鸡胚成纤维细胞cDNA表达文库的构建

鸡胚成纤维细胞的制作及培养

鸡胚成纤维细胞培养 1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、 75%酒精擦拭手至肘部。 2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新 洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。用碘酒、酒精消毒蛋壳。用镊子打开气室。 4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。 5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先 置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。 7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的 胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。 8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器 消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。消化10－15分钟。一般约12分钟。视鸡胚日龄大小而定。越小消化时间越短。见组织松软即可。一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。 9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织 已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。 使细胞分散，脱落。然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。 10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培 养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。分装在细胞培养瓶中。视细胞多少而定加入培养基。 培养基为0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液. 11、将其置入co2细胞培养箱中，37度。瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易 生霉菌，每次换液时需要换新塞。培养24小时进行观察。一般在24－48小时可形成单层细胞。 传代 1. 倾倒培养瓶内旧培养液。 2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。 3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。 4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。 5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。 6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。

鸡胚原代细胞培养

鸡胚原代细胞培养 [实验材料] 9～10日龄鸡胚，Hank"s液50mL，0．5％水解乳蛋白液或MEM培养液20mL(内含犊牛血清1mL，双抗0．2mL，pH7．2)，O．25％胰蛋白酶5mL、7％NaHC031mL，手术剪，镊子，灭菌的培养皿，50mL三角瓶，滴管若干，链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用)，高压灭菌塞子若干，培养盘，蛋座，95％酒精，水浴锅。 [实验内容及操作程序] 1．配液制备细胞前先在Hnak"s液中加青、链霉素，使其含量为青霉素100IU/mL，链霉素100μg/mL，用7％NaHC03调整pH至7．2～7．4，将胰蛋白酶调整pH7．6(玫瑰红色)。置37℃水浴锅中预热备用。 2. 取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏，用Hank"s液(简称H液)洗去体表血液，移人灭菌三角瓶中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为约1mm3大小的碎块，加5mL H液轻摇，静止1～2min，使其组织块下沉。吸去上层悬液，依同法再洗2次，至上悬液不混浊为止，吸干H液留组织。

3．消化自水浴锅内取出预热的胰酶，按组织块量约3～5倍加入三角瓶中，1个鸡胚约需5mL胰酶，三角瓶上加塞，以免CO2挥发及污染。37℃水浴约20min 左右，每隔5min轻轻摇动1次，由于胰酶作用，使细胞与细胞之间的氨基和羧基游离，待液体变混而稍稠，此是再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时，则需中止消化，如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长，如果消化不够，则细胞不易分散。4．洗涤取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后，吸去胰酶液，用10mL Hank"s液反复轻洗3次，以洗去胰酶，吸干上清液，留组织块。 5．吹打加2mL含血清的0．5％水解乳蛋白营养液或：MEM培养液，以粗口吸管反复吹吸数次，使细胞分散，此时可见营养液混浊即为细胞悬液。静置1min，使未冲散的组织块下沉后，小心地将细胞悬液吸出1mL于20mL营养液中，此液细胞数约50万～70万/mL。如需大量细胞，可继续加营养液冲打，一个鸡胚约可做100mL细胞悬液。 6．细胞计数取上述细胞悬液0．5mL加入0．1％结晶紫一柠檬酸(0.1mol/L)溶液2mL，置室温或37℃温箱中5～10min，充分振动混合后，用毛细管吸取滴人血

