的颜色。大量研究表明：花色苷具有很强的抗氧化作用，可以清除体内的自由基；降低氧化酶的活性；可以降低高血脂大鼠的甘油脂水平，改善高甘油脂脂蛋白的分解代谢；抑制胆固醇吸收，降低低密度脂蛋白胆固醇含量；抗变异、抗肿瘤、抗过敏、保护胃粘膜等多种功能J。苹果花青素主要存在于果皮中，是果皮颜色形成的重要物质。苹果中的花青素由植物次生代谢重要途径一苯丙烷类代谢形成，同位素示踪揭示花青素的碳原子分别来自苯丙氨酸和乙。苹果中的花青素由矢车菊素的三种糖苷组成，分别是矢车菊素-3一半乳糖苷、矢车菊素-3-阿拉伯糖苷和矢车菊素一7·阿拉伯糖苷J。苹果中花青素的含量主要受温度、日照等因素影响，特别是紫外光可以明显提高花青素的合成效率，因此苹果的向阳面较背阳面红L4J。Jerneja等研究表明富士苹果成熟前期是其花青素形成的重要阶段，其中矢车菊素一3一半乳糖苷占总花青素92 ％～98％J。 器材与试剂： 实验仪器:分光光度计，电子天平，恒温箱，剪刀，烧杯，量筒，移液管 实验试剂：0.1mol/L HCL, 矢车菊素一3一半乳糖苷,甲醇，蒸馏水 实验材料：苹果 实验内容： 1、作标准曲线：采用l ％盐酸甲醇配置矢车菊素-3-半乳糖苷标准系列溶液，浓度分别为100、20．0、10．0、5．0、2．5、1．0 ~g／m L 。用分光光度计测出OD值（波长530nm），计算出标准曲线。 2、选2个苹果，把苹果皮削出，称取5g的果皮加入10m L l ％盐酸甲醇溶液匀浆，在40 ℃下提取1h，离心后取上清液在波长530nm测出OD值。 3、计算出苹果中花青素的含量。

葡萄籽原花青素液相检测方法

原花青素原花青素原花青素原花青素HPLC初步方案初步方案初步方案初步方案 一．实验目的：分析样品原花青素纯度，了解其中杂质成分。 二．实验方案： 1. 方案一：Waters 公司高效液相色谱，C18柱(4.6 ×250 mm) , 检测波长为280 nm，进样量10μL ,柱温为室温。待测液均经0.45μm 孔径的滤膜过滤。流动相及流速见下表(A —10 %乙酸,B —重蒸水)： 2. 方案二：（间接法定量）（原理类似铁盐催化比色法） (1) 标准曲线：称取前花青素标准品10mg 溶于10ml甲醇中,吸取该溶液0、0.1、0.25、0.5、 1.0、1.5ml 置于10ml 容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀。各取1ml 测定。 (2) 试样测定: 将正丁醇与盐酸按95 ：5的体积比混合后,取出6.0ml 置于具塞锥瓶中,再加入0.2ml硫酸铁铵[NH4Fe(SO4) 2·12H2O]溶液（用浓度为2mol/L 盐酸配成2%(w/v)的溶液）和1.0ml 经0.45μm滤膜过滤的试样溶液,混匀,置沸水浴回流,精确加热40min后,立即置冰水中冷却,待进行高效液相色谱分析。 (3)液相色谱参考分析条件: 色谱柱Shimadzu Shim –pak CLC –ODS 4.6 ×150mm;柱温35 ℃; 检测器:紫外检测器,检测波长525nm 流动相: 水:甲醇:异丙醇:10 %甲酸= 73 :13 :6 :8 流速0.9ml/min。注：该方法使用的水解方法与我们当前使用的铁盐催化水解原花青素方法稍有差异，哪种效果更好，可进行预实验加以比较。 3．方案三：（反相高效液相色谱）标样：原花青素标准品 色谱柱：Hypersi ODS-2 ，150 × 4.6mm 5μm； 流动相：A：0 . 2%(V/V) 乙酸；B：乙腈； 流量：1ml /min； 进样量：5μl; 柱温：30℃； 检测波长：280nm. 洗脱梯度：以乙腈的百分比浓度表示(B液溶于A液) 0 ～5 % ，10min； 5%～20%，10～20min； 20%～40%，20～40min； 40%～50%，40～50min； 50%～5%，45～50min； 5%～0，50～60min。 稳定液配制：取0.5g 抗坏血酸置于1L 容量瓶中，加约500mL 双蒸水，混合，溶解 抗坏血酸。加入100mL 乙腈，用双蒸水稀释至刻度。标准品溶液液的配制与稀释均使 用稳定液做溶剂。

花青素的分离提纯测定实验具体方案.

花青素的提取、测定 仪器材料试剂： 仪器：旋转蒸发仪，真空泵，分光光度计，真空干燥箱，水浴锅，天平材料：新鲜的紫葡萄和青葡萄 试剂：无水乙醇，盐酸，铁氰化钾，三氯乙酸，硫酸亚铁 实验步骤 一、花青素的提取： 1、挑选新鲜的紫葡萄薄洗净晾干，分离出果肉、果皮、籽粒 2、将分离晾干的紫色葡萄果皮，80℃下干燥1h。 3、称取2g磨成粉末 4、用含有1%盐酸的乙醇溶液浸提2次，合并提取液 5、讲合并提取液进行抽滤 6、60℃减压浓缩 7、真空干燥 8、得粗提取液 2、提取条件的优化： p 水平A提取 温度 /℃ B乙醇 浓度/% C提取时 间/min D料液比/ （g/ml） p 1 50 50 60 1:10 p 2 60 60 90 1:20 p 3 70 70 120 1:30

A B C D 结果 实验序 号 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 K1 K2 K3 Q 确定最佳提取方案然后对果皮、果肉、籽粒进行提取，测定最佳提取部位。

