基因
基因工程实验（完整版）
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1、基于构造的分离质粒DNA的制备方法：①碱变性法②溴乙锭-氯化铯密度梯度离心③质粒扩增。
2、E.coil质粒DNA提取时用的溶液Ⅲ的组成①5mol/L乙酸钾（60mL）②冰乙酸（11.5mL）③水（28.5mL）其中乙酸钾的作用是：恢复PH至中性，使DNA复性。
3、TE缓冲液的作用是：回溶DNA并长期保存。TE缓冲液成分：①10mmol/L
Trish·HCl：10μL②1mmol/LEDTA：2μL③DD水：988μL
4、胰RNA酶的作用：提纯质粒，除去离心后上清液的RNA
5、苯酚：氯仿：异戊醇=25:24:1。其中苯酚和氯仿的作用是：是蛋白质变性，除去离心后上清液中多余的蛋白质和胰RNA酶。异戊醇的作用是：使溶液分三层，防止液相交界面的杂质，易于后期分离。
6、10×Loading Buffer （加样缓冲液）的成分：①蔗糖②溴酚蓝。10×Loading Buffer的作用：①前沿指示剂②增加比重，浓缩DNA，使点样后的DNA能够沉于电极缓冲液液面下。
7、10×HBuffer（酶缓冲液）的成分有：①Trish·HCl：PH7.4②NaCl③Mg2+
④DTT（二硫苏糖醇）：其中二硫苏糖醇的作用是：还原剂，保持酶活性。
8、酶切反应的终止方式有：①70℃孵育10-15min②加入EDTA③加入苯酚
9、根据10×HBuffer（酶缓冲液）中NaCl的浓度可以将酶分为：
①低盐酶（0-50mmol/L）②中盐酶（50-100mmol/L）③高盐酶（100-150mmol/L）
10、酶的星号活性：在不是酶的最适条件下进行酶切，可能会导致酶的特异性降低，以至于一种酶可识别和切割更多的位点。以大肠杆菌EcoRⅠ为例：正常的识别是5’-GAATTC-3’星号活性下EcoRⅠ的识别位点是：5’-NAATTN-3’。
11、回文结构：是指从DNA双链来说，在各自的方向上的阅读结果都相同。限制性核酸内切酶识别4-8个核酸回文结构。
12、PCR反应变性、退火、延伸各段所持续的时间主要是由DNA的长度来决定的。引物的设计是PCR反应的关键步骤。
13、PCR反应引物是指位于待扩增的DNA两端互补的寡核苷酸序列。PCR反应模板是待扩增的DNA序列，可以是质粒DNA，基因组DNA，cDNA。
14、大肠杆菌质粒DNA提取时用的溶液Ⅲ加入时，要把液体充分混合并置于冰上孵育足够的时间，使沉淀完全，如果未充分将细菌裂解物与溶液Ⅱ混匀，将会影响质粒DNA的纯度。
15、DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳可以分离：不同分子质量的DNA，相对分子质量相同但构型不同的DNA分子。
16、琼脂糖凝胶范围100bp-60Kb。EB是橘红色光、Gelview是绿色光。
17、大肠杆菌感
受态细胞的制备始终要置于0℃下操作，从-80℃中取出来的大肠杆菌要置于冰盒中0℃降温，不要放置室温降温。
18、质粒DNA转化大肠杆菌的实验中有受体菌对照（阴性对照）和质粒对照（阳性对照）两个对照试验，其中受体菌对照实验是验证菌体本身是否为抗性突变株，加入2μL的无菌水。质粒对照实验是验证质粒本身是否能够在培养基上生长，加入200μLCaCl2。
19、纯水仪使用时注意防止爆炸，防止发水。天平分为托盘天平和电子天平。磁力搅拌器的使用要注意防腐蚀，注意保护电极。
20、PCR仪用于基因扩增，使用前要设置好程序，使用后注意关闭电源。紫外灯透视仪及凝胶成像系统是用于核酸条带的观察和照相。烘箱（300℃）用于烘干器皿。分子杂交炉用于southern northern 等分子杂交，使用时要注意正确设定杂交温度，时间等并且要防止同位素遗漏，污染。