cDNA文库构建原理以及技术路线

CDNA文库 1. CDNA文库中重组DNA片断得原始供体来源与细胞中表达出得mRNA,将某一特定类型细胞表达得mrna经反转录酶催化形成与之互补得CDNA，重组克隆后得到得CDNA文库有各自不同得适合范围。CDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组得表达状态以及表达基因得功能鉴定方面具有特殊得优势，从而使它在个体发育，细胞分化，细胞周期调控 2. CDNA文库得质量 （1）文库的代表性 CDNA文库的代表性是指文库中包含得重组CDNA分子是否能完整地反映出来原细胞中表达地全部信息（即mrna种类），它是体现文库质量地最重要标本。文库地库容量，它是指构建建出地原始CDNA文库中包含地独立地重组子克隆数。具备完全好代表性地CDNA文库需要满足地库容量取决与来源细胞中表达出地基因序列地总复杂程度。具体来就是来源细胞中表达出地mrna种类和每种MRNA序列地拷贝数 N=ln(1-p)/ln(1-n/t)，P为文库中包含细胞中任何一种mrna序列信息地概率，通常设为99％，N为文库中P概率出现细胞中任何一种mrna序列理论上应具有地最少重组克隆数，n为细胞中最稀少地mrna序列地拷贝数，t为细胞中表达出地所有mrna地总拷贝数，以人类细胞为列，人类基因组携带地遗传基因总数约为100000种，具体到某一特定类型地细胞中，表达出地基因种类仅为基因组全部基因地15％。因此对于巨大部分地人类细胞，每个细胞内具体表达地mrna种类约为15000种，全体mrna序列地总拷贝约为500000个，而细胞中稀少地mrna种类地拷贝数平均为8个。因此，用人类细胞来构建CDNA文库时候，要以99％概率保证文库中包含有细胞表达地任何一种mrna地序列信息，构建出地原始CDNA文库理论上应具有地最少独立克隆数为 N=ln(1_99%)/ln(1-8/500000)=2.9*10(5) 一个具有完好代表性地CDNA文库至少具有10（6）以上的库容量 3．MRNA是由5‘端非编码区，中间地编码序列和3’端非翻译区。非翻译区地序列特征对基因地表达具有重要地调控作用，其中编码产生地蛋白质产物都具有在结构上相对独立地结构域，存在与同一分子上地结构域对体现出蛋白产物在细胞中所行使地生物学功能。因此要从CDNA文库中分离获得目的基因完整地序列信息和功能信息，要求文库中地重组CDNA片断应尽可能完整获得目的基因结构 4．构建文库的载体系统 （1）入噬菌体载体系统是在CDNA文库构建中最早使用地载体系统，在载体本身地设计方面已经相当成熟，其主要优点是插入片断地装载容量大，适合与全长CDNA地克隆。重组子经专门地体外包装系统包装成有感染力地噬菌体颗粒，对宿主大肠杆菌地转染效率高，通常1ugCNDA构建出地CDNA文库，转染宿主菌后，都可以得到10（6）－10（7）以上地原始库容量，同时对重组克隆是否含有CDNA文库地插入片断地实际情况，有较好地质量控制指标，因此用这类载体地系统构建地CDNA文库质量高，代表性好，此外这类载体系统构建出地CDNA文库以重组噬菌体颗粒形式存在，这些重组噬菌体颗粒地感染活性在4度环境比较稳定，非常适合长期保存，但是可以采用地文库筛选方法很有限，文库中地CDNA 片断在宿主细胞无法功能性表达。 （2）质粒载体系统 可以功能性筛选：利用基因在体内体现其生物学活性所依据地生化基础，从文库中分离鉴定