3、纯化 纸层析法提纯 1.取准备好的滤纸条（2×20cm），将其一端剪去两侧，中间留一长约1.5cm，宽约0.5cm的窄条，并在滤纸剪口上方折叠出一条直线，作为画滤液细线的基准线。 2．用毛细吸管沾少许滤液在折线上描绘4~5次，注意要画得匀、直、细，每次画完细线要等其自然变干后再画第二根线。 3．在大试管中加入常用的展开剂有V(丁醇∶V(乙酸∶V(水=4∶1∶5,V(正丁 醇∶V(2mol/LHCl=1∶1,V(乙酸∶V(浓HCl∶V(水=15∶3∶82,1%盐酸,V(浓 HCl∶V(水=3∶97等（即层析液）。然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄端浸入溶剂中（色素点要略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁），盖紧软木塞，直立于阴暗处进行层析。 4.展开后剪下色斑,以酸化甲(乙醇洗涤、浓缩,即可得到样品。 四、花青素的测定 1.采用普鲁士蓝法测定花青素的还原能力。 取一定浓度的样品溶液1 mL，加入磷酸盐缓冲液和1%K3Fe（CN）6各2.5 mL，混合均匀，混合液50 ℃保温20 min，快速冷却，加入10 %的三氯乙酸溶液2.5 mL，离心10 min。取上清液2.5 mL，加入等量蒸馏水和0.1%的FeCl3 1mL，摇匀，10min后700nm下测定吸光值A700，以抗坏血酸为对照。 2青素清除体外自由基能力测定。 利用Fenton 反应产生羟自由基[6]。取2 mL PBS（磷酸盐缓冲液pH=7.4），依次加入20mmol/L EDTA和12mmol/L FeSO4混合溶液0.1mL，一定浓度的花青素溶液1 mL、100mmol/L H2O2 0.1mL，用磷酸盐缓冲液定容至5 mL，迅速混匀，置于37 ℃水浴15 min。测定510nm 下光吸收值，计算清除率。清除率=（对照吸光度-样品吸光度）/对照吸光度×100%。

原花青素基本信息

原花青素 1外观 葡萄籽原花青素提取物外观一般为深玫瑰红至浅棕红色精制粉末，低聚物无色至 浅棕色，但因为葡萄籽种类、来源不同，所以在外观、色泽上都存在一定的差异。 2鞣性 原花青素能与蛋白质发生结合。一般情况下，结合是可逆的。原花青素一一蛋白 质结合反应是其最具特征性的反应之一。 3溶解性 低聚原花青素易溶于水、醇、酮、冰醋酸、乙酸乙酷等极性溶剂，不溶于石油醚、 氯仿、苯等弱极性溶剂中。高聚原花青素不溶于热水但溶于醇或亚硫酸盐水溶液， 这一点相当于水不溶性单宁，习惯上称为“红粉”。聚合度更大的聚合原花青素不 溶于中性溶剂，但溶于碱性溶液，习惯上又称为“酚酸”。 4紫外吸收特性 葡萄籽提取物原花青素水溶液的紫外最大吸收波长为278nm。因其分子中所含的 苯环结构，在紫外光区有很强的吸收。可起到“紫外光过滤器”的作用，在化妆品 中可开发研制防晒剂。 图1为原花青素分子结构

现在发现多种植物中含有原花青素，被提取的植物包括葡萄、英国山楂、花生、银杏、日本罗汉柏、北美崖柏、蓝莓和黑豆等。葡萄籽是葡萄酿酒的主要副产品，且它在葡萄皮渣中占65%，其多酚类物质含量可达5%～8%，在这些多酚物质中，原花青素含量最高，可达80%～85%。花青素广泛存在于各种植物的核、皮或种籽等部 位。 图2为原花青素常见来源植物蓝莓。

1.1提取 目前，普遍采用的工艺是先脱脂的方法包括压榨法、溶剂法、超临界CO2萃取 法，其中，超临界CO2萃取法最佳，不仅油脂提取率高，而且对原花青素的破 坏作用最小，质量较好。 1.2分离 纯化原花青素单体物质通常采用柱色谱进行分离，其中，聚酰胺、SephadexLH-20 和ToyopealHW-40是最有效的填料。对于较难分离或需要量较小的化合物，可 用半制备反相高效液相色谱法(RP-HPLC)和正相高效液相色谱法(NP-HPLC)制 备。随聚合度的增加，原花青素的同分异构体数目呈几何级数递增，分离纯化这 类大分子的单体物质非常困难。对于多聚体，可将其按分子量(聚合度)大小分段。 目前，已建立起来的分级方法有溶剂沉淀法和多种色谱法，如薄层色谱法、正相 高效液相色谱、凝胶排阻色谱、逆流色谱法等。 2.生物合成法 由硼氢化钠作为还原剂还原(2R，3R)-二氢-3′，4′，3，5，7-五羟黄烷的主要产物 是白矢车菊素(Leucocyanidin)的2，3-反-3，4-反异构体，而酶的还原产物是2， 3-反-3，4-顺异构体。在微酸的条件下，3，4-反异构体可能部分地转化为3，4- 顺异构体。3，4-顺异构体相对于3，4-反异构体较偏酸性，并且易于同硫醇和二 醇还原酶反应。酶合成要求的条件比较苛刻，同时也存在一个顺反异构体的问题， 目前，此法还不太成熟。 药理活性 1.抗氧化活性 原花青素具有极强的抗氧化活性，是迄今为止人类所发现的最强、最有效的自由 基清除剂之一，尤其是其体活性，原花青素的抗氧化活性呈现剂量-效应关系，但 如果超出一定的浓度，其抗氧化活性将随着浓度的升高而降低。 抗氧化特点及机理：①有效地清除超氧阴离子自由基和羟基自由基等，也可中断 自由基链式反应；②参与磷脂、花生四烯酸的新代和蛋白质磷酸化，保护脂质不 发生过氧化损伤；③为强有力的金属螯合剂，可螯合金属离子，在体形成惰性化 合物；④保护和稳定维生素C，有助于维生素C的吸收。 2.抗肿瘤活性 原花青素对于多种肿瘤细胞都具有显著的杀伤作用，对于多种致癌剂在启动及促 癌阶段都具有显著的抑制作用。原花青素能抑制癌细胞生长及诱导细胞凋亡。此 外，对于肝癌、前列腺癌、皮肤癌等，均表现出较好的抗癌活性，随着研究的深 入，原花青素将会在癌症的预防和治疗中发挥更大的作用，为癌症的治疗带来福 音。 3.抗炎、抗过敏、抗水肿活性 原花青素可降低由炎性介质组胺、缓激肽等引起的毛细血管通透性增高，减少毛 细血管壁的脆性，使毛细血管的力和通透性减小，保护毛细血管的物质转运能力， 从而起到抗炎的活性。此外，原花青素还可抑制组胺脱羧酶的活性，限制透明质 酸酶的作用，对各种关节炎及胃、十二指肠溃疡效果显著。 4.其它 原花青素还具有免疫调节活性、抗辐射作用、抗突变、抗腹泻、抗菌抗病毒、抗 龋齿、改善视觉功能、预防老年性痴呆、治疗运动损伤等功效。 保护心血管作用 1.抗心肌缺血再灌注损伤