21、超低温冰箱使用注意确保冰箱门关严，另外还要防止冻伤。恒温震荡培养箱是用于培养基中细菌的培养，使用时要调节好温度和转速。
22、高速冷冻离心机可以用于DNA和RNA等提取过程中的高速冷冻离心。制冰机使用时应注意①使用时先接通水源②使用后要关闭水源
23、蛋白质、核酸分析仪用于测定核酸及菌液的浓度等，使用时要注意①使用时先预热②使用前要调零③要调好光源
24、测序仪用于对核酸进行测序，使用时要注意①无菌操作，休息清洁②使用时检查是否漏气
25、转化体总数=菌落数×稀释倍数×
26、X-gal二甲基酰胺：使用时要避光保存。IPTG：安慰诱导物，使β-半乳糖苷酶和X-gal结合产生蓝色的菌落，水溶性，需要抽滤灭菌，高温分解，使用时要避光保存。
27、E.Coil DH5α，具有缺失前146个氨基酸的lacZ基因编码缺失α-多肽的β-半乳糖苷酶。
简答论述
1、碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的基本原理
碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来实现分离的。
（1）将大肠杆菌置于EDTA和溶菌酶中进行破壁处理用强离子去污剂SDS去除细胞膜释放出细胞内的物质。
（2）用碱调节PH到12.0-12.5这个狭窄的范围内线性的DNA双螺旋结构开始解开而变性，尽管在这种条件下公家闭合环状的质粒DNA的氢键也会断裂，但是两条链还是彼此相互盘绕仍然紧密地结合在一起。
（3）加入PH1.8的乙酸甲高盐缓冲溶液将PH恢复至中性后，共价闭合环状的质粒DNA两条互补链能够迅速而准确地复性，而变性的细菌线状染色体DNA两条互补链已经彼此完全分开，就不能迅速而准确地复性，会彼此交联形成杂乱的呈网状结构的复杂
的聚合物。
（4）这种复杂的聚合物相对分子量很大可以通过离心的方式使染色体DNA，不稳定的大分子DNA，蛋白质-SDS复合物等大分子一同沉淀下来，从而被除去。上清液中主要就是闭合环状的质粒，其中还会含有少量的小分子RNA，小分子蛋白质。
（5）上清液中含有的少量的小分子RNA，小分子蛋白质可以分别用胰RNase除去RNA，再用苯酚氯仿异戊醇除去蛋白质。提取的质粒DNA能够较长期保存于TE缓冲液中。
2、大肠杆菌质粒DNA提取时用的溶液Ⅰ的组成及作用
（1）50mmol/L葡萄糖（0.49g）：调节细胞渗透压，保护DNA
（2）25mmol/L三羟甲基氨基甲烷Tris·HCl（1.25mL）：
（3）10mmol/L乙二胺四乙酸二钠盐EDTA（2mL）螯合Mg2+、Ga2+保护DNA
3、大肠杆菌质粒DNA提取时用的溶液Ⅱ的组成及作用，为什么要现用现配
（1）0.4mol/LNaOH50mL（0.8g）：调节PH在12.0-12.5之间，碱变性DNA
（2）2%SDS50mL（1g）：强离子去污剂去除细胞膜，使膜破裂释放出细胞内物质
（3）NaOH为强碱SDS为强离子去污剂腐蚀性都比较大，不用灭菌就可以使用，另外长时间放置在一起会易变性，不稳定
4、假设一种限制酶在重组质粒上有两个酶切位点，如果酶切后的电泳显示有三条带，分析可能的原因，并分析采取何种措施解决
造成这种不完全酶切的原因主要有：
（1）酶的加入量较少：可采取适当增加酶的加入量来控制，但是要小于酶切体系的1/10过多的酶会导致酶产生星号活性。
（2）酶切的时间不够：可采取延长酶切时间来控制，直到符合条件的酶切时间，甚至可以过夜酶切或更长时间的酶切。
（3）如果延长酶切的时间后仍有三条带，就可能是酶的浓度低，应适当增加酶的加入量。
5、双酶切时，由于两种酶的缓冲液的成分不同（主要盐离子浓度不同）或反应温度不同应采取的措施
（1）双酶切时，可以采取先用一种酶切，等地一种酶切完成后，收集DNA再用第二种酶切。