鸡胚成纤维细胞培养doc

一、鸡胚成纤维细胞的体外培养 鸡胚成纤维细胞在病毒学研究中十分常用。孵化8－12d的鸡胚可用作培养的材料来源。 （一）实验材料 1. 鸡胚：孵化10d的受精蛋数个。孵化方法是将受精蛋放到38.5℃孵卵箱或恒温箱中，静置。每日翻动1—2次，以防止鸡胚粘连到蛋壳上影响发育。箱内湿度(40～70％)可通过在箱底放一盛水盘来维持。鸡胚的孵化期为2ld。孵化前，如遇蛋壳表面污物较多，可用刀片等器具刮除，不要用湿布擦拭，更不能用酒精棉球消毒或者用水洗蛋。孵育前可将受精蛋保存在10℃左右，保存期一般不超过10d。也有人将受精蛋保存在4℃冰箱中。 2. 消化液：含0.25％胰蛋白酶、青霉素100 1U／ml、链霉素100 μg/ml混合消化液。用Hanks 液或HEPES液配制。 3. 培养液：DMEM培养液，添加10％－20％的胎牛血清（FCS）、青霉素100 IU/ml、链霉素100 μg/mL。 4. 其它培养用品：手术器械、平皿、三角瓶或15ml血清瓶、离心管、100目不锈钢筛网、培养瓶或培养板、振荡水浴箱、离心机等。 （二）操作步骤 1)取孵化10d的鸡胚，分别用碘酒与酒精棉球擦拭消毒，晾干。用一已消毒金属器具将受 精蛋大头端击破，用镊子小心夹去破碎蛋壳，然后撕去气室外面的膜，暴露出尿囊绒膜及附着的血管。开口大小以受精蛋内容物不溢出为宜，但不宜太小。用镊子轻轻夹住鸡胚的颈部，小心取出鸡胚，放于无菌培养皿中，除去头部、四肢、内脏和皮肤。 2)胚体用Hanks液或生理盐水清洗3次，切成1－2 mm3的小块，然后转移到容积适中的 三角瓶或15ml血清瓶内。 3)加入适量消化液，一般每10个鸡胚加20 m1消化液，用胶塞密封瓶口。 4)在振荡水浴箱上37℃慢速搅拌5－10 min。加入少量血清钝化胰蛋白酶。然后通过100 目不锈钢筛网，制备细胞悬液，将细胞悬液转移到离心管中。 5)离心（800 rpm，10 min），弃上清液，将细胞沉淀用培养液洗2次。 6)加入培养液，用吸管吹打制成细胞悬液。用血球计数板计数细胞。 7)以0.2～1X06个细胞/ml的密度接种细胞。于37℃、5％CO2培养箱中培养。每2－3d换 液1次。待细胞汇合成片后，可行传代培养。 （三）结果 在倒置显微镜下观察，用8～12d龄鸡胚培养的细胞主要为具有长突起的梭形、星形或三角形的成纤维细胞。用I型和Ⅲ型胶原的抗体作免疫细胞化学分析，培养物以呈阳性反应的成纤维细胞为主。 （四）讨论 鸡胚成纤维细胞在普通培养液中具有生长优势，一般不需特殊处理，经几次传代后就可逐渐排除其它细胞，得到较纯的成纤维细胞。体外培养的胚胎细胞的形态与所取鸡胚的胚龄有关。若用体节前期的胚胎，培养的细胞不是典型的长的或星形的成纤维细胞，而为宽扁的细胞，这可能与胚胎细胞的分化状态有关。

细胞原代培养细胞生物学实验报告

细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理

细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤

简述cDNA文库构建的方法

简述cDNＡ文库构建的方法 1．１ mＲNA纯化 构建一个cＤNＡ文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mＲＮA。ｍRNA仅占细胞总RNＡ的1%～5％,因而需要另外的纯化技术来富集ｍＲNA。从细胞总RＮA中分离mRＮＡ是根据实际上所有真核细胞mＲNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷，这个序列被称为ｐolｙ(A)尾巴，是mRNＡ分子特有的而其他主要RNA 没有，pｏly(Ａ)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸(oligo(ｄT)）杂交。正是这种特性使得mRＮA从ＲNＡ分子的混合物中分离出来。 方法有三种： ·寡脱氧胸苷酸亲和层析:即分离mRＮA的标准方法，将一个寡脱氧胸苷酸（12~１8碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总ＲNA混合物上样后,mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。非pｏlｙ(A)ＲNA不结合并很容易从柱子洗去。用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA很快洗脱出来。 ·溶液杂交:本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱,而是将基质直接加到总ＲNA溶液中。退火和洗涤步骤通过离心含有ＲＮA沉淀的基质在溶液中完成。 ·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠:本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总ＲNA退火,然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠,用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA复全体。移去磁分离器，加入洗脱缓冲液,并重复磁性分离步骤。在无盐的状态下,寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。 １.2ｃＤＮA的合成与克隆 1.2.1 cＤNA第一条链的合成 所有合成cＤNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应，有两个关键的因素，一个是ｍＲNA模板,另一个反转录酶。 目前商业化的反转录酶主要有两种:一种是禽源反转录酶（reｖeｒse tranｓcripｔａse)，另一种是鼠源反转录酶。两种酶都无3’-5’外切酶活性，但禽源反转录酶有很强的RNAase H酶活性,鼠源的具有相对较弱的RNＡａｓeH酶活性。RＮAasｅ H酶活性在反应中起负作用,可降解mRＮA分子末端的polｙ(Ａ)序列和cDNA-ＲNA杂交分子中的RＮA。因此一般反转录过程都是采用鼠源反转录酶。ＧIBCO-BＲL公司出品一种鼠源反转录酶，称为SUPERＳCRIPT反转录酶,缺少C-末端18０个氨基酸,完全去除了其 ＲNAａｓe H酶活性，保持完整的DＮＡ聚合酶活性。 1.2．２ cDNA第二条链的合成 合成cDNA第二条链的传统方法是“自身引导法”,即将第一条链合成过种中形成的cDNA/ＲNＡ杂交分子变性,降解RNA，则单链cＤＮA分子的3’末端自身环化,形成发卡结构。以此为引物,在DNA聚合酶作用下合成第二条链。所得到的产物是双链ｃDNA，在其相当于ｍRＮA５’端的地方有一发卡闭环结构。然后用单链特异性的SI核酸酶消化该环,得到可供克隆的双链cDＮA分子。由于SI酶的消化反应难以控制，不可避免地导致对应于mＲNＡ5’的序列出现缺失和重排,并造成克隆效率偏低,故该法基本上己被一些改进的方法所代替。主要的改进之处是在合成第一条链的反应体系中加入4ｍmol/L的焦磷酸钠,以抑制发卡结构的形成,这样便避免了使用SI 核酸酶。然后再用其他方法合成第二条链的引物。 1.2．3 cDNA的克隆 dscDNA（双链cDNA)合成后，将此ＤＮA与载体(质粒或噬菌体)组成重组分子,然后转化到受体菌中进行扩增。cDNA文库可用质粒载体或噬菌体载体构建。质粒文库