原花青素的含量正丁醇测定方法

原花青素含量 1.材料和仪器 主要试剂：提取液，原花青素标样，盐酸正丁醇溶液、NH4Fe(SO4)2、95% 乙醇。 主要仪器：UV2100 型紫外分光光度计、恒温水浴锅。 溶液配制： 2％NH4Fe(SO4)2 称取3.66g七水合硫酸亚铁固体，溶于100ml水中后即得 95%乙醇移取5ml的蒸馏水至100ml容量瓶中用无水乙醇定容 盐酸正丁醇移5ml浓HCL 至100ml容量瓶正丁醇定容 2.实验步骤 a.标准曲线的制备:准确称取原花青素标准样品0.010g，用95% 乙醇溶 解并定容于10mL 容量瓶中，所得浓度为1mg/mL 作标样。吸取标样溶液0mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3mL分别于25mL 具塞试管中，加95%乙醇定容为3mL, 然后分别加入0.2mL 2％NH4Fe(SO4)2 溶液和6mL盐酸正丁醇（5:95）溶液，盖塞，摇匀，于微沸的水浴中加热反应40min 取出，于冷水中迅速冷却，溶液显红色，以0mL 溶液作为空白对照，于546nm 处测定其吸光度。采用最小二乘法作原花青素浓度(C)与吸光度( A ) 线性回归方程。 结果见表 取得标样体 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 积（/ml） 对应标样浓 度（mg/ml) 测的吸光度 值A b.样品测定 分别精确吸取10mL 样品，用95%乙醇定容于50mL 容量瓶。吸取上述样品待测液3mL 于25mL 具塞试管中，按标准曲线制作项下的操作步骤，依次分别加入0.2mL 2％NH4Fe(SO4)2 溶液、6mL 盐酸正丁醇溶液。根据标准曲线计算出结果，按其稀释倍数求得各样品中原花青素含量。

保健食品检验与评价技术规范》2003版中“保健食品中原花青素的测定

花青素的测定 保健食品检验与评价技术规范》 2003 版中“保健食品中原花青素的测定 原花青素含量测定方法 1、 原理 原花青素是含有儿茶素和表儿茶素单元的聚合物。原花青素本身无色，但经过 用 热酸处理后，可以生成深红色的花青素离子。本方法用分光光度法测定原花青素 在水解过程中生成的花青素离子。计算试样中原花青素含量。 硫酸铁铵 NH4Fe(S04)2?12HO 溶液：用浓度2mmol/l 盐酸配成2%(w/v)的 溶液。 4.1.1 片剂 取 20 片试样，研磨成粉状。 4.1.2 胶囊 挤出 20 粒胶囊内容物，研磨或搅拌均匀，如内容物含油，应将内 容物尽可能挤出。 4.1.3 口服液 摇匀后取样。 4.2 提取 保健食品检验与评价技术规范》 2003 版中 保健食品中原 2.1 甲醇 分析纯 2.2 正丁醇 分析纯 2.3 盐酸 分析纯 2 、 试剂 2.4 2.5 原花青素标准品 葡萄籽提取物，纯度 95% 3、 仪器 3.1 分光光度计 3.2 回流装置 4、 分析步骤 4.1 试样的制备

421粉状试样称取50-100mg试样置于50ml容量瓶中，加入30ml甲醇，超声处理20min,放冷至室温后，加甲醇至刻度，摇匀，离心或放置至澄清后取上清液备用。 4.2.2含油试样称取50mg试样置于小烧杯中，用20ml甲醇分数次搅拌，将 原花青素洗入50ml 容量瓶中，直至甲醇提取液无色，加甲醇至刻度，摇匀。 5.2.3 口服液吸取适量试样(取样量不超过1ml)置于50ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。 4.3 测定 4.3.1标准曲线称取原花青素标准品10.0mg溶于10ml甲醇中，吸取该溶液 0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5ml置于10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。各 取1ml 测定。与试样测定方法相同。 4.3.2 试样测定将正丁醇与盐酸按95:5 的体积比混合后，取出6ml 置于具塞 锥瓶中，再加入0.2ml硫酸铁铵溶液和1ml试样溶液，混匀，置沸水浴回流, 精确加热40min后，立即置冰水中冷却，在加热完毕15min后，于546nm波长处测 吸光度，由标准曲线计算试样中原花青素的含量。显色在 1 小时内稳定。5、分析结果表述 试样中原花青素测定结果按(1) 式计算 5.1 计算: m1x v x 1000 m x 1000x 1000 式中:X —试样中原花青素的百分含量，g/100g; m1—反应混合物中原花青素的量，ug; v—待测样液的总体积，ml; m—试样的质量，mg 5.2 结果表示