（2）可以先进性低盐要求的酶切加热失火酶后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求，加入第二种酶进行酶切。
（3）两种酶要是存在通用缓冲体系，可以使用通用缓冲液进行双酶切，温度要先低温再高温酶切。可以先进性低温要求的酶切后提高温度到高温酶的反应要求，再加入第二种酶进行酶切。
6、在实验室条件下进行限制性酶切需要考虑的因素
（1）10×缓冲液（不同酶对应缓冲液不同）
①Tris·Hcl：维持反应体系PH在7.4左右。②NaCl：为反应提供适宜的离子浓度。③Mg2+：限制性内切酶发挥作用所必需的，是核酸酶的辅酶。④DTT（二硫苏糖醇）：还原剂，保持限制性内切酶活性。
（2
）反应温度：一般条件下大多数是37℃、1h、Tag-DNA聚合酶I在65℃具有最大活性。
（3）样品质粒的纯度：在DNA样品中含有苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、Nacl等均有影响。
（4）模板DNA的浓度。
7、根据催化反应类型可将DNA操作酶分为
（1）限制性核酸内切酶：切开、切除或降解核酸分子的酶。
（2）DNA连接酶：将核酸分子连接起来的酶。
（3）DNA聚合酶：复制核酸分子的酶。
（4）修饰酶：去除或添加化学基团的酶。
（5）拓扑异构酶：向共价环状DNA中引入或消除超螺旋。
8、导致酶的星号活性的条件有：
（1）盐离子浓度过低：＜5%
（2）PH过高：＞8.0
（3）甘油浓度过高：＞5%
（4）酶浓度过高：＞1/10
9、大肠杆菌感受态细胞的制备原理
细菌处于0℃CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物，粘附于细菌的表面，经42℃短时间处理2min促进细胞吸收DNA复合物，将细胞放置于非选择性培养集中，保温一段时间，促进在转化过程中获得的新的表现性得以表达，以免在后续选择培养基上由于不能及时的合成新的表现性而导致转化后的细菌不能进行正常的生命活动，最后将细菌培养物涂在含有相应抗生素的选择培养基上，对细菌培养物进行抗性筛选，以获得重组细菌。
10、感受态细胞制备过程中注意事项
（1）感受态细胞的制备应该严格无菌操作，慎防杂菌污染。实验中凡涉及溶液的移取、分装等需要敞开试验器具的操作均应在无菌台中进行操作。
（2）细胞最好置于-70℃或-20℃甘油保存的菌种直接用于制备感受态细胞的菌液。操作过程中也要保持在低温状态以使操作过程中待制备细胞处于正常状态。
（3）离心前制备菌液OD在0.3-0.4之间。
（4）倾倒离心管中的LB培养基时要温柔，倒扣时要保证离心管壁没有水珠，菌块要保证不滑落。
（5）加入CaCl2之后要保持低温，且要高纯度以免掺杂。
（6）加入CaCl2后所有操作都应该在冰上操作。
11、Ca2+在制作感受态细胞时的作用
（1）Ca2+能细菌细胞壁的结构，使细胞壁和细胞膜之间的蛋白质发生缺失，形成残壁的细胞利于转化。
（2）0.1mol/L的CaCl2属于低渗溶液，可以改变细胞的形状，从而使细菌细胞膨胀成球形。
（3）CaCl2能与外源DNA之间形成羟基-钙磷酸复合物，使其粘附在细菌细胞表面。
12、质粒DNA转化大肠杆菌提高转化率的方法
（1）整个操作过程要在无菌条件下进行，防止杂菌污染。
（2）大肠杆菌细胞要始终置于冰盒中操作，热激后也要放入冰盒进行冰浴。
（3）大肠杆菌感受态细胞从-80
℃冰箱中取出要注意，置于冰中溶解降温。
（4）转化率的高低同感受态细胞的浓度呈正比。
（5）感受态细胞的生长状态要在对数生长期OD600=0.3-0.4
（6）质粒的浓度在一定范围内同转化率呈正比，质粒浓度达到其与大肠杆菌形成羟基-钙磷酸复合物达到临界时反应有下降趋势。