鸡胚成纤维细胞的制备

鸡胚成纤维细胞的制备 一、材料和试剂 1、鸡胚：9-10日龄发育良好的SPF胚 2、试剂：0.25％胰酶，MEM培养基，新生牛血清，1万IU双抗，3%谷氨酰胺，7.5%碳酸氢钠 3、仪器和器材：，带6-8层纱布的100ml烧杯两个，直径9cm的平皿两个，中号镊子四把，倒置显微镜，培养箱，50ml细胞培养瓶，10ml刻度吸管两根、5ml刻度吸管，250ml生理盐水瓶两个，无菌的细胞培养瓶，灭菌好的PBS，酒精棉球，废液缸等 二、操作步骤 1、操作前的准备： ○1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 ○2用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 ○3正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 ○4点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 ○5准备好将要使用的消毒后的培养瓶。 ○6取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 2、成纤维细胞制备： ①将选好的9-10日龄的发育良好的SPF胚用5%的碘棉消毒蛋壳气室部位，再用酒精棉脱碘。 ②无菌取出鸡胚，放入灭菌的玻璃皿内，用PH7.2的PBS冲洗一次，去头，四肢和内脏。 ③再用PH7.2的PBS冲洗两次。 ④用镊子捏成小块（2-3mm3）, 用PH7.2的PBS冲洗两次。 ⑤鸡胚约加4ml0.25%胰酶溶液，38℃消化30min，期间15min轻摇一次。 ⑥期间配制细胞培养液： 培养基：MEM 双抗：2% 7.5% 碳酸氢钠：2% 牛血清：6% 3% 谷氨酰胺：1% ⑦消化结束，弃掉胰酶消化液，用PH7.2的PBS冲洗两次，再用细胞生长液冲洗一次。 ⑧加入适量的细胞生长液，用刻度吸管反复吹打（使细胞充分分散）。 ⑨将细胞分散液倒入带6-8层纱布的100ml烧杯中（过滤之前先用少许细胞培养液润湿纱布），加入适量培养液（40ml/胚），过滤。 ⑩重复步骤⑨的操作重虑一遍。 11计数，要求每1ml滤液中约含活细胞100万-150万个。 ○ 12分装置个培养瓶中（7-8ml/瓶），置37℃培养箱培养。 ○