测定原花青素含量(硫酸香草醛法)1

香草醛法测定原花青素的含量 说明：原花青素的抗氧化性受到聚合物的影响，以乙酸为溶剂，香草只与原花青素中的末端的黄烷-3-醇发生缩合生成红色产物，由红色产物吸光度测定原花青素含量。通过正交实验和单因素实验考查了硫酸香草醛法测定原花青素含量的合适条件，比色条件为硫酸浓度30%，香草醛浓度1%，反应T为30℃，反应时间为30分钟。以儿茶素为标准品绘制标准曲线测定原花青素含量。 一、器材/试剂 紫外分光光度计恒温水浴锅电子天平 儿茶素标准品（浓度＞＝98%）；香草醛 ( 分析纯) ；硫酸 ( 分析纯) ；冰乙酸 ( 分析纯) ；实验用水为二级反渗透去离子水。 二、实验步骤 1.配制试剂 ( 1 )配制儿茶素标准品溶液：称取一定量的儿茶素标准品，分别用去离子水定容至一定体积，配制成物质的量浓度为0.025~0.25 mm o l · mL 的儿茶素标准品溶液； ( 2 )配制香草醛乙酸溶液：称取一定量的香草醛，分别用乙酸定容至一定体积，配制成浓度为1 ％； ( 3 )配制硫酸乙酸溶液：量取一定体积的浓硫酸，分别用乙酸定容至一定体积，配制成浓度为3 0 ％的硫酸乙酸溶液。 （4）样品溶液：原花青素溶液

以火棘果为原料，按液固比 6：1加入 4 0 ％乙醇溶液，4 5 ℃下浸提 1.5 h，问歇搅拌，连提3次，过滤，滤液旋蒸，回收溶剂。浓缩液经过预处理好的AB一8树脂吸附，用去离子水洗涤、6 0％乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，6 0％乙醇洗脱液即为样品溶液。 2、扫描最大吸收波长 取0．5mL儿茶素标准品溶液，加入2．5mL30％的硫酸乙酸溶液，2.5mL 1％的香草醛乙酸溶液，混合均匀，30℃水浴中避光反应15min。以无水乙酸做参比，在可见光区(400～800nm)进行光谱扫描。确定最大吸收波长，以后在此波长下测定样品的含量。 3、绘制标准曲线（在最大波长吸收处测得吸光度） 浓度0.025 0.035 0.045 0.055 0.065 0.075 0.085 0.095 A（儿茶 素） 0.105 0.115 0.125 0.135 0.145 0.155 0.165 0.175 A（儿茶 素） 0.185 0.195 0.205 0.215 0.225 0.235 0.245 A（儿茶 素） 测原花青素样品的吸光度，通过以上标准曲线所得的标准曲线回归线方程计算得样品浓度。 注：实验须重复4次，

原花青素含量检测的概述

原花青素含量检测的概述 【摘要】对目前原花青素常用的检测方法进行了对比并阐述了各种方法的优缺点，为探索更好的原花青素的测定方法奠定基础。 【关键词】原花青素；检测；含量 原花青素是一类广泛存在于植物中的黄烷醇单体及其聚合体的多酚类混合物，具有抗氧化和自由基清除能力等生物活性。自20世纪60年代以来，在保健品、医药和化妆品领域获得了广泛应用。研究表明[1]，儿茶素和表儿茶素是构成原花青素的结构基础，继而形成缩合成二聚体、三聚体至高聚体。且单体具有旋光性，因此要想测定每一种成分的含量非常困难。目前国内外对原花青素含量的测定方法尚未统一，现介绍几种常用的方法。 1.可见分光光度法[2] 原花青素最常用的测定方法是可见分光光度法，它分为KMnO4法[3]、正丁醇-盐酸法、香草醛-强酸法、铁盐催化比色法、和pH示差法等。正丁醇-盐酸法、香草醛-强酸法两种方法是目前普遍采用的相对专一、灵敏的、简单迅速测定原花青素的方法。 1.1 Porter法（Bate-smith法） 又叫盐酸-正丁醇法，是依据原花青素在无机酸和加热的条件下被降解，产生红色花青素，在546nm处有最大吸收，原花青素的含量与吸光度值符合朗伯-比尔定律[4]。 在强酸作用下，聚合原花青素单元间的连接键易被打开，上部单元生成黄烷-3-醇，下部单元生成花色素。而对于黄烷3，4-二醇单体原花青素来说，C-4位有极强的亲电性，其醇羟基与C-5，C-7上的酚羟基形成了一个苄醇系统，使得4位碳易于生成正离子。在强酸作用下，正碳离子失去质子，生成花色素[5]。对于黄烷-3-醇单体，不会有正离子形成，因此与儿茶素和表儿茶素的单体不发生显色反应。此法对原花青素具有专一选择性，儿茶素、黄酮类、棓酸类及水解单宁类化合物皆不具备此反应，不适宜于低聚原花青素的测定，它与原花青素的高聚体反应也不完全。 随后，Porter等对该法的反应条件进行了探索，并认为Fe3+、Co2+、Cu2+等金属离子可催化加速自氧化过程，提高转化率，其中以Fe3+的催化效果最好。 1.2香草醛-强酸法 常用的酸有盐酸和硫酸，目前的观点认为浓H2SO4更合适，可以提高吸光度值和灵敏性，褪色也较慢[6]。

