PCR步骤

PCR实验步骤

一、总RNA提取（此处以提取悬浮细胞RNA为例）

准备：提前预冷低温离心机

1.取出细胞，把细胞转移到离心管中，1000r，离心5min。

2.小心倒掉上清，加入1ml trizol，吹打均匀至液体澄清且无细胞团块后，室温静止5min，然后把所有液体转移到1.5mlEP管中。

3.每1ml trizol加入0.2ml氯仿，向EP管加入氯仿，盖紧盖子，剧烈上下摇晃10s后，室温静止2min。

4.放入已预冷的离心机，4℃，12000rmp，离心10min。

5.离心后液体会分成三层，将上层水层转移到另一个1.5mlEP管中（约450ul），加入0.5ml异丙醇，混匀，静止10min。然后4℃，12000rmp，离心10min。

水层（含RNA）

蛋白质

有机层

6.小心倒掉液体，加入1ml预冷的75%乙醇，轻轻摇晃。然后4℃，12000rmp，离心10min。

7.用枪头尽可能除去液体，超净台内静在置干燥，待白色沉淀变为半透明状，立即加入RNA free水。

8.放入-80℃冰箱保存。、

二、反转录

准备:预热水浴箱（37℃及85℃）、枪头、EP管必须是PCR专用的

1、桌面喷洒酒精，取出一个200ul PCR管，按以下比例配制反转录体系（冰上操作）：

H2O：2ul

RNA：6ul

Premix：2ul

总：10ul

2、将mix混匀，短暂离心，然后37℃水浴15min，85℃水浴10s。完毕后放到冰上待用。

三、PCR步骤

1、取出500ulEP管，分别依次加入：

H2O：7.7ul 23.1 ul

Primer F 0.4ul 1.2 ul

Primer R 0.4ul ×3 1.2 ul 混匀后，短暂离心。

EX Taq：10ul 30 ul

模板cDNA 1.5ul 4.5ul

总：20ul 60ul

2、将上述配得的两管mix分别分装到3个200ul PCR管中，19ul/管。

3、放入PCR机中进行扩增，

条件：

8、扩增，将上诉的PCR管放入PCR机中进行扩增，扩增程序为：94℃,2min→98→72℃,10min→4℃

重复N次

完毕后4℃保存或者取出放到冰上。

四、电泳

1、PCR扩增期间，可先行配胶(2%的胶)，配制比例为：

小胶(11孔)：0.6g琼脂糖+ 30ml 1×TEA +1ul EB替代染料

大胶（25 孔）：1.2g琼脂糖+ 60ml 1×TEA + 2ul EB替代染料把琼脂糖溶液放入微波炉加热至完全透明，待琼脂糖溶液冷却至温热时再加入EB替代染料，摇匀并倒入带有梳子的电泳板中冷却凝固。

2、凝固后的琼脂糖块放入电泳槽中，并倒入适量1×TEA溶液。

3、加样。

4、接上电源，电压150V，电流100I进行电泳。

5、紫外灯检测。