cDNA文库的构建方法与原理

c D N A文库的构建方法与原理 蛋白质是细胞的功能分子：它们构成结构和调控分子，动力和泵蛋白，酶和受体。然而，如果仅用传统的生化方法确定某一特异蛋白的全序列，或制备足够量的蛋白进行操作和鉴定都是使人厌烦且昂贵的步骤。基因克隆和遗传工程对生化领域有很大贡献。如果只限于将基因组DNA作为材料来源，由于其中仅2%被认为可能编码蛋白质，那么确定蛋白质序列仍然是令人生畏的工作。其他部分包括结构和调节因子、内含子、非编译外显子和重复及功能未知的非编码序列。如果分析仅局限在编码序列，那么确定基因产物序列所需的努力就会大大的降低。因此分子生物学主要原则之一是mRNA作为蛋白质合成的模板，所以mRNA是确定蛋白质序列的理想底物。不幸的是，现有通用的克隆载体没有一个能容纳mRNA分子作为插入片段。因此，产生表达序列文库的一个基本步骤是将mRNA分子转变成双链DNA。来自mRNA分子的DNA拷贝称cDNA，由来自细胞或组织mRNA种类的DNA拷贝组成的文库称为cDNA文库。 1．基本原理 cDNA（Complementary DNA）是以mRNA为模板，在反转录酶作用下合成的互补DNA，它的顺序可代表mRNA序列。cDNA文库的构建是指将cDNA与克隆载体DNA体外重组，然后去转化克隆载体DNA 的宿主细胞，从而得到一群含重组DNA的细菌或噬菌体克隆的过程。这些序列来自并代表一定组织或细胞类型特定发育或分化阶段的整个mRNA群体。其过程可概括为：（1）通过反转录酶将各种mRNA转变在cDNA；（2）cDNA与合适的载体重组并导入到宿主中。 cDNA基因文库具有许多优点和特殊用途： 首先，cDNA克隆以mRNA为起始材料，这对于有些RNA病毒来说非常适用，因为它们的增殖并不经过DNA中间体，研究这样的生物有机体，cDNA克隆是唯一可行的方法。 第二，cDNA基因文库的筛选简单易行，恰当选择mRNA的来源，使所构建的cDNA基因文库中，某一特定序列的克隆达到很高的比例，简化了筛选特定基因序列克隆的工作量。 第三，每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，在选择中出现假阳性几率比较低，从阳性杂交信号选择出来的阳性克隆一般含有目的基因序列。 第四，cDNA克隆的另一用途是用于基因序列的测定，读码框（ORF）的界定，只有通过对mRNA5’核苷酸序列才能获得。 2．基本方法 2．1 mRNA纯化 构建一个cDNA文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mRNA。mRNA仅占细胞总RNA的1%～5%，因而需要另外的纯化技术来富集mRNA。从细胞总RNA中分离mRNA是根据实际上所有真核细胞mRNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷，这个序列被称为poly(A)尾巴，是mRNA分子特有的而其他主要RNA没有，poly(A)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸（oligo(dT)）杂交。正是这种特性使得mRNA从RNA分子的混合物中分离出来。方法有三种： ·寡脱氧胸苷酸亲和层析：即分离mRNA的标准方法，将一个寡脱氧胸苷酸（12~18碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总RNA混合物上样后，mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。非poly(A)RNA不结合并很容易从柱子洗去。用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA很快洗脱出来。 ·溶液杂交：本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱，而是将基质直接加到总RNA溶液中。退火和洗涤步骤通过离心含有RNA沉淀的基质在溶液中完成。 ·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠：本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总RNA退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA复全体。移去磁分离器，加入洗脱缓冲液，并重复磁性分离步骤。在无盐的状态下，寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。 2.2 cDNA的合成与克隆

鸡胚成纤维细胞的制作及培养

鸡胚成纤维细胞的制作及培养 鸡胚成纤维细胞培养 1、准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、 75%酒精擦拭手至肘部。 2、布局:点燃酒精灯，安装吸管帽。 3、选胚:取9-10日龄鸡胚，(注:鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低)用新 洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。用碘酒、酒精消毒蛋壳。用镊子打开气室。 4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。 5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污;如怀疑组织可能污染，可先 置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 6、剪切:用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。 7、处理组织:将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的 胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml(组织消化液以及胰酶的配置见微 生物指导)结扎瓶口或塞以胶塞。 8、消化:将其置入37?水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器 消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。消化10,15分钟。一般约12

分钟。视鸡胚日龄大小而定。越小消化时间越短。见组织松软即可。一般不可消化时间 太长否则容易导致细胞活力不足。 9、分离:在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织 已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5,的含5,犊牛血清双抗的的水 解乳蛋白Hank，s液少许。(制法见微生物试验实习指导)，用力震摇，或用吸管吹打。 使细胞分散，脱落。然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的 组织块。低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟，吸出上清(可以不离心吸掉上清)， 加入适量含有血清的培养液。 10、计数:用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培 养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄， 说明液体变酸，可用NaHCO调整。分装在细胞培养瓶中。视细胞多少而定加入培养基。3 培养基为0.5,的含5,犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液. 11、将其置入co2细胞培养箱中，37度。瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。培养24小时进行观察。一般在24,48小时可形成单