（7）质粒加入的体积要小于总反应体积的1/10，以提高转化率。
（8）质粒加入量一般为100ng pUC19/200μL细胞。
13、α-互补原理、lacz’基因的插入失活鉴别原理
Lacz’基因编码β-半乳糖甘酶，基因前146个氨基酸称为α-多肽，它能与部分缺失lacz’的基因的大肠杆菌突变株进行α-互补作用，产生出完整的β-半乳糖甘酶，该酶在诱导物IPTG存在下底物X-gal相互作用后，产生蓝色产物。
在pUC8质粒中lacz’基因和氨苄青霉素抗性基因，其中lacz’基因的插入失活来进行重组体的鉴别，pUC8质粒的大小要比pBR322质粒小，复制能力强。
14、PCR反应步骤
（1）94℃预变性5min：为使模板变性彻底以利于Tag-DNA聚合酶的结合。
（2）高温变性：（90℃-95℃高温，30s-1min）94℃双链模板DNA解链形成两条单链DNA。
（3）低温退火：（50℃-65℃，30s-1min）退火温度是受设计引物的Tm值决定的，一般选择退火温度相差1-5度内，部分引物与模版单链DNA的特定互补部分相配对和结合。
（4）中温延伸：（72℃-74℃，30s-1min）72℃以目的基因为模版，合成互补的新DNA链。
（5）重复20-30次（2）-（4）的循环，n次后，产生2n个片段。
（6）72℃后延伸8min：为使PCR反应延伸更彻底。
（7）产物的可视化：用琼脂糖凝胶电泳。
15、PCR基因扩增实验注意事项
（1）引物浓度要是适当，否则会影响反应特异性
（2）Tag酶最适72℃0.5-5U/uL
（3）反应体系的加入量要适当，反应过程中温度和时间适中
（4）使用后移液管量程要调到最大
16、在0.2ml离心管内配制25μlPCR反应体系包括
（1）ddH2O、去离子水、蒸后去离子水、双蒸馏水：17μL
（2）10×PCR缓冲液（Mg2+）：2.5μl
（3）2.5mmol/LdNTP：2.2μl
（4）人工合成的两个寡聚核苷酸引物：各1.0μl
（5）DNA模版：1.0μl
（6）TagDNA聚合酶：0.3μl
17、PCR反应引物设计原则
（1）引物的GC%为45%-55%。
（2）引物的长度为15-30dp：引物设计过短会产生非特异性的结合，过长容易结合引物和模版难结合。
（3）碱基尽可能随机分布，尽量避免数个嘌呤和数个嘧啶的连续排列。
（4）引物自身要避免二级结构的出现。
（5）两个引物之间不应有互补性，且Tm值要相等或相近。
（6）3’端最后碱基为T最好，以使模版与引物结合更好，尽量不用A。
（7）要有合适的酶切位点。
18、影响PCR反应因素
（1）PCR缓冲液：①500mmol/LKCl：利于引物退火②100mmol/LTrisHCl：双极性粒子缓冲液PH8.0，DNA聚合酶在偏碱性条件下处于最高活性的状态③15mmol/LMgCl2直接影响酶活性，产物特异性，PCR产率④0.1%明胶：保持酶活性。
（2）dNTP20-200μmol/L（浓度适宜）：一定范围内dNTP浓度的增加会加速反应速率，但浓度过高会降低PCR反应的特异性。
（3）引物：①引物长度15-30bp②引物中GC%在40-60%③浓度0.1-0.5μmol/L④要有适当酶切位点⑥两条引物不应形成二聚体。
（4）DNA聚合酶，Tag-DNA聚合酶0.5-5U/100μL：①酶浓度过高会出现非特异扩增②酶浓度过低会降低反应速度。
（5）模板DNA：只要不含SDS等杂质，100μg/100μL即可满足所需。
（6）其他影响因素：①退火温度：受引物Tm影响②Mg2+浓度：直接影响酶活性③PCR反应的循环次数：2n。