保健食品检验与评价技术规范》2003版中“保健食品中原花青素的测定

保健食品检验与评价技术规范》2003 版中“保健食品中原 花青素的测定 《保健食品检验与评价技术规范》2003 版中“保健食品中原花青素的测定原花青素含量测定方法 1、原理原花青素是含有儿茶素和表儿茶素单元的聚合物。原花青素本身无色，但经过用热酸处理后，可以生成深红色的花青素离子。本方法用分光光度法测定原花青素在水解过程中生成的花青素离子。计算试样中原花青素含量。 2 、试剂 2.1 甲醇分析纯 2.2 正丁醇分析纯 2.3 盐酸分析纯 2.4硫酸铁铵NH4Fe(SO4)2?12H2溶液：用浓度2mmol/l盐酸配成2%(w/v)的 溶液。 2.5 原花青素标准品葡萄籽提取物，纯度95% 3、仪器 3.1 分光光度计 3.2 回流装置 4、分析步骤 4.1 试样的制备 4.1.1 片剂取20 片试样，研磨成粉状。 4.1.2 胶囊挤出20粒胶囊内容物，研磨或搅拌均匀，如内容物含油，应将内容物尽可能挤出。

4.1.3 口服液摇匀后取样 4.2 提取 4.2.1 粉状试样称取50-100mg 试样置于50ml 容量瓶中，加入30ml 甲醇，超 声处理20min,放冷至室温后，加甲醇至刻度，摇匀，离心或放置至澄清后取上清液备用。 422含油试样称取50mg试样置于小烧杯中，用20ml甲醇分数次搅拌，将原花青 素洗入50ml 容量瓶中，直至甲醇提取液无色，加甲醇至刻度，摇匀。 5.2.3 口服液吸取适量试样(取样量不超过1ml)置于50ml容量瓶中，加甲醇至刻 度，摇匀。 4.3 测定 4.3.1标准曲线称取原花青素标准品10.0mg溶于10ml甲醇中，吸取该溶液 0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5ml置于10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。各取1ml 测定。与试样测定方法相同。 4.3.2 试样测定将正丁醇与盐酸按95:5 的体积比混合后，取出6ml 置于具塞 锥瓶中，再加入0.2ml硫酸铁铵溶液和1ml试样溶液，混匀，置沸水浴回流，精确加热40min后，立即置冰水中冷却，在加热完毕15min后，于546nm波长处测吸光度，由标准曲线计算试样中原花青素的含量。显色在 1 小时内稳定。5、分析结果表述 试样中原花青素测定结果按(1) 式计算 5.1 计算: m1x v x 1000 X(%), x 100,,,,,,,,,,,,(1) m x 1000x 1000

原花青素值的测定

3．1 原花青素值的测定 原花青素值的测定采用Bates—smith法和Poaer 法。原理：原花青素在酸性条件下加热转化为红色的花青素，而儿茶素、表儿茶素等黄烷一3一醇单体没有此反应(图2)。它们测出的结果是原花青素的相对含量，分别用原花青素指数和PVU表示，是根据经验公式求得的。葡萄籽提取物中的原花青素指数一般在80～100之间，PVU一般在250～350之间。 原花青素值只是相对含量，并非原花青素的真实含量。据调查，同为原花青素值95的产品，多酚含量相差15％，质量大相径庭四。很多生产厂家使用原花青素指数来表示葡萄籽提取物中原花青素的百分含量是错误的。 3．2 原花青素含量的测定 原花青素的含量测定方法很多，也比较混乱。常用的有以下几种方法。 3．2．1 铁盐催化法 此方法的反应原理与原花青素值测定原理相同，在计算原花青素的含量时使用了原花青素标准品。Fe¨、盐酸为常用的催化剂和酸解剂。由于水、乙醇为反应介质时吸光值很低，一般采用正丁醇为反应介质【15-161。通常的具体操作：取1．0 mL 样液(或原花青素溶液)于10 mL刻度试管中，加入6．0 mL正丁醇一浓盐酸(95：5)与2％硫酸铁铵溶液(溶解于2 mol／L 盐酸)0．2mL，混匀，置于沸水浴中加热40min后，立即取出用冰水快速冷却至室温，在550 Nm处测定吸光值。 此方法较简便，而且对原花青素的选择性反应较好。铁盐催化法对反应体系中的含水量和Fe 浓度要求比较严格，一般要求含水量6％，Fe 浓度4．5x10 ％，而且过高的Fe¨浓度对反应没有影响【l51。傅武胜【l61 研究表明3％～4％为合适的含水量，Fe 浓度选择在9．OxlO ％左右。但是也有学者总结分析2％～6％含水量对花青素的形成有抑制作用，稍高的Fe¨浓度(>15 g／L)也抑制花青素的生成. 在铁盐催化反应的基础上，杨大进【l I等人利用高效液相色谱法检测了原花青素含量。该方法将原花青素在上述铁盐催化条件下生成的深红色花青素离子进行高效液相色谱分析，从而确定原花青素的含量。此方法能够排除部分杂质的影响，具有定性定量准确的优点。 3．2．2 香草醛法 测定原理：原花青素和儿茶素类单体的A环的化学活性较高，在酸性条件下，其上的问苯二酚或间苯三酚与香草醛发生缩和，产物在浓酸作用下形成红色的正碳离子，样品的浓度与产生的颜色呈正相关，在500 llm波长下测定其吸收光值