鸡成纤维细胞传代培养

辽宁农业职业技术学院毕业论文 系别：生物技术系 专业名称：兽药生产与营销 论文题目：鸡胚成纤维细胞传代 学生姓名：郐永琳 指导教师：裴春生 评阅人： 成绩： 二O一O年六月二十日

评阅人评语： 评阅人签字： 年月日

目录 摘要 (1) 关键词 (1) 前言 (1) 1材料 (1) 1.1仪器 (1) 1.2种蛋 (1) 1.3犊牛血清 (1) 1.4溶液 (1) 2方法 (2) 2.1鸡胚的选择与孵化 (2) 2.2鸡胚原代细胞制备 (2) 2.3细胞传代 (4) 3结果与分析 (4) 4讨论 (4) 4.1温度 (4) 4.2P H (5) 4.3气体 (5) 4.4细胞接种量 (5) 4.5无菌条件 (5) 5结论 (5) 参考文献 (6) 致谢 (6)

鸡胚成纤维细胞传代 摘要：采用10日龄SPF鸡胚，进行消化，制备原代细胞，当细胞长成良好单层时，按1:2比例进行细胞传代，找出鸡胚细胞传代方法和情况。其结果是：按本实验室方法进行鸡胚传代，传至20代以上细胞形态没有发成变化，细胞生长良好。细胞数量大大增加。为病毒的研究和疫苗生产提供条件。 关键词：鸡胚；传代；生长特性 前言 细胞培养的方法是将机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。细胞在培养瓶长成致密单成后，已基本饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须传代（再培养）。也是将细胞保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种操作的必经过程，在这个过程中可以掌握其操作过程又能观察到细胞的生长情况。 1 材料 1.1 仪器 培养箱、培养瓶、玻璃漏斗、吸管、移液管、纱布、水浴锅、手术剪、镊子、培养皿、烧杯、瓶塞、培养盘、蛋托、超净工作台、显微镜、三角烧杯、95%酒精、75%酒精棉、碘酒棉、废液缸等。 1.2 种蛋 SPF种蛋，由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供。 1.3 犊牛血清 多用胎牛或犊牛血清。由颈动脉无菌放血。采血前先向瓶内加些等渗盐溶液湿润瓶避，采血后置室温或37℃温箱内待血液完全凝固后，有灭菌玻棒将血块自瓶壁分离。随后再置室温或4℃冰箱内一天，即可吸取血清，如有少量红细胞可离心沉淀除去。经滤过除菌分装，置-20℃冻存，使用前56℃水浴中灭活30min。 1.4 溶液 1.4.1 Hank，s液NaCl16g、Na2HPO40.304g、KCl 0.8g、KH2PO40.12g、MgSO40.4g、C6H12O6 2g、CaCl20.28g、酚红2mL、水解乳蛋白10g、加蒸馏水至2000mL高压灭菌116℃30min。 1.4.2 酚红苯酚红1g、NaOH0.12g加蒸馏水至200mL。

cDNA文库构建的具体步骤及详细说明

cDNA文库构建的具体步骤及详细说明 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。 其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。（2）cDNA第一条链的合成。（3）cDNA第二条链的合成。（4）双链cDNA的修饰。（5）双链cDNA的分子克隆。（6）cDNA文库的扩增。（7）cDNA文库鉴定评价。 一、Superscipt II—RT合成第一链 1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul) (5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water （大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。）。

2. 混匀后，70℃反应10分钟。 3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。 4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂： （1）4 ul 5×first strand buffer （2）2 ul 0.1 M DTT （3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制) 5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。 6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。 7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。 二、cDNA第二链的合成

细胞实验原代培养

细胞生物学实验 原代培养 一、实验目的 1.理解细胞原代培养原理 2.了解细胞原代培养的一般方法与步骤 3.了解细胞原代培养的应用 4.独立进行细胞原代培养操作 5. 熟悉无菌操作技术 二、实验原理 细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。 原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞 刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生 物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养: 组织直接从机体获取后, 通过组织块长出单层细胞, 或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养, 在首次传代前的培养可认为是原代培养。 原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA处理，使之分散成单个细胞，加入适量培养基 置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖

的过程。 三、实验步骤 鸡胚成纤维细胞的原代培养 （1）入无菌室之前首先穿实验服，佩戴一次性手套、帽子。要用肥皂洗手, 用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。 （2）关闭已照射超净台台面20 分钟左右的紫外灯，打开抽风机清洁空气。打开照明灯。 （3）超净台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，并擦拭超净台台面。 （4）准备好所需试剂及仪器，摆放在超净台中。 （5）按照1%的比例向含10%FCS勺DMEM培养基中加入双抗（本次试验的培养基约为80ml，故加入800卩I的双抗） （6）取鸡胚蛋一枚放入超净工作台中，用酒精棉球擦拭鸡蛋壳后，用镊子在鸡蛋气室位置（大头处）敲一个小口，然后用镊子小心去除气室部分的蛋壳。 （7）换用洁净的无菌镊子揭开膜，再用洁净的无菌弯头镊子取出鸡胚至灭菌的培养皿中，并用D-hanks 液冲洗鸡胚，重复三次。 （8）用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢及内脏，用D-hanks 液充分洗涤躯干部分三次。 9）将洗涤过的躯干移至干净的培养皿，吸去多余的液体，然后用眼科剪将躯干充分剪碎，剪碎速度要快。

cDNA文库构建简易流程

1、紫茎泽兰第一链cDNA的合成 取2 u1提取的紫茎泽兰mRNA，加入适量的CDSIII primer和SMART IV Oligo寡 核苷酸以及其它相应试剂，在适当的条件下，经反转录酶进行反转录合成紫茎泽兰第一链cDNA. 2、LD-PCR合成紫茎泽兰第二链cDNA 取合成的紫茎泽兰第一链cDNA加入其它试剂，通过LD-PCR进行双链cDNA的合成3、紫茎泽兰双链cDNA的酶切及分离纯化 双链cDNA经蛋白酶K消化去除DNA聚合酶活性，经氯仿:异戊醇抽提，酒精沉淀后，用限制性内切酶sfi I进行酶切消化。酶切后，过CHROMA SPIN-400柱进行分级分离纯化，以去除小的片段和杂质，依次收集16管，经1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测后，收集cDNA 含量最高的几管。 4、双链cDNA片段的克隆和体外包装 分级分离纯化的双链cDNA，定向克隆到试剂盒提供的经sfi I酶切的去磷酸化的入λTripIEx2载体上，在载体量不变的前提下，设定了3个连接梯度反应，连接结束后，3个连接产物分别用Promega公司的Packagene Lambda DNA受Packaging System包装，体外包装条件按试剂盒说明进行。 5、文库的滴定与重组率检测 用常规方法检查文库的滴度。3个连接反应包装后，分别取1ul用1X Lambda dilution buffer按1:10稀释，稀释后的入噬菌体裂解物再分别取0. 5ul 加入到150ul预先过夜培养的XL1-BLue菌液，在37 C进行20min的吸附后，再加入到1. 5m1熔化的LB/MgSO4顶层软琼脂，迅速混匀倒到预热至37℃的平板上，快速摇动平板使顶层软琼脂分布均匀，顶层软琼脂凝固后在37℃培养箱中倒置培养，每相隔一段时间后，检查噬菌斑生长情况。根据长成的噬菌斑的数目进行文库的滴度计算，公式如下 : 文库的重组率则利用蓝白斑互选进行，在每1. 5m1的顶层琼脂加入50ul X-gal (20mg/ml) , 50ul IPTG (200mg/Ml)，待噬菌斑长成后，统计蓝白斑的数量，算出重组率。 6、cDNA的PCR快速鉴定 从平皿中直接挑取噬菌斑，用5' PCR primer和3' PCR primer分别进行PCR扩增检查插入片段的长度。 初步结果：按l : 10的比例稀释后滴定，过夜后统计噬菌斑数目并计算滴度。1号和2号连接反应的噬菌斑很少，滴度很低，而3号连接反应的滴度为2.47X106pfu/ml, 滴度很高，符合建库标准。所以3号连接反应的cDNA与载体的比例最理想，连接效率最高。 紫茎泽兰cDNA的PCR快速鉴定，随机挑取10个透明噬菌斑，PCR扩增均有大于500bp的插入片段，进一步说明已成功获得了紫茎泽兰cDNA重组噬菌体。

构建cDNA文库应注意的事项

构建全长cDNA文库时应当注意事项 构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。但都应当注意以下四个方面： 一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA。 构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。 二、反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。 这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转；二是只有少部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处，而很大一部分mRNA没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术（可参考其GeneRacer说明书）从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法，但对mRNA的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A结构的全长mRNA且反转录完全，才能进入文库中。反转录完成后点样检测cDNA的浓度及分子量分布是很重要的。