19、琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷。因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型，具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不同，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系，凝胶电泳，不仅可以分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。琼脂糖凝胶范围100bp-60Kb。
20、琼脂糖凝胶电泳检测DNA使用的三种电极缓冲液的组成及区别
（1）TAE：Tris，乙酸，EDTA：缓冲能力弱，缓冲液需要经常更换
（2）TBE：Tris，硼酸，EDTA：缓冲能力强，缓冲液不用经常更换
（3）TPE：Tris，磷酸，EDTA：缓冲能力强，再回收时容易产生杂质
21、高压灭菌锅使用注意事项
（1）使用前检查锅内的水是否充足
（2）使用前设定好灭菌的温度，压力和时间
（3）打开和关闭灭菌锅时应注意同时旋转对称的螺旋
（4）至少待灭菌物稍微冷却后方可取出
22、超净工作台使用注意事项
（1）确保使用状态时紫外灯必须关闭
（2）保持清洁，用酒精擦拭台面和双手
（3）不要使用酒精棉擦拭有机玻璃挡板
23、高速冷冻离心机使用时要注意事项
（1）事先预冷，并调节好温度，转速等
（2）使用前离心管必须配平，
（3）使用后要关闭电源，擦拭干净离心机内部的水珠
24、移液器用于微量液体的移取，使用时要注意
（1）
使用前要看请楚量程，并在量程范围内使用
（2）使用时要缓慢用力
（3）切记避免有机溶剂腐蚀将杆
（4）使用后调整至最大量程
25、凝胶电泳装置的使用的注意事项
（1）使用前要注意电泳的方向与电泳槽的正负极是否吻合，设定拟使用的电压，电流等
（2）使用时要戴PE手套，并注意不要产生大量的污染物
26、紫外灯透视仪及凝胶成像系统使用的注意事项
①不要造成EB污染
②使用时先开电源再开紫外，关闭时相反
③使用后将凝胶及时拿走放回收处，并使仪器内部保持洁净
27、烘箱使用的注意事项
①防止器皿水分过多，造成短路
②塑料等器皿切记不要高温烘烤
③玻璃器皿等高温烘烤后要注意及时断电，千万不能过夜
28、常见有害物质
（1）苯酚，氯仿，异戊醇：蛋白质变性，溶液分层，用于DNA的纯化
（2）EB：电泳时DNA条带可视化
（3）CTAB：基因组的分离提取，植物DNA或RNA的提取
（4）DEPC（焦乙酸二乙酯）：RNA酶抑制剂，用于RNA提取时对塑料上RNase的处理
（5）放射性元素，32P，35S等：分子杂交时标记探针
29、pUC19质粒优点：
（1）质粒大小2.69Kb，易于转化
（2）存在编码α-多肽的前146个氨基酸lacZ'基因
（3）具有MCS多克隆位点，以利于酶切，以及目的基因的插入
（4）具有AmPr抗性基因，以助于重组体的鉴定
（5）存在Ori，能够自主复制
（6）高拷贝能达到500-700个Copy，利于目的产物的表达。
实验设计
1、质粒DNA转化大肠杆菌实验流程：
（1）取200μl新鲜配制的感受态细胞加入DNA2μl，混匀，冰上放置30min,本实验用pμC19同时做两个对照管：
①受体菌对照：200μl感受态细胞+2μl无菌水；
②质粒对照：200μl，0.1mol/LCaCl2溶液 +2μl质粒DNA。
（2）将管放于42℃循环水浴90s。
（3）冰浴2min后，每管加入800μl的LB液体液体培养基，培养45-60min。
（4）4μl的IPTG 和40μl的X-gal混匀：8μl IPTG .80μlX-gal。
（5）用无菌枪头将混合液移至含有Ampr（50μg/ml）的培养皿中，再用无菌三角头玻璃涂布棒，将菌液均匀涂满整个平板表面。
（6）将适当体积（100μl）转化的感受态细胞涂在含有Amp（50μg/ml）培养皿中。