葡萄籽提取物中原花青素含量的最佳测定方法

葡萄籽提取物中原花青素含量的最佳测定方法 葡萄籽提取物-原花青素被誉为“最强效的自由基清除剂”，其抗氧化能力是VC的20倍，VE的50倍。也是唯一能透过血脑屏障的抗氧化剂，因此在促进皮肤新陈代谢，分解黑色素，以及提高机体免疫力，延缓衰老方面的应用极为广泛。 葡萄籽提取物由原花青素、儿茶素、表儿茶素、没食子酸等多酚类物质组成的，由于原花青素的成分极其复杂，目前的研究实验中还无法提供原花青素的标准品，因此Bate-Smith 和Porter法只能测定葡萄籽提取物中原花青素的相对含量。 一、Bate-Smith法、Porter法测定葡萄籽原花青素含量 西安源森生物实验室对Bate-Smith法和Porter法测定原花青素相对含量实验进行了研究：（一）Bate-Smith法测定葡萄籽原花青素含量 【实验目的】由于目前没有原花青素的标准品，因此此方法测定的只是葡萄籽提取物中原花青素的相对值，其含量用原花青素指数(procyanidolic index)来表示。 【Bate-Smith法原理】原花青素在酸性条件下加热转化为红色的花青素(图1)。 【实验步骤】称取适量的葡萄籽提取物(约15～40mg)用甲醇溶解，最后定溶于100ml。从中取1ml样品溶液加到10ml比色管中，然后再加入6ml盐酸-正丁醇溶液(5/95,V/V)，在97℃±1下反应40min后，取出迅速冷却，在550nm处测定其吸光度，以甲醇代替提取物溶液作为空白。 原花青素指数=A×7.0/W W:样品质量(g)； A:吸光度 【实验结果】由于用Bate-Smith法测得的葡萄籽提取物中原花青素指数一般在80～100之间，有时也可能大于100。因此，目前很多植物提取物生产厂家使用原花青素指数来表示葡萄籽提取物中原花青素的百分含量，是不正确的。 （二）Porter法测定葡萄籽原花青素含量 【实验概述】由于Bate-Smith法测定的结果重现性很差,并且原花青素在此条件下反应不是很彻底。因此Porter等人对Bate-Smith法进行了改进。Porter法改进之处主要是在试剂中添加了Fe3+，以提高反应的程度和颜色的稳定性。此方法测定的也是原花青素的相对含量，结果用PVU(porter value unit)表示。 【实验步骤】称取适量的葡萄籽提取物(约10～30mg)用甲醇溶解，最后定溶于100ml。从中取1ml样品溶液加到10ml比色管中，然后依次加入6ml盐酸-正丁醇(5/95,V/V)，0.2ml 2.0%硫酸铁铵溶液(用2mol.L-1的盐酸溶解),在97℃±1下反应40min后,取出迅速冷却,在550nm 处测定其吸光度,以甲醇代替提取物溶液作为空白。

花青素测定

花青素的测定 目的花青素是类黄酮类色素中最重要的一种，广泛存在于植物花、果实、茎叶中，对这些器官的观赏价值和商品形状有重要价值。本实验学习花青素的提取及测定方法。 一、实验原理 花青素在酸性溶液中呈红色，其颜色的深浅与花青素的浓度成正比。花青素酸性溶液的吸收高峰波长是530nm，摩尔消光系数为4.62×104，故可用分光光度法测定其含量。但是一些提取液中常有叶绿素存在，干扰测定。因此，需同时测定提取液在620nm（可溶性糖）和650nm（叶绿素的吸收值）波长下的光密度值，并用Greey公式准确计算出花青素的光密度值，才能计算花青素的含量。 二、材料、设备及试剂 1.材料茶叶 2.2. 设备分光光度计、电子天平、水果刀、50ml具塞三角瓶、25ml容量瓶。 3. 试剂0.1 mol·L-1的盐酸乙醇溶液（8.3ml浓盐酸用95%乙醇稀释成1L）。 三、操作方法 1. 花青素的提取取0.100g一串红和0.116g红花继木分别放在编号为1、2的三角瓶中，加10ml盐酸乙醇溶液，在60℃水浴中加10ml提取液浸提30min，把溶液倒入25ml容量瓶中，再加5ml提取液浸提15min, 把溶液倒入25ml容量瓶中，再加5ml提取液浸提15min, 把溶液倒入25ml容量瓶中，共浸提1h，最后定溶到25ml。 2. 测定以0.1mol·L-1的盐酸乙醇溶液做参比液，在分光光度计测定提取液在530nm、620nm、650nm波长下的光密度值。 四、实验结果 实验结果如下表 依据公式 1．计算花青素的光密度值 ODλ=(OD530-OD620)-0.1(OD650-OD620) 2.计算花青素含量 =ODλ ε × V ×1000000 m 花青素含量（nmol/g） ODλ:花青素在530nm波长下的光密度 ε：花青素摩尔消光系数4.62×106 v:提取液总体积（ml） m:取样质量（g） 1000000: 计算结果换算成nmol的倍数 由一串红测得结果则有：ODλ=(1.360-0.024)-0.1(0.043-0.024)=1.3341 所以，花青素含量（nmol/g）=1.3341/4.62/104×25/0.100×106=7219.156 由红花继木测得结果则有：ODλ=(0.370-0.062)-0.1(0.183-0.062)=0.2959 所以，花青素含量（nmol/g）=0.2959/4.62/104×25/0.116×106=1380.337 五、结果分析与讨论