鸡胚成纤维细胞的原代培养

鸡胚成纤维细胞的原代培养 171850044 生拔钱诗晨 一、背景知识 1.1原代培养与传代培养 1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。 1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养 注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数 1.2细胞体外培养要求的条件 ?无菌 ?适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右 ?生理渗透压 ?适宜酸碱度：7.2-7.4 ?气体：95%空气+5%二氧化碳 ?培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型 悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。而呈现悬浮生长的细胞。 贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。又称黏附依赖型细胞（分如下四类） ?成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射 状。 ?上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。 ?游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规 则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。 ?多形型：是一些形态上不规则的细胞。细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多 边形，胞突呈细长丝状。如神经元和神经胶质细胞 1.4原代细胞培养的一般办法 1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法 1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法 注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。 二、实验目的 ●了解体外培养的原理及原代细胞培养的基本方法 ●掌握无菌操作的一般技术

细胞实验原代培养

细胞实验原代培养 IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】

细胞生物学实验 原代培养 一、实验目的 1.理解细胞原代培养原理 2.了解细胞原代培养的一般方法与步骤 3.了解细胞原代培养的应用 4.独立进行细胞原代培养操作 5.熟悉无菌操作技术 二、实验原理 细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。 原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养:组织直接从机体获取后,通过组织块长出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。 原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞,加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。 三、实验步骤

鸡胚成纤维细胞的原代培养 （1）入无菌室之前首先穿实验服，佩戴一次性手套、帽子。要用肥皂洗手,用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。 （2）关闭已照射超净台台面20分钟左右的紫外灯，打开抽风机清洁空气。打开照明灯。 （3）超净台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，并擦拭超净台台面。 （4）准备好所需试剂及仪器，摆放在超净台中。 （5）按照1%的比例向含10%FCS的DMEM培养基中加入双抗（本次试验的培养基约为80ml，故加入800μl的双抗） （6）取鸡胚蛋一枚放入超净工作台中，用酒精棉球擦拭鸡蛋壳后，用镊子在鸡蛋气室位置（大头处）敲一个小口，然后用镊子小心去除气室部分的蛋壳。 （7）换用洁净的无菌镊子揭开膜，再用洁净的无菌弯头镊子取出鸡胚至灭菌的培养皿中，并用D-hanks液冲洗鸡胚，重复三次。 （8）用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢及内脏，用D-hanks液充分洗涤躯干部分三次。（9）将洗涤过的躯干移至干净的培养皿，吸去多余的液体，然后用眼科剪将躯干充分剪碎，剪碎速度要快。 （10）向碎块中加入胎牛血清，用滴管将组织碎块接入培养瓶中，静置一分钟，待组织块微干与瓶壁贴牢后，加入5ml培养基置于培养箱中培养。将瓶子翻转倒置后在37度培养箱中放置2-3小时，再将瓶子翻转过来。 （11）将用过的试剂仪器等摆回原处，将超净台打扫干净，关闭照明灯及抽风机。（12）实验后数小时后去观察组织块中细胞迁移情况，并拍摄照片。 四、实验结果

cdna文库构建流程

cDNA文库组标准流程 一. Total RNA的提取 (2) 二. mRNA的分离 (5) 三．cDNA双链合成 (8) 四．载体制备 (11) 五. cDNA双链和载体的连接 (13) 六．电转化流程 (14) 七．快速鉴定、菌落PCR (16) 八．pBlueScript cDNA库扩增 (18)

一.Total RNA的提取 1.试剂配制 准备工作： 1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。 2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃20mins 高压灭菌。 3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。 4、常用试剂及其配方： ▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。 ▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5 三水合柠檬酸纳22.94g 加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。 ▲10%肌氨酸钠： 肌氨酸钠10g 加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。 ▲变性裂解液： 0.78M柠檬酸钠8.25ml 10%肌氨酸钠12.375ml 异硫氰酸胍118.05g 加DEPC水定容至250ml，室温放置备用 临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v） ▲2M 醋酸钠PH=4.5 NaAc·3H2O 13.6g 加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲3M醋酸钠PH=5 NaAc·3H2O 20.4g 加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用▲4M LiCL: LiCL 24.164g 加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用 ▲0.5M EDTA PH=8.0 EDTA 18.61g 用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温 放置备用 ▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):