（7）倒置平皿37℃培养12-16h，出现菌落，记录数据。
2、大肠杆菌质粒DNA的提取
（1）将2ml含有相应抗生素（Ampr50μg/ml）的LB液体培养基加入到试管中，接种含有目的基因质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
（2）取1.5ml培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心20min。吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。
（3）细菌沉淀悬浮于100μl溶液Ⅰ中充分混匀室
温放置10min。
（4）加200μl现配制的溶液Ⅱ，盖紧管皿，混匀内容物，为了尽量防止DNA变性，将离心管放置冰上5min。
（5）加150μl溶液Ⅲ（冰上预冷）盖紧管皿，颠倒数次使混匀，冰上放置15min。
（6）12000rpm离心15min,将上清液转至另一离心管中。
（7）向上清中加入等体积氯仿/异戊醇，反复混匀，12000rpm离心5min将上清转移出另一离心管。
（8）向上请中加入冰浴好的2倍体积无水乙醇和等体积NaAC，混匀后，-20℃放置15-20min,12000rpm离心5min,弃去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上吸干。
（9）用1ml70%乙醇洗涤这里DNA沉淀，振荡并离心，弃上清，真空抽干或空气中干燥。
（10）加20μlTE缓冲液，其中含有20μg/ml的胰RNA酶37℃水浴保存30min，使DNA完全溶解，-20℃保存。
3、大肠杆菌感受态细胞的制备流程：
（1）用划线法将大肠杆菌DH5α接种于无抗性固体培养基上，于37℃倒置培养1-2d。
（2）从菌板上挑取一个单菌落至2mL液体培养基中，37℃振荡培养过夜.
（3）取0.25mL菌液转到一个装有25mLLB液体培养基的锥形瓶中，37℃振荡培养2-3h。
（4）将菌液转移至10mL离心管中，冰上放置10min。
（5）4℃离心10min，（4000rpm）回收细胞，弃去上清。
（6）倒出上清将管倒置1min，（以内）以便培养液洗尽。
（7）用冰冷的2mL。0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞沉淀，立即放于冰上保温30min。
（8）4℃离心10min，(4000rpm)，回收细胞，弃去上清。
（9）用冰冷的0.1mol/L CaCl20.4mL，悬浮细胞（务必放在冰上）。
（10）分装细胞，200μl/份，加30μl无菌甘油混匀置-80℃冰箱中保存，此细胞即为感受态细胞。
4、琼脂糖凝胶电泳检测DNA
（1）制胶：称取0.8g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入80mL0.5X TBE缓冲液置微波炉或水浴加热至完全融化，待60℃加入核酸染料8μl,混合均匀。
（2）胶板的制备：①将制胶器（大板）放置于制胶槽中，并放好样品梳子②将冷却至60℃的琼脂糖凝胶液缓缓倒入大板中，直至形成一层均匀的胶面。（不要形成气泡）③待胶凝固后，取出梳子，将大板放在电泳槽内④加入缓冲液于电泳槽中（点样孔置于负极端）
（3）加样：用移液枪将2μl上样缓冲液和10μlPCR产物或质粒混匀，加入加样孔。
（4）电泳：①接通电泳槽与电泳仪电源，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm ②当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处停止电泳
（5）观察：将琼脂糖凝胶取出，放入紫外线透射仪中观察条带。