原花青素提取方法的研究进展

原花青素提取方法的研究进展【摘要】原花青素是一种具有重要生理活性的多酚类化合物。本文综述了天然原花青素的提取方法，其中包括有机溶剂提取、微波提取、超声波提取、超临界CO2萃取以及酶法等，以期为开发利用原花青素提供依据。 【关键词】原花青素；提取方法；研究进展 原花青素（简称PC）是植物界中广泛存在的一大类多酚类化合物。植物化学家通常将从植物中分离得到的一切无色的、在无机酸存在和加热处理下能产生红色的花青素（Cyanidin）的一类多酚化合物统称为原花青素。许多研究表明，原花青素是清除自由基很强的抗氧化剂，其抗氧化、清除自由基的能力是VE的50倍、VC的20倍，它能防治80多种因自由基引起的疾病，包括心脏病、关节炎等，还具有改善人体微循环功能。目前，原花青素已广泛应用于食品、药品、化妆品等领域。全世界对原花青素的研究越来越深入，其中对原花青素提取方法的研究是一大重点。原花青素传统的提取方法是有机溶剂提取法，但这种方法存在着对有效成分损失大、周期长、工序多、提取率不高等缺点，因此近10年来，在植物有效成分的提取方面出现了许多新技术、新方法，如超临界CO2萃取技术、超声波提取技术、微波萃取技术以及酶解技术等。现将原花青素提取方法综述如下。 1原花青素的分类及分布原花青素是一大类多酚化合物的总称，起初统称归于缩合鞣质或黄烷醇类。最简单的原花青素是儿茶素、表儿茶素或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体。此外，还有三聚体、四聚体等直至十聚体。按聚合度的大小，通常将二～四聚体称为低聚体（ProcyanidolicOligomers，简称OPC），将五聚体以上的称为高聚体（ProcyanidolicPolymers，简称PPC）。OPC为水溶性物质（PPC水溶性较差）、极易吸收；OPC消除自由基的能力与分子结构、聚合度有关。二聚体中，因两个单体的构象或键合位置的不同，可有多种异构体，易分离鉴定的8种结构形式分别命名为B1～B8，其中，B1～B4是由C4～C8键合，B5～B8是由C4～C6键合。在各类原花青素中，二聚体分布最广，研究得最多，也是最重要的一类原花青素。三聚体中，也因组成的单体及其相连接碳原子位置的不同形成各种各样的结构并命名为C1、C2等，其中C1在自然界中分布最丰富。研究表明，原花青素主要分布于以下的植物中：葡萄、英国山楂、单子山楂、花生、银杏、日本的罗汉柏、北美的崖柏、土耳其的侧柏、花旗松、白烨树、野生刺葵、番荔枝、野草萄、日本莽草、扁桃、高粱、耳叶番泻、两谷椰子、可可豆、贯叶金丝桃、头状胡枝子、粘胶乳香树、海岸松、洋萎陵菜和大黄等。2提取方法2．1水提取法由于有机溶剂会带来环境污染和产品的有毒有机物残留，人们在大力发展对环境友好的绿色提取技术———水提取法。Masquelier最早从松树皮中用沸水粗提、乙酸乙酯纯化得到原花青素。1998年Duncan和Gilmour发明一种从植物材料（树皮、树叶、葡萄籽、皮、大豆、绿茶）中提取原花青素的方法。将材料粉碎（≤15mm），常压、60～100℃或高压100～125℃条件下采用脱氧热水提取（1min～20h），过滤采用超滤或反渗透或两者连用，浓缩滤液，真空喷雾或冷冻干燥，此法主要是提取分子量≤5000D的水溶性原花青素，得率为0．5％～10．0％之间，通常为6．5％～9．6％（随取样部位的差异而定），分离得到原花青素B1、B3、B6和C2。获得的产物对AAPH引发的亚油酸的氧化有明显抑制作用，1μg／mL能达到70％～79％的抑制率。毒理学检测表明：对于按人体重剂量给药组和100倍人体质量的剂量给药组24h内无毒害和副作用产生，慢性毒理学（5个月）试验也无明显毒、副作用。1999年Karim等人发明了在加压条件下，采用脱氧去离子水提取植物材料中的原花青素。将提取液超滤后，采用疏水性微孔聚合物树脂作填料的柱色谱方法，选用极性洗脱液（乙醇＋水）洗脱，将洗脱液采用反渗透方法除去乙醇，干燥得到原花青素。 选水作为提取剂，浸提耗时长，温度高，容易造成原花青素的损失；同时水的极性较大，

PH示差法测量花青素含量

PH示差法测定火棘果花青素含量 原理：花青素是具有2-苯基苯并吡喃阳离子结构的衍生物，广泛存在于植物中的水溶性天然色素。花青素在自然状态下常与各种单糖形成糖苷，称为花色苷。溶液PH不同，花色苷的存在形式也不同。对于一个给定的PH值，在花色苷的4种结构之间存在着平衡：蓝色的醌式（脱水）碱，红色的花烊正离子，无色的甲醇假碱和查尔酮。花色苷在PH值很低时，其溶液呈现最强的红色。随着PH值的增大，花色苷的颜色将褪至无色，最后在高PH值时变成紫色或蓝色。PH示差法测定花色苷含量的依据是花色苷发色团的结构转换是PH的函数，起干扰作用的褐色降解物的特性不随PH变化。因此在花青素最大吸收波长下确定两个对花青苷吸光度差别最大但是对花色苷稳定的PH值。 原料与仪器 原料：火棘果花青素提取液，乙醇95%（AR），盐酸 仪器：PHs-3B型酸度计，紫外分光光度计 实验步骤： 1，火棘果的定性分析 取提取液稀释至一定的体积，用稀氢氧化钠和稀盐酸调节PH，观察提取液在不同PH下的颜色变化。对提取液进行200~800nm全波长扫描，绘制光谱图 PH 1.0 2.0 原液 4.5 9.5 溶液颜色

2，测定波长的选择 取火棘果花青素提取液用5%HCL-EtOH（15:85）溶液稀释至一定体积，进行光谱扫描，确定最大吸收波长。 紫外可见吸收光谱 3，PH示差法中PH的选择 在选定PH时应考虑以下因素：在此两个PH处测定的花青素的吸收值差异应是最显著的；单一PH的轻微变动，对花青素吸光值的影响是极小的；花青素在所处的两个PH下，应是相当稳定的。由于花青素只有在酸性介质中是稳定的，因此只测定PH小于7条件下花青素吸光值的变化。PH为1.0时，花青素以红色的2-苯基苯并吡喃的形式存在PH为4.5时，花青素以无色的甲醇假碱的形式存在。因此选择PH为1.0和4.5。 4，平衡时间的确定 因为花青素在溶液介质中存在4种结构形式，这4种结构形式在某一PH下处于动态平衡，当PH改变时，动态平衡发生转移，总的趋势是PH降低时，平衡向红色的2-苯基苯并吡喃阳离子移动；PH 升高时平衡向蓝色醌式移动。一定时间后达到一个新的平衡。因此提取液用缓冲液稀释后，必须静置一段时间，等动态平衡处于稳定后，才能测定吸光值。

原花色素的测定方法

方法1:原花色素的测定方法（分光光度法） 本方法适用于各种植物组织、器官及其制剂（如葡萄子与松树皮提取物）中原花色素含量的测定。 1. 方法提要 原花色素（也称缩合单宁）是黄烷-3-醇的寡聚体与多聚体，属多酚类化合物。与其他酚类化合物不同，黄烷醇（缩合单宁，单体，双体等）在酸性介质中可与香草醛反应，生成在500nm处有最大吸收的有色物质，可通过比色测其含量。 2. 仪器 分光光度计。 3. 试剂 所用水为去离子水或同等纯度蒸馏水。 （1）香草醛、甲醇、浓盐酸均为分析纯级。 （2）提纯的原花色素或儿茶素。 （3）4%香草醛甲醇液。 （4）标准使用液：将提纯的原花色素溶于蒸馏水，制成1mg/mL储备液，将储备液稀至浓度为1×10-2mg/mL至1mg/mL的标准使用液。标准使用液应于测定当天配制。 如无提纯的原花色素，可用儿茶素代替，配制方法同上。 4. 测定步骤 （1）样品中原花色素的制备：植物材料经4倍体积丙酮+水（7+3，体积比）或者经60%甲醇提取，40℃以下减压蒸馏去除有机溶剂，水相再经乙醚洗涤后定容。冰冻干燥的固体原花色素制剂，直接溶于水中（先加少量甲醇助溶）制成原花色素液。 原花色素液于5℃下暗环境中保存备用。 （2）样品测定：用锡箔将试管（14mm×20mm）包裹严，仅留管口用于加样。向管内加入试样0.5mL，再加3.0mL 4%香草醛甲醇液混合，然后加入1.5mL浓盐酸，彻底混匀，室温下显色15min。也可在暗环境下进行以上操作。最后在500nm 处比色。 可按以上操作步骤制得标准曲线（即0.1mg原花色素在500nm处的吸收值为0.55）。 5. 结果计算 计算原花色素量的公式， 原花色素（1×10-3mg）=A500nm÷0.55×100×V 式中V——试样稀释体积（倍数）。 6. 注释 （1）本方法的检测范围为（5~500）×10-3mg/0.5mL样液。精密度与准确度大于1×10-3mg。 （2）反应试管应用清洁剂浸泡24h，彻底洗涤干净。 （3）进行比色时，用水作空白。 （4）500nm处的OD值应控制在3以下。 （5）试样中原花色素含量较高时，应从香草醛存在下所测A500nm值中减去无香草醛时所测值。 （6）显色液应避光放置。

红米花青素检测报告-2

“红米提取物”花青素类化合物测试报告2012年8月2号接到云南瑞宝生物科技有限公司邮寄来的红米提取物S-HMT120731、紫甘薯提取物S-ZGT120730A、甘蓝提取物S-GT120730A、萝卜提取物S-LT120730A，其中除红米样品外的其他样品的测试工作仍未完成。 红米样品中已完成花青素的检测任务，具体工作内容及结果如下： 定性：采用制备色谱对样品中花青素进行分离纯化，收集纯化后的样品进行紫外光谱扫描（UV）、飞行时间多级质谱（MS n）检测，并将结果进行了数据解析，推测化合物结构。 定量：采用HPLC技术，外标法定量“红米样品”中三种花青素。 1.研究方法 1.1 定性研究 1.1.1 仪器及试剂 WATERS 2695 高效液相色谱仪，配二极管矩阵检测器。 ESI-IT-TOF 质谱仪（Shimadzu公司，日本）。 岛津UV2550 紫外分光光度计。 甲醇，乙酸等。 1.1.2 样品溶液制备 称取红米样品400mg，用甲醇定容至10mL，配成质量浓度为40mg/mL的储备液，置于4℃冰箱中备用。 1.1.3实验条件 1.1.3.1制备色谱条件 制备色谱系统：色谱柱，C18，250mm×8 mm，粒径：20-40μm；流动相：V (甲醇) /V (水)/V (乙酸) = 40：60：0.5；检测波长：520 nm；进样体积：2.5 mL；进样量：100 mg；柱温：室温。 样品溶液分5次进样，每次2.5mL，收集保留时间为8.2，11.5和12.8min的三个流份。合并5次收集的流份，分别冷冻干燥，得三种花青素浓缩液，该浓缩液用于以下的质谱检测及紫外光谱扫描。 1.1.3.2 质谱条件 电喷雾电离：正离子模式喷雾电压4.5kV。加热模块（BH）温度200℃；曲形脱溶剂管（CDL）温度200℃。碰撞诱导解离（CID）参数: （1）碰撞能量：MS1～MS3，50%。（2）碰撞气比例：MS1～MS3, 50%。（3）碰撞时间：MS1～MS3，30ms。雾化气采用氮气（纯度≥99.5%），流速1.5L/min，检测器电压1.70kV。高纯（纯度≥99.99%）氩气作为CID碰撞气及冷却气。使用2.5mmol/L三氟醋酸钠溶液对正、负离子模式下m/z 100--1000范围的质量数进行校正。 使用自动采集模式，每一级质谱自动选择基峰离子作为下一级质谱的母离子进行碎裂。据分析由LCMS solution 3.41工作站完成。结合分子式预测软件（日本岛津公司）对多级质谱碎片作综合分析，得到化合物的分子式及碎片信息。 1.1.3.3 紫外扫描测试 将三种浓缩液分别配成约1mg/mL的水溶液在UV2550紫外/可见光度计上作1000-190nm全程扫描。花青素特征吸收峰为270-280nm与500-540 nm。 1.2 定量研究 1.2.1 仪器及试剂 WATERS 2695 高效液相色谱仪，配二极管矩阵检测器。 标准品飞燕草素葡萄糖苷，甲醇，乙腈，甲酸等。 1.2.2 溶液制备 样品溶液制备：称取红米样品60mg，用甲醇定容至10mL，配成质量